全 文 ：热带 亚热带植物 学撤 2002。1 0(1)：83 98
Jou~ud Tr,qd~d m r 5ubtropicd Botany
乙烯生物合成途径及其相关基因工程的研究进展(综述)
陈新建 ¨ 刘国顺 陈占宽 郅玉宝 易明林 刘鸿先
[1河南农业大学农学系 蚵南 部州 450002 2．f 南 农业科学院 点实验室 ，fuJ南 郑州 450002；
3 中国科学 院华南植物研究所 。广东 广州 510650)
摘要 ：在对植物激素乙烯生理功能作简要 l旦】顾的基础上 着重对乙烯 的生物合 成途径中的关键 酶 ，包括腺苷
蛋氨酸台成酶 、ACC合成酶及 ACC氧化酶 的性 质和基因的研究进展作了综述 ，同时展现出 了与调控 内源
乙烯生物台戒有关的基因T程的整体轮廓 。
关键词 ：己烯：生物台成；基因T程
中图分类号：0946 885 7 文献标识码：A 文章编 号：1 005—3395(2002)0I一0083—16
A Review of the Pathway of Ethylene Biosynthesis and
the Relevant Genetic Engineering
CHEN Xin—j i an LIU Guo—shun。 CHEN Zhan—kuanz ZHI YuIba YI Ming-]in2 LIIJ Hong-xian3
t1 Dep1．A 榭忱h HemLt,4grieultuzd University,Zhengzhou 450002．China；2．Hemm Ke)。Ld) m。 of
c p I p ⋯ }Hemm 4eodem)of 4griIt*Oure SHem ．Zhengzhou 450002，China；3 South China
IlL~timte r Bo~~my．the Ch r¨ 川 ⋯ Guangzhou 510650．China)
Abstract： This review contents a brief retrospection of physiological functions of plant hormone，
ethylene The progresses concerned three important enzymes：S~dVIS，ACS and ACO in ethylene biosyn—
thetic pathway are highli曲ted The possible methods to control endogenous ethylene’s productionin
fruits or flowem by genetic engineering are outlined．
Key wor~ ：Ethylene；Biosynthesis；Genetic engineering
乙烯(c H )是五大类植物激素中结构最为简单的唯一的气态物质 它参与了从种子萌发到成
熟衰老的一系列生命过程的调节 (图 1)。由于乙烯与植物的花、果的成熟和衰老有密切关系 ，控制
乙烯的生物合成就可延缓其衰老，因而有重要的商业价值，如抑制乙烯的产生可使许多重要农产
品的运输和贮藏更为方便，同时也延 K了货架期，可以增值增效 。随着植物生理生化及分子生物学
研究的深人 ，近年来对乙烯的生物合成途径及其基蚓工程的研究取得了一系列令人鼓舞的成果，
使之成 为现代植物科学研究的热点之一
1 乙烯的生物合成途径
阐HJ]乙烯的生物合成途径不是一件容易的事 许多化台物都曾被作为前体物(precursor)提出，
如亚麻酸、丙醛、乙醇、丙烯酸、B一丙氨酸、B一羟基 、B一羟基酸、延胡索酸 、蛋氨酸等。真正的前体蛋氨
酸(methionine)首先是由 Lieberman和 Mapson于 1964年基于一个化学模式系统而提 出的 ，随后
他们 【叉证明 C．标记的蛋氯酸在苹果组织内转变成为 C标记 的乙烯 ，由此可以看到蛋氨酸的确
可作为高等植物体内乙烯生物合成的前体物。蛋氨酸的CH S基仍保存于体山，这对于维持体内蛋
收稿 日期：2000一I2-I5 接 受日期：2000—05—22
基金项 目：围家娴草专 卖局资助项 目
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B4 热带亚热带植物学报 第 1O卷
氨酸的水平是很重要的。因为与乙烯产生速率相
比较，正常情况下蛋氨酸含量是很低的。Adams和
Yang证明 j．蛋氨酸的硫被重新循环形成蛋氨酸 ，
以稳定 乙烯形成的速率 ，蛋氨酸的CH S基来源于
s-腺 苷 蛋 氨 酸 (S—adenosylmethionine~ SAM or
AdoMet)．存在 于 甲硫腺 苷 (methylthioadenosine，
MTA)中．然后迅速水解成为 甲基硫核糖 (methyl—
thiofiboseMTR)。 MTR中的 CH3S经循 环 回到
蛋氨酸中。Yung等 证明 MTR中的核糖部分与
CH，S基一起转变成为蛋氨酸。整个循环的结果是
乙烯分子源于蛋氨酸的 3，4位碳 ，CH S基在循环
中保持不变，而蛋氨酸中的氨基丁酸由ATP中的
核糖补充。因此最终形成 乙烯分子的两个碳原子
实际上来 自ATP核糖残基的第 4,5碳原子。此循
环称为蛋氨酸环 ，或称 Yang循环。
图 t乙烯的主要生理效应0I
Fig 1 Main physiological efects ofethylene
在乙烯生物合成途径中的一个重要的中间产物为 1一氨基 一1一羧基环丙烷(1-aminocyclopropane—
l-carboxylic acid，ACC)，是一种非蛋 白氨基酸。乙烯 由 ACC直接产生 ，其反应为：
ACC+O — — — C H4+CO2+HCN+2H O
这里乙烯来源于ACC的 C．2和 C一3，CO 来源于羧基。HCN(氢氰酸)由ACC的C—l和氨基组成。
HCN形成后会马上被代谢掉．它先形成 B一氰丙氨酸，p一氰丙氨酸继续代谢成为天冬氨酸或 r-谷氨酰
胺 ． 氰氨丙氨酸．从而清除了 HCN的毒害。因此即使在乙烯合成的高峰期也不会有 HCN的积累 。
ACC除了ⅡJ以形成乙烯外 ，还能被代谢成为丙二酰 ACC(I一(malonylamino】cyclopropane一1一carboxylic
acid,MACC)。据分析在生理条件下IVIACC难 逆转。但也有高水平的MACC(烟草)在淹水条件下可
以转变成为ACC的报道 ．MACC的形成对解除过多乙烯的毒害可能具有一定的作用。
在乙烯生物合成过程 中，有三个重要的酶已被鉴定和研究 ，这三个酶是 ：催化腺苷蛋氨酸形成
的腺苷蛋氨酸合成酶(SAM synthetase，SAMS，ATP：methionine s—adenosyltranstemse EC2．5．1．6)；催
化 SAM生成 ACC的ACC合成酶(ACC s}althase，ACS或ACCS，S—adenosyl-k methionineanethylthio。
adenosine．1yase，EC4．4．1．14)；ACC氧化酶 (ACC oxidas~ACO或 ACCO)又称 乙烯形成酶 (ethylene—
forming enzyme，EFE)．它催化 ACC形成 乙烯。
1．1 腺苷蛋氨酸合成酶(SAMS)
SAMS是植物体内物质代谢中一个重要的酶．催化 Met和ATP形成 SAM。SAM S除了参与乙
烯合成外．还参与了多胺的生物合成 (图2)及甲酯化反应 。尽管它是乙烯生物合成途径中的第一
个酶 ，但是人们刘它的认识却较晚，从 80年代末期人们才注意到这个酶，因此对 SAMS的研究远
没有 ACS和 ACO那样深入和广泛。SAMS是一个多基因家族_ ，其中一些基因是组成性表达，即
所谓管家(house．keep)基 因，而另一些基因的表达则受到了发育阶段或环境因素的严格控制 。
SAMS的 mRNA的水平在植物不同发育 阶段中 及不同的植物组织 中 有着显著的差异
同时在不同的环境 因素 中 ，SAM S的表达被提高 ，这些环境包括盐胁迫 真菌 和细菌的诱发剂
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第 l期 陈新建等 ：乙烯生物合成途径及其相关基因T程的研究进展 85
(elicitors)．臭氧处理及机械刺激 ，所有这些都是 已知的刺
激乙烯生成的因素 另外，植物激素也可以刺激 SAMS的
转录。如 GA，可以诱导麦胚 和矮生豌豆突变体的 SAMS
的转 录，ABA处理番茄可以诱导 两种 SAMS异构酶的产
生 。Gomez-Gomez17]从 豌豆 中分离 出了 SAMS的基 因
(SAMSI和 SAMS2基因)。这两个基因的编码区同源性很
高，但是在 5’和 3’的非编码区却有一定程度的变异。他们
用这 两个非 编码 区作 为 特异 的探针 ，来 研 究豌 豆 中
跗 ．MS1和 SAMS2基因的表达情况 。核酸酶保护分析披露
了它们不同的表达模式 ：sdMS1几乎在所有的组织 (尤其
在根 中)内都强烈表达 ．跗 MS2表达较 弱 ，即便在峰值时
⋯
也 很 弱 。 授 粉 后 SAMSI的 表 达 则 被 特 异 地 I：调 图2乙烯和多胺生物合成之间的关系
(up-regulated)，而 SAMS2是组成性地表达。用生长素处 Fig 2 The relationship between ethylene and
理未授粉 的子房 ，在子房 的发育阶段 SAMSI也被上调 ， D^c： ine ：dec axyIalc
接之而来的是 乙烯 的水 平增加 。在子房 的衰老过程 中 S-adeosylmethionine；DFMA：difluoromethylatginine；
跗 s，和SAMS2基因表达量均提高 用乙烯处理未授粉： ； ：兰
的子房也导致 了 SAMSI mKNA水平的提高 ，而 蹦 MS2 SAMS：adeosylmethionine syathetase；SPDS：spermi一
的表达却末发生变化。说明在子房衰老中诱导的 SAMS2 dine sy
与乙烯无关 原位杂交结果显示 出跗 MS mRNA定位于发育果察的内果皮和衰老子房的胚珠中。
迄今 ．sAMS酶的结构和恬性调节尚未见报道．
1．2 ACC合成酶(ACS)
ACC合成 酶 的 中文 名字 的译 法 值 得商 榷 。它 的 英文 名 为 ACC synthase(而 不是 ACC
synthetase)：似乎应该译为 ACC合酶 。但是在中文的文献中则多用 ACC合成酶 ，而未用 ACC合
酶。因此本文沿用了 ACC合成酶 。
ACS是植物体内乙烯生物合成的限速酶(rate-limited)，同时也是多基因家族 。近年来人们对
ACS的研究一 直相当重视，已成为研究 乙烯的重点。ACS的种属差异 ，活性调节及基因序列等均在
研究之列 ，因此涉及 ACS研究的文献量是惊人的一
l 2 l 纯化 与鉴定
ACS最早是在番茄的果皮组织中发现的 目。在多种情况下，它的活性限制了乙烯的形成，同时它
的活性也受到了乙烯及不同胁迫条件的刺激 91。LiCI处理以及受伤可提高成熟番茄果皮内 ACS的水
平，常规方法和 HPLC凝胶过滤得出这两种条件下所形成的ACS同质，其分子量在 50—57k[ 。用一
系列 的色谱法将此酶纯化超过 6 500倍后 ，用双向凝胶电泳分析表明其分子量为 50 kD，纯化酶 的
比话为 4xl0 Units mg 蛋白(在 30~C下每小时形成 l nmol的 ACC定义为 l unit)，为了更进一步研
究 ACS．Bleecker等12_。1生产出了 ACS的单克隆抗体 ．建立了灵敏的 ELISA和 RIA分析法。免疫分析
和放射性标 已表明 ACS是在伤害组织中从头合成，确证了早期密度标记实验盼结果。在话体放射标
记的实验巾，单克隆抗体 可以识别一个 56 kD的小多肽，同样在体外翻译 中也产生 了 56 kD的免疫
沉淀物 l。结果说明ACS在组织匀浆时被切割修饰。Rotmann等 1991年得出了类似的结果 。Van
萋1|∞ 一
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热带亚热带 植物学报 第 10卷
Der Straeten等 基于氨基序列的数据提出 ACS羧基端将近 85个 aa残基被切掉 。
Priva[e等 121用 NaB H 还原醛亚氨的方法将酶与其辅酶 (磷酸吡哆醛，PLP)连接起来 ，用
SDS—PAGE分析表明放射活性主要与 50 kD蛋白相联 系。用单克隆抗体分离后再用 NaB3H~处理
的酶 ，得到了同样的结果121。用放射’}生标记的 Ado(3．4-~4C)Met进行实验 ，发现放射性标记集中于
50 kD的肽中。然而也有 45 kD和 67 kD的报道 】
从笋瓜提取纯化的 ACS与 述稍有差异。Hyode等 从笋瓜受伤的果皮 中分析到 ACS的活
性，经过纯化分离得到一个 50 kD的蛋 质，用番茄的抗体可以识别 出一个 58 kD，说明笋瓜中这
个酶在提取和纯化过程 同样被剪切 ，去陈一段 抗体能 4伤诱 导的 ACS，却不能识别生 氏素诱导
的 ACS， 兑明在笋瓜中有两个 ACS的同工酶 ，它们的差异足以引起免疫学的区分。
Sato等 从笋瓜果实组织纯化到 ACS，经 6 000倍纯化后 ．用凝胶测其分子量为 86 kD，经 SDS—
PAGE测定 为 46 kD，说 明笋瓜 ACS是由两个同样亚基组成的二聚体 体外翻译，免疫沉淀 ，活体
标记等技术得到的 ACS，经过 SDS缓冲液煮沸后分子繁分别为 53和 55 kD，Pj_一次说明此酶经过
了翻译后的加工处理 ：此外 ，在用生长素处理的绿豆下胚轴及番茄 笋瓜 、苹果等(Kende等 1993)
多种植物中得到了 ACS，
1 2．2 活性中心及催化机理的研究
利用磷酸吡哆醛作为辅酶的酶 ，通常通过 ，B或 B， 碳位消除而催化 氨基酸的消除性反应。
如果ACS的情况也是如此，那么由AdoMet向ACC的转化，应包括一个丙烯菅氮酸的中间体。相反，
Adams等 提出通过 ， 一消除反府 ，有一个环丙烯 的中间产物。ACS反应催化的 体化学过程证明
AdoMet中 Met的碳 I-．的 H原子没有参与反应 ，说明 ACC的形成的确通过 d -消除性反应 ，
在 ACC合成酶J箍定的初期 ．Boler等 就注意到高浓度 的底物可以降低酶的活性 Satoh等
注意到 SA．M 对 ACS的抑制是有时间性 的，提m高浓度 的 AdoMet可 以作为一个酶 的抑制剂 。
Satoh等 1提出在底物埘酶不可逆抑制 中，至少 AdoMet的一部分共价地结合到 ACS上 ，放射性标
记的 Ado(3,4．14C)Met实验证明其属实 50 kD的一个 白质被放射性所标记 ，这个蛋白质可 以用
ACS专一的单克隆抗体识别 ．进一步的宴验表明 doMet的 2一氨基 -丁酸在酰陕 活时结合到 ACS
上。鉴于此 ．Satoh和 Yang提出两个催化反府 ：通过 。 -消除反应形成 ACC和通过 B， 一消除反应
形成一个高活性的中问体一乙烯 氨酸 乙烯 氨酸共价地结合到ACS上 基于动力学数据计算，
d， 和 B、 消除反应的比率为 30000：1。换言之 ，催化反应每生成 3万分子的 ACC，便有一分子的
乙烯甘氢酸形成 ，-~)-子的酶被抑制 Satoh指出 ACS活性的这种抑制使得 ACS在植物组织 中
迅速失活 然而至少有一种从番 叶片和培养细胞中胁迫诱导的 ACS没有这种不可逆的抑制。说
明不同的 ACS其作用机理可能有别．
Yip等 i用了两种力法标 记 ACS的活性位点 成熟苹果 ACS经 述的 NaB H 还原醛亚氨的
方法使磷酸吡哆醛和酶问形成_坝键 然后蛋 白质用胰蛋 白酶水解 ，用 HPLC分离到被标记的氨基
酸序列为 SLS(Xi)DLGLPGFR 其中 xi为未知的具放射性 的 aa衍生物 色渚和电泳表明这一来
知物的酸解产物与 N 毗哆赖氨酸有相同的迁移率。 此上述的 12肽 的第 4位氨基酸为 Lys(在
ACS的 K278) SLSK序列是其他含吡哆醛晌酶的活性位点 成熟苹果ACS的免疫纯化品，用上述
方法处理，同样得到 12肽，其中第 4位具放射性标记的氨基酸 又是一未知物(Xii)，此 12肽经 质谱
分析，经计算 Xi的分子量等于用乙烯 日 氢酸醛基化的 Lys。这些结果说明此 12肽第 4位的一NH
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第 l期 陈新建等：己烯生物合成途径及其相关基因丁程的研究进展 87
通过醛亚氢与磷酸吡哆醛相连。也正是这个 Lys的 一Nit 通过醛化与 AdoMet的氨基丁酸相连 ，导
致该酶的不可逆失活。Yip等也标记 了成熟番茄果皮组织受伤害诱导的 ACS。用(“C)AdoMet标
记 ，分离到胰蛋 白酶水解 片段 中同样含有此活性位点 苹果和番茄受成熟诱 导的 ACS的两个 l2肽
完全一样 ．而诱导的 ACS的 l2肽第 6位氨基酸由 Met代替了 Leu。因此 ，伤害和成熟诱导了不同
类型的 ACS的同工酶。
ACS划 AdoMet有严格的立体异构专一性 一由于 AdoMet的 Met上的 n碳原子为不对称原
子 ，因此 AdoMet有 D和 L型之分 ，同时也有左旋右旋异构体 。天然存在的都是 (一)一L—AdoMet。若
用非天然的( )一L—AdoMet作为底物 ．或用其外消旋体作为底物 ．ACS对它完全无活性 。
近期 ，由于基 因突变技术的应用 ．对酶的活性 中心氨基酸有 了更深入的认识。
“等 首先研究了番茄ACS(486个 aa)的几个缺臾突变体。从 Arg429开始缺失 C一末端 ，该
酶完全没有了活性(缺失 56个 aa) 从 C一末端缺失 46—52个 aa残基后酶对底物的亲和力 比野生
型的高出9倍 被截短的ACS 单体形式出现(用凝胶过滤法测得其分子量为 52~1 8 kD)话性更
高。在同样的条件下，野生型是以二聚体的形式出现 这些结果表明ACS的非保守的C·末端的存
在与否影响了二聚体的形成和酶的催化活性．White等 ‘i在点突变研究中证明了苹果的 ACS存在
Lys-273，Arg-407，和 Tyr一233点突变一其中Lys一273变为Ala的突变体，ACS的活性完全丧失，说
明它催化了 碳位上质子的脱离 Arg-407变为 Lys亲和常数至少下降到 5％，说明了与底物 d碳
位上 的羟基结合有关。Tyr_233变为 Phe导致 了 Km值提高 了 24倍 ，而最大反应速度不变 ，说 明
Tyr在活性 中心只与辅酶 PLP的定向有关
为了决定氨基酸残基对酶的结构和功能的重要性 ，Tarun等[4o1用 了点突变技术和 PCR 自由突
变技术对番茄的 Le—ACS2同功酶进行 了突变 ，突变件 的筛选是通过 E．coli的 Ile营养缺损型菌株 ，
这个菌是～个表达了 ACC脱氨酶(来 自Pseudomoacz~sp．)的工程菌，它能在 ACC为唯一碳源的培
养基上生长 =用这样的菌来鉴定 ACS的活性很方便。他们建立了一个突变文库 ，包括近 l 000个
DNA序列的突变克隆株 其中选用了 334个单个 失意”(missense)突变体来进行分析。基于它们
在该 E．coli中的活性将其分为三类 一突变 l及突变 2和野生型 ACS的表达水平相同，但是 ACS的
活性分别降低到野生型的 0-5％和 5％一50％，突变 3检测不到其蛋白质的表达和活性。这种方法的
建立为研究提供了极为方便的工具。Zhou等 ”用了突变技术对番茄 L—ACS2 Arg286进行 了位点
直接突变使之变为 Leu，园二色分析表明突变体 的整个三个-N结构和野生型没有明显的差异 ，荧
光色谱分析表 明突变体对辅酶 PLP的亲和力则下 降到 4％一5％。动力学分析 表明酶的转化数
(Keat)由 9 85 S 。降低 为 8．2x10。S～，Km值 由 120~xmoFL上升到 730 moI，L，因此 ，突变体的整
个催化常数 Kcat／Km是对照的八千分之一。由此 Zhou等推测 Arg-NH!与 PLP的磷酸形成离子桥
对酶的活性影响极大，这些现象与在其他需 PLP的酶类中的研究一致。
此外，ACS的结晶结构也在研究之中 1
l 2 3 ACS的基因及克隆
第一个 ACS基因序列是 1990年 Van Der Straeten等从番茄果实的 eDNA文库中分离得到的 。
Yip等 在 E coli中表达的 ACS的 cDNA不能产生具酶活性的 ACS，但它 的 l2肽活性位点的出
现，说 明它是 ACS。用 CNBr处理 ACS可以得到 3个肽片段。除了全长 ACS的 eDNA克隆外，Van
Der Straeten等还发表了具 420 bp的部分核苷酸序列的克隆，它与全长 eDNA克隆的对应区域显
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热带亚 带植物学报 第 10卷
示出 82％的相似性，这进一步表明番茄中 ACS的基因不止一个。接着 O]son等[41报道了第二条全
长的番茄果实ACS cDNA克隆，这两个克隆序列极为接近。之后 Rottmann等㈣又报道了番茄另外
ACS的序列 。Nakajima等从笋瓜中得到了两个 ACS的基 因序列及相应衍生的 aa序列 l蛔。所有
ACS的编码区都有一定的同源性。DNA序列的同源约为 60％，酶的 aa序列变幅为48％一97％。截
止 2000年 5月在 Genbank注册的序列就多达 170项之多。根据 ACS的进化关 系，无疑还将有更
多的 ACS基因被分离测序 现已明确 ACS的多态性早于单双子叶植物的分歧时间。表 1列出了部
分 Acs的基因。
表 1部分已克隆到的 ACS基因
Table I Some ofACS genes cloned
从 cDNA克隆推断出的 ACS的一级结构表 明不同来源的酶分子量极为接近 ，在 53-58 kD之
问 Northern印迹表 明编码不同的 ACS基因的 mRNA在 1．8-2．1 kb之间 。不同的 ACS在分子 内
存在着较高的同源性．而羧基端则差异很大。比较苹果、番茄和西葫芦果实中推断的 ACS氨基酸序
列，发现它们的相似性约 80％，有 7个极为相似的高度保守区域 ，而且各区域的相对位置也大体相
同．这些保守区域至少有 8个氨基酸残基 ．一致性高达 80％以上 ，保守区 5被认为是活性中一t5，它
含有一个赖氩酸残基 ．这个残基和结合辅酶 PLP并与依赖底物的酶的钝化有关。番茄果实 ACS基
因由 4个外显子和 3个内含子组成，它的 5’-侧翼区含有与番茄基因 E4的启动子共用的序列 。E4
基因的表达 由成熟或乙烯所诱导
应用 cDNA克隆，人们可 以研究两个重要问题 ，ACS的调节发生在哪一水平上，发育、环境和
化学因素表达的是相同还是不同的 ACS基因?用 Northern 印迹和 RNase保护分析证明果实成熟 、
花的衰败、外源信号的诱导(伤 、生长素和细胞分裂、乙烯)等明显地基于 ACS的 mRNA的合成，即
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第 1期 陈新建等 ：乙烯生物合成途径及其相关基因T程的研究进展
在转录水平 上的调控 。应用特异的探针 ，Olson等 表明了番茄果皮成熟和损伤诱导的 ACS的基
因有不同的表达。类似 的情况有 ，番茄果实 、细胞培养和胚轴表达的 4种 ACS的基因也受 到了成
熟、损伤和生长素的不同调节 伤诱导的番茄果实 ACS的转录产物受到了水扬酸(损伤信号传导的
抑制剂)和多胺(已知为 乙烯生物合成抑制剂)的抑制 ，两个 ACS基 因在笋瓜中也受到了乙烯和
伤害的不同调节 。
也有报道t~61ACS基因的调节发生在转录后 ，即发生在成熟 mRNA的形成过程 中。
所有研究过的植物都含有一个以上 ACS基因 番茄至少有 9个 ，其中 6个为生长素诱导的，
绿豆下胚轴至少有 5个 ，水稻 3个 ，拟南芥 5个等。近期，人们对同一植物不同ACS表达的差异的
研究越来越多 ，使人们对此有了较为深入的认识。
Bui等研究了兰花授粉的信号激活了一连串的生理生化反应 ，包括乙烯的生物合成。乙烯生物
合成的启动与加速伴随着 3个不同的 ACS基因被调节。一个 ACS基因( CSS)受到乙烯的调节 ，
参与了授粉信号的放大及器官内的传播，另外的两个ACS基因(P／ud-ACS2和 nM CS3)最早是在柱
头和子房 内表达 授粉后 1 h，Pha!-ACS2在花柱内积累，而 dCS1授粉 6 h后才被探测出。Plud-
ACS2和 Phd-A CS3授粉后 2 h在子房内表达。外用生长素和用刺激模拟授粉，ACS在柱头和子房中的
活性迅速提高，其中ACS2和 ACS3也分别在柱头和子房 中积累。这些结果提供了 ACS基因内源表达
的基本模式 授粉信号刺激后先表达的是 Pha／~4 CS2和 PIuU-A CS3，后表达是 Phd-A CSf
Oetiker等 1997年研究了番茄悬浮培养中的 7个 ACS基因嘲。他们用 R]qase保护分析方法研
究 了用一个诱 发剂后 ACS基因的转录情况。 A 2、L ．ACS5和 L 14CS6受这个诱发剂的强
烈诱导，相反 LE-ACS1B、 E．J4CS3和 LE-ACS4为组成性表达 ，LE-ACSfB在所有的时间内都表达
出特别高的水平 因此 ，在番茄细胞 内有两种类型的 ACS基因：诱导型和组成型。LE·ACSIA没有
被探 测到 在缺乏诱发 剂的情况下尽管也 出现 LE．ACS1B、LEACS2、LE．ACS3、LE-ACS4和 LE．
ACS5，但只有很少的乙烯产生。乙烯量的增加常常伴随着 ACS转录的积累，说明乙烯的产生是通
过 ACS基因在转录水平上的活化 。然而，几种 ACS mRNA的大量出现与 乙烯形成诱发剂之间没
有严格 的相关关系，因此他们指出 ACS的活性不仅只限于转录水平上的控制。
Mathooko等研究了在 Co2胁迫下黄瓜果实 ACS基因的表达Nt。c 对乙烯的诱导只与 CS-ACS1
的转录产物相一致，当 c 胁迫取消后 ，CS-A CSt也消失 ，环 已亚胺抑制 C02胁迫诱导的乙烯的产生 ，
但却引起较高 CS-ACS1转录产物的积累。较高浓度的环己亚胺还诱导了CS-A CS2和CS-ACS3转录产
物的积累。在 c 和环已亚胺同时出现时 CS-ACS2转录产物的积累发生在 1 h内，3h后消失。去掉
C ，CS-ACS2却大幅度地增加。CO：胁迫诱导的乙烯肘这些∽CS2和ACS3)基因的表达几乎没有效
应。结果说明 cs CSf作为 ACS主要的基因在 C02胁迫时在黄瓜果实内负责提高乙烯的合成量。
柑橘表皮的颜色经过低温和高于 12．5℃的 日变化处理后 由绿变黄 ，乙烯在这个过程起 了启动
的作用。为了研究颜色的变化是否因低温引起，Wong等从柑橘果皮中分离到两个低温诱导的
ACS，CS-ACSf和 CS-ACS2两个基 因 。CS-dCSf转 录出 1．7 kb的 RNA，编码 483个 氨基酸 (Mr
54 l15 pI6 63)，而 CS．ACS2转录 出 1．8 kb的 RNA 编码 477个 氨基酸 (Mr 53 291，pI6．72)，4~C处
理变暖后两个基因在 2．4 h内都被迅速地诱导。室温 24 h后 ，CS-ACS 的 RNA 回到冷处理前 的水
平。冷诱导的乙烯和 ACC都可以测到。这两个基因还被伤害所诱导。蛋 白质合成抑制剂环 已亚胺
能促进这阿个转录产物在室温下的积累。3．3 kb的基 因组分分析 ，CS-ACS1由 4个外显子和 3个 内
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热带亚热带植物学报 第 10卷
含子组成 ，这三个内含子很大(1．2 kb)，明显地和线粒体 DNA同质。
ACS启动子的结构也已开始研究。在不同的耐贮性的苹果品种中得到了不同的ACS的等位
基因克隆。Sunako等 在成熟苹果(栽培种为 Golden Delicious)中发现了一对等位基因 Md-ACS1一J
和 Md-ACS1-2 基因研究表明两者的编码区有 7个不同的核苷酸，但只有一个 aa被改变。一个 162bp
的片段作 为一个短的分散重复单元反向转座子被插在 ACS1—2的 5 侧翼 区，此区对应于 ACS1一
的一781处 ．定位于 ACS1—2 3 端的预期编码 区 Xhol位点没有被发现 (用 RT—PCR法 )，在 Golden
Delicious苹果成熟时只有 ACS1一 进行转 录 DNA凝胶印迹和 PCR分析清楚地表明苹果栽培品
种要么是 ACS1一J和 ACS1—2的杂合子 ，或者是每一种的纯合子。RNA凝胶印迹分析表明 Fuji品种
为 ACSI一2的纯合子(这种 品种产生很少的乙烯 ，因此有较长 的贮存期 )，在成熟期 ACS1—2的转录
水平很低。Yoon等I I研究了绿豆胚轴生长索诱导的 ACS基因(VR—Acs6)，它的启动子的活性在转
基因烟草中进行了检查。这个克隆含有 1 612 bp长度的 5’非翻译区，其编码序列由三个外显子和
两个内含子组成。基因组 Southern杂交说明 VR-A CS6是一个单拷贝基因。转录开始于翻译起点密
码上游的 231-碱基处 ，此处的碱基为 C VR-ACS6启动子含有与已鉴定 的不同功能的生长素反应
元 同质。为了证 明这个启动子 区域的响应性 ，用了 1 719 bp的 VR—ACS6启动子和 G 基因相连
接 ，然后将构建好的基因转人烟草。用生长素处理转基因植株 的叶和黄化幼苗胚轴引起 了 G 基
因的强烈表达 CTK提高了报告基因受生长素诱导后基因的表达量，而 ABA和乙烯则抑制这种表
达 VR-ACS6启动子在转基因植物里的活动特点与在绿豆胚轴中的表达高度一致。组织化学染色
表明 Gw 活性 可在用生长素处理的黄化或正常的幼苗中检测到。CTK增加了生长素诱导的 GⅢ 的
染色强度 和扩大了染色区，而 ABA和乙烯则恰好相反
综上所述 ACS基因的表达极为复杂 ，有不 同的诱导方式，其调节主要发生在转录水平上．也可
在翻译水平 }‘，相信随着研 究的深人 ，会有越来趟多 ACS的基因被克隆 ，基因的调节方式被披露 ，
基因的启动子被发现。
1．3 ACC 氧化 酶(ACo)
ACO是 乙烯合 成途径 中的最后一个 酶 。此酶最早被 Yang及其 同事定 名为乙烯形 成酶
(EFE)。直到 9O年 代初 才 阐明 了这 个酶 的 反应 特征 ，它需要 抗 坏血 酸和 氧作 为辅 助 底物
(cosubstrates)，Fe 和 CO 作 为辅助因子 ，据此把 EFE称为 ACC氧化酶(ACO)更适合。把外源的
ACC供给植物组织就能使 乙烯的生成量增加 ，表 明这个酶是组成性 的，不构成乙烯生物合 成的限
速酶 。
l 3l ACO基因的克隆
ACO的鉴定远 比 ACS困难得多 ，因为不能用通常 的生 物化学方法分离无细胞提取液 中的
ACO。用分子克隆的办法来鉴定 ACO，克服了直接从植物组织中提取 ACO的困难，使 ACO的研
究柳岸花明。虽然不能用传统的生化方法分离出这个酶，但是可以鉴定与成熟有关的 cDNA克隆
的功能性表达。Grierson等 。l从不同成熟阶段的番茄中分离到了ACO的mRNA，并使之在兔子网
状细胞裂解液系统 中翻译 。用 SDS—PAGE分析翻译产物 ，他们发现有 4—8个翻译产物的水平在成
熟过程中提高，其 中一个是 PG，而其他的功能不知 其 中一个为 35 kD。Slater等提取了成熟时番茄
Poly(A) RNA，建立了 cDNA文库 。用完全成熟的番茄和成熟的绿色番茄的 eDNA作为探针进行
差异 杂交筛选 。用此方法鉴定 出的与成熟有关的 cDNA 克隆 ，其 中 6个编码多肽的分子量 与
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第 1期 陈新建等 ：乙烯生物台成途径及其相关基 因T程 的研究进展 9
Grierson体外翻译的一致。其中一条克隆编码 35 kD的蛋白被命名为pTOMI3。在番茄成熟过程中
和绿果及 叶受 伤后 ，编 码 35 kD 的蛋 白质 的 mRNA 的出现与乙烯合成 量 的增加相一致 用
pTOM13作为探针在成熟 、损伤未成熟的果实及受伤叶片的 RNA 中筛选出的 mRNA，体外翻译时
同样产生 35kD的蛋白．但在未受伤的果和叶中，却未得到相应的蛋白。于是 Smith等提出pTOM13可
能是一个与乙烯生物合成有关的酶 [731 用 pTOMI3 eDNA作为探针对番茄的基因组 DNA进行的
Southern印迹表明，在基因组中有低拷贝数目的基因与pTOMI3同质。鉴定 pTOM13是 ACO的第
一 个有 突破性 进展 的是来 自 pTOM13的转化 实验 Hamilton等将 pTOM13的 1．1 kb片段在
CaMV35S启动子的控制下反义地转入番茄植物体 内(741。在转基因植物体内，损伤的叶片或成熟的
果实与 pTOMI3同质的 mRNA的积累被大幅度降低 ，甚至难 以测出。由于推测的 pTOM13的氨基
酸序列与黄烷酮 一3一羟化酶的氨基酸有 58％的同源性．Hamilton提出pTOM13编码的是乙烯形成
酶 ，其催化模式与羟化酶类似 ，这与 Yang等根据 由羟化酶通过 N-羟基 -ACC作为中间体把 ACC
氧化成乙烯和氰基甲酸而提出的 ACO反应机理相一致 。最初试图在酵母 中表达 pTOM13未成
功，因为在 pTOM13的插入片段 5’。端缺少了两个碱基 ，故 mRNA不能翻译，经过修正的 cDNA克
隆导人酵母 ，成功表达了 ACO活性 ，抗环血酸可提高其活性 ，CoCI：及铁鳌合剂菲咯啉可抑制其活
性 ，从而证实 pTOM13翻译的产物是 ACO17~。几乎在同时 ，Spanu等 从病原激发 因子处理的番茄
细胞中提取的 RNA，然后 ，注入到爪蟾卵细胞 中，使其获得了转变 ACC为乙烯的能力 ，并且该酶 的
动力学、需铁及立体专一性与所期望的真实的ACO一致。反义的 pTOMI3和番茄细胞RNA一起
注入到爪蟾卵细胞 中，抑制 了 ACO的表达 ，因此 ，指导合成 ACO的 RNA与 pTOM13有同源区 ，
从病原菌诱发因子所诱导而准备的 cDNA文库中得到了与 pTOM13有高同源-睦的几个克隆株 ，其
中的一个为 pTOM5，它所编码的 ACO与 pTOM13转录产物有 88％的同源性。
除了番茄外，从其他多种植物中获得了ACO基因(表 2)。像 ACS一样，ACO也为多基因家族
所编码：如从番茄中已分离到了3个不同 ACO基因。用专一的基因探针研究表明，这些基因在成
熟果实和伤害 叶片里表达有差异 ，不 同植物 ACO基因的同源性比 ACS高 ．一般在蛋 白质水平上
同源性都在 80％以上 。
1．3 2 ACO的生物化学性质
由于从 pTOM13推测的 aa序列与黄烷酮 一3-羟基化酶的序列类似 ，Ververidis等利用与提取
和分析黄烷酮 一3-羟基化酶相同的条件进行试验 目，首先报道了从甜瓜果实匀浆中提取 到具活性
的 ACO。这些条件包括在 下 、加铁和抗坏血酸。这些条件使 ACO活性完全恢复，并具有一定的
立体专一性 离心分离时 ，酶存在于可溶性成分中。基于这些结果 ，Ververidis认为17s]，ACO与 2一氧
谷氨酸的双氧酶相类似 ，所有这些酶都要求 Fe 和抗坏血酸。进一步研究表明，用凝胶过滤测得酶
的Mr为41 kD，Km 为60 gM，最适 pH7．5。尽管类似于2一氧谷氨酸的双氧酶，但 ACO不要求 2一
氧谷氨酸为辅基 ，ACO反应机理可能类似干异青霉素合成酶和 GA 3B一羟化酶 ，这些酶都需 F ，
但不需要 2-氧谷氨酸[791。Co-~~SH一试剂、自由基淬灭剂和 EDTA可以抑制 ACO的活性 。EDTA可
能是鳌合介质中的自由铁离子。1，2-二羟萘是 ACO活性最强的抑制剂，因为它与铁有很强的结合
能力。1．10-菲咯啉也是 Fe 的鳌合剂，所以也可以抑制 ACO 2一氨基异丁酸为 ACO竞争性抑制
剂。氧化磷酸化的偶联剂(DNP和 CCCP)也能抑制酶活
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92 热带亚热带植物学报 第 1 0卷
在苹果的匀浆中 ACO与颗粒组分相结合I 。从苹果中纯化的溶解状态的 ACO表现出了均一
性，凝胶过滤法测得其分子量为 39 kD，SDS-PAGE测得其分子量为 35 kD，表明它是一种单体 。部
分的氢基酸序列与pAE12克隆片段推测的序列极为吻合 在苹果呼吸峰之前 ．用乙烯处理，不管在
体内或离体情况 ACO的活性都与乙烯的形成相吻合。纯化的 ACO绝对需要 Fe 和 Vc，但不需 2一
氧谷氢酸。在许多植物中 ACO活性 随 CO 浓度的升高而提高。空气中的 CO 浓度达 0．5％时酶活
性达到其最大活性的一半 ．当 CO 为 2％一4％时．酶活达到最大。
Dong等建立 了由ACC到乙烯反应的化学计量 ：
ACC+Oz+抗坏血酸 ——— 一 C 2}L—CO2+HcN+脱氢抗坏血酸 +2H2O
ACO氧化的确切机理仍有待于进一步研究。
1．3．3 ACO在细胞 中的定位
在乙烯生物合成途径未被阐明之前，人们都已广泛相信，至少一部分的乙烯形成酶应定位于
膜上，因为人们发现 乙烯生物合成对渗透溶液敏感，被Ca" 所稳定。当发现 ACC是乙烯生物合
成的直接前体后 ，两个与乙烯合成有关的特异催化酶被提 出，ACO在细胞中的定位被重新提出。在
番茄果实中ACS为可溶性酶 ．并且没有证据说明它在其他植物中定位于膜上，而大量证据都证明
乙烯的生物合成要求具完整性的膜 I。John等提出ACO的活性偶联质子的跨膜运输，乙烯的形成
要求维持一定的膜势 I。然而这个理论没有被实验所证实 ，从蚕豆叶片分离到具有中心液泡的原
生质体或从原生质体分离到的液泡都能把外施的 ACC转变 为乙烯 ，无液泡的原生质体丧失 了
ACO活性 ，当无液泡的原生质一但重新形成液泡 ，ACO活性就恢复 ，说 明 ACO可能定位于液泡膜
上[931。转基因的酵母经差速离心 ．发现 ACO是一种颗粒状 ，与 1 8 000~g的离心 区段相联系。由于
ACO是以颗粒形式出现，因此，ACO可能与膜蛋白形成蛋白与蛋白的复合体。从 ACO氨基酸序列
上从 11 3—1 34位(甚至到 145)氨基酸有很大可能形成 含有多个 Leu的两性 的 a一螺旋体 ，定位于疏
水一端，这个假设的 Leu拉链的出现在所有已知的ACO中是保守的，这可 解释 ACO在酵母中
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第 1期 陈新建等：乙烯生物合成途径及其相关基因丁程的研究进展 93
以颗粒状出现的原因，也可以解释早期认为 ACO与植物膜相联的原因。由于有不同的实验证据 ，
ACO的定位至今尚末解决。可能是不同的 ACO有不同的定位。
此外 、如前所述 ACC也可以在 ACC丙二酰转移酶(ACC N-malonytrasferase)的作用下代谢成
为丙二酰 ACC(1一(malonylamin o)cycl0propane一1-carboxylic acid，MACE)。MACC实际上是 ACC的
结合形态。MACC的形成可调节植物体内乙烯的水平。植物体内乙烯的水平也可以通过乙烯的降
解来调节 由于本文主要集中于乙烯 的生物合成途径，所 以这些问题在此不拟详述。
2 与乙烯有关的基因工程
通过阻断乙烯生物合成或使乙烯受体不
敏感从而达到延迟果实的成熟和花的衰败是
采后生理研究的主要 目标。近年来 由于对乙烯
分子生物学的研究逐步深人，使人们可以从多
种途径 ，多方位地控制 乙烯 以延迟成熟。用遗
传工程的方法达到这一 目标 、有五种不同的途
径(图 3) 第一种途径就是通过 SAM 水解酶
(SAMase)，分解 SAM，使之成为 MTA和高丝
氨酸 ；第二种途径就是用反义 的 ACS、抑制
ACC的产生 ，或用正义的 ACS，通过 同源共抑
制而抑制内源的 ACS基因的表达 ；第三种途
径是反义的 ACO，从而不能产生乙烯 ，或用 正
义的 ACO，通 过 同源 共抑 制而抑 制 内源 的
AC0基因的表达 ；第 四种途径就是 ACC脱 氨
ReGepto r mutant@
图 3用基因工程的方法控制乙烯台成的可能途径
Fig 3 The possible palhways to control ethylene and therefore to
enhance shelf-life and market ability offrui~ or flowers
by genetic transformation
酶 ，将 ACC分解成 为 一 酮丁酸和氨 ；第五种途径是乙烯受体突变体的应用 ，使植物对乙烯反应迟
钝或使乙烯信号中断 ，从而达到保鲜之 目的
Z，l SAM ase
通过控制 SAM(或AdoMet)(乙烯生物合成中的第一步)来控制乙烯生物合成的试图没有成功，
因为至少有三种不同的AdoMet合成酶，另外已知 AdoMet生成的抑制剂对哺乳细胞都是剧毒旧，但
通过分解 SAM，使台成途径形成短路，即不能台成 ACC，(图3中①)却是可能的。在大肠杆菌的T3中
有一种酶 ，称为AdoMet水解酶(AdoMetase或 SAMase)能够将 SAM 分解成高丝氨酸和 MTA。由于
AdoMet是乙烯台成的单一前体，它的分解直接降低了乙烯的生物合成。SAM 分解后形成的 MTA又
是ACS的一个抑制剂，所以 SAMase的转入，起到了一箭双雕的作用，既减少了前体物又抑制了ACS
的活性 将 SAMase的基因转人植物中，转基因植物的花和果实的衰老得到了明显的抑制 。
2．2 反 义 的 ACS
Oeler等 1991年首先将 ACC基因反义地转人番笳，使番茄的成熟被推迟，外用乙烯又可以恢
复其正常成熟 。在其他的植物中也有用 ACS的反义基因，如苹果 等。此外，也有正义表达，利用
同源共抑制现象控制 内源乙烯合成 。
m舟 ㈨一
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热带亚热带植物学报 第 1 0卷
2．3 反义的 AC0
Hamilton等 先把pTOM13(tipAco~／人番茄植株，获得了反义RNA转化植株 该植株受伤叶
片和果实成熟过程的乙烯生成均受到明显的抑制，不转化的对照果实乙烯最高释放量为6．5nmolgh’，
而转化植株果实仅为 0．25 nmol g-⋯h-。对照受伤叶片乙烯产量最大释放量为 9 5 nmol Ir’，转化植
株仅为 l 0 nmo] h-，。用反义的 ACO基因控制花果的成熟和衰老受到科学家的重视 ，在许多植物上
均有尝试 ，如在番茄 ’oct、香瓜 l、椰菜[1azl、三角杨” 及康乃馨 等均有应用 ，取得了较为满意 的效
果
2．4 ACC脱氨酶
ACC脱氨酶是从土壤的假单孢菌(P~eudomonos sp．)中分离出来的一种可以将 ACC分解成为
酮丁酸和氨的酶。在 ACC为唯一碳源的培养基上筛选菌株，能正常生长的菌株中含有 ACC脱
氨酶 Klee等首先将此酶转入番茄植物中” ，获得了转基因的番茄果实，乙烯生物合成的抑制率达
97％，从而果实成熟明显延迟。ACC脱氨酶的优势之处在于它破坏 ACC，而不是靠反义抑制 ，因此，
它具有通用性 ，可用于不同的作物 ，扩大 了使用范围。而反义的 ACC和 ACO只能用于同种植物 ，
如番茄中的ACS和 ACO只能用于番茄。最近 Jia等人[1c6．1 又从青霉菌(Penicillium)中得到了ACC
脱氨酶，发现它与已发现的 P．~e1~olrlol?os sp圾 土星汉逊酵母(Ha~senula m rnⅢ)中的ACC脱氨
酶分别有 50％和 54％的同源性 可见自然界中也存在着多种类型的 ACC脱氨酶，目前至少发现了
三种 ，但在植物中尚未发现。
2．5 乙烯受体突变体
近年来乙烯受体的研究为利用基因工程控制植物对乙烯的感知，开辟了一条延迟花果衰老的
新途径[IC~．teg]。拟南芥 er． 是一个乙烯受体的显性突变体。突变体是由于乙烯受体的氨基酸改变，使
之结合乙烯的能力下降(如前所述)，从而阻碍了植物对乙烯信号的感知及传导途径，因而突变体
对乙烯不敏感。将 er·必的基因转人番茄和矮牵牛，使转基因植物的花果的成熟及衰老明显地推
迟 ，从而起到了保鲜之 目的(图 3中⑧ )。
2．6 其 他
以上都是利用抑制乙烯．起到果实保鲜作用。但是，在农业生产 上有时需要促进成熟，以提高品
质或促进早熟利于下茬作物的播种 ，如烟草成熟度好，品质就好 ，因此需要 乙烯的正义表达。然而 ，
这方面的研究极为鲜见 笔者已构建了在 Psag !控制下的兰花 ACS基因 ，并在烟草 中得到表达C艾
章待发)、以图获得成熟度好的烟草新品种。此基因也可用于棉花等作物的催熟，有利于收获。
综上所述，近年来人们对乙烯的研究取得了长足的进展，乙烯生物合成途径中的关键酶基因已
相继被克隆、被鉴定 通过基因工程的方法人为调控乙烯的生物合成已初步显示出诱人的前景。相
信随着研究的不断深入，技术的不断完善，会有更多、更好的通过调控内源乙烯生物合成的转基因
的新品种 出现，人类生活也将会因此而增色。
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