全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1927~1932　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0420 1927
收稿 2015-08-04　　修定 2015-10-29
资助 国家“863”计划重点项目(2013AA102704)。
* 通讯作者(E-mail: chli0@163.com; Tel: 0451-82191556)。
毛果杨PtAREB9基因启动子的克隆与功能初步分析
魏明, 王含, 李成浩*
东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室, 哈尔滨150040
摘要: ABF属于碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子A亚族, 受脱落酸(ABA)调控, 参与植物生长发育及抗旱耐盐响应。为了研
究杨树ABF同源基因的表达规律, 利用PCR技术从毛果杨基因组DNA中克隆出PtAREB9基因上游一段1 635 bp序列。使用
PLACE和PlantCARE在线软件分析序列, 结果表明该序列含有水杨酸(SA)响应元件TCA-element、逆境胁迫响应元件TC-
rich repeats、干旱胁迫响应元件CCAAT-box和MBS、ABA应答元件CE3。在序列分析的基础上, 构建了PtAREB9基因启动
子驱动GUS报告基因的植物表达载体。利用农杆菌介导的花粉管通道法转化拟南芥, 结果表明PtAREB9启动子可以驱动
GUS基因在拟南芥中表达, ABA、干旱、高盐和SA处理后在叶片和根尖中的表达量较高。说明PtAREB9启动子受SA响应
元件调控, 与ABA、干旱和高盐胁迫应答相关。
关键词: 毛果杨; ABF转录因子; 启动子; 拟南芥
Cloning and Functional Identification of Promoter Region of PtAREB9 from
Populus trichocarpa
WEI Ming, WANG Han, LI Cheng-Hao*
State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: AREB binding factor (ABF) is a member of basic leucine zipper (bZIP) transcription factor A sub-
family, which is regulated by ABA and involved in plant growth and drought and salt resistance. A 1 635 bp
5′ flanking sequence of PtAREB9 gene was isolated by PCR from genomic DNA of Populus trichocarpa to
study the expression and regulation of ABF. Promoter sequence analysis showed that it contains a salicylic acid
(SA)-responsive element (TCA-element), stress-responsive element (TC-rich repeats), dehydration-responsive
element (CCAAT-box and MBS) and ABA-responsive element (CE3). Then, the PtAREB9 promoter was fused
to the GUS reporter gene to characterize its expression pattern in P. trichocarpa. Agrobacterium mediated trans-
formation of Arabidopsis thaliana showed that the GUS gene was induced in leaves and root tip under ABA,
drought, high salt and SA treatments, suggesting that the PtAREB9 promoter was induced by SA-responsive el-
ement, and responsed to ABA, drought and high salt stresses.
Key words: Populus trichocarpa; ABF transcription factor; promoter; Arabidopsis thaliana
植物在生命过程中具有感知环境变化和适应
逆境的能力, 当植物生长环境受到复杂多变的逆
境胁迫时, 在长期进化过程中植物会产生相应的
胁迫应答反应。干旱、高盐是影响植物生长的主
要非生物胁迫因素, 严重影响植物的生长发育。
在植物中各种诱导型基因的表达主要受大多以家
族形式出现的转录因子调控, 转录因子在提高植
物的抗逆性、参与植物对生物和非生物胁迫的应
答反应中发挥着重要作用(Zhang和Wang 2005)。
启动子作为具有调控作用的反式作用因子, 通过
与转录蛋白结合有效地控制基因转录起始时间、
表达部位和表达程度(杜皓等2015)。
启动子是基因表达调控的重要元件, 并且已
经成为分子生物学研究领域的热点。对脱落酸
(abscisic acid, ABA)调控下基因的启动子分析表明
大多数基因能够受ABA调控, 主要是由于其启动
子中含有调控元件(C/T)ACGTGGC (Busk和Pages
1998)。这类保守的元件称为ABA应答元件(ABA-re-
sponsive element, ABRE)。AREB (ABA-responsive
element blinding protein)/ABF (AREB binding fac-
tor)是可以与启动子中ABRE结合的碱性亮氨酸拉
链(basic leucine zipper, bZIP)类中A亚族转录因子,
植物生理学报1928
可激活干旱胁迫下ABA依赖基因及下游许多耐盐
和耐旱等抗性相关基因的表达(Choi等2000)。在
拟南芥7 000个cDNA基因中已经鉴定出299个干旱
诱导基因, 213个受到高盐诱导, 245个受到ABA诱
导(Seki等2002)。一半以上的干旱诱导基因可以分
别被高盐或ABA诱导, 说明干旱、高盐和ABA应
答途径之间存在着复杂的相互作用。ABA能够在
干旱和高盐的条件下对植物营养组织适应性有基
础调节作用, 并促进植株保卫细胞气孔关闭以维
持植株内的水分(Finatto等2015; Shinozaki等
2003)。作为抗旱耐盐性诱导激发机制的一部分,
ABA抑制了与活跃生长有关的基因, 并活化与抗
旱耐盐诱导有关的基因, 从而提高了植物的抗逆
性(郭贵华等2014)。ABA响应基因的表达需要多
个AREB和AREB结合耦合元件(如CE1或CE3)来
作为功能性的启动子(Narusaka等2003)。
近几年来, ABF转录因子已经成为拟南芥、
水稻等模式植物抗旱性研究的热点之一。ABF基
因在诸多非生物胁迫中被显著和快速地诱导表
达。有研究从拟南芥中分离出4种bZIP蛋白, 其中
ABF1主要参与低温、ABA胁迫应答反应; ABF3主
要受ABA、高盐、低温、热、氧化胁迫诱导 ;
ABF2/AREB1、ABF4/AREB2则主要参与ABA、
干旱、高盐、热和氧化胁迫应答反应 (杨颖等
2009; Uno等2000)。ABF2启动子在胚胎成熟过程
中有较高表达活性, 在营养组织中大部分能够高
效表达, 在生殖器官中也有少数表达, 这种现象表
明在植物器官中ABF2能够特异性表达, 从而影响
了植物的整个生长发育过程。
为研究杨树AREB同源基因的表达特异性, 我
们在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中
找到ABF2的同源基因PtAREB9, 对其启动子序列
进行顺式作用元件的分析及克隆, 构建pBI121-
PPtAREB9-GUS表达载体, 通过花粉管通道法(Bech-
told和Pelletier 1998)转化拟南芥, 对该表达载体的
GUS活性进行特异性分析。
材料与方法
1 实验材料及试剂
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为哥伦比亚生态
型, 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株感受态DH5α、
pBI121-GUS载体、农杆菌EHA105均由本实验室
保存。pMD18-T购自TaKaRa公司。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、纯化试剂盒以
及普通质粒小提试剂盒购自康为世纪公司; LA Taq
酶、核酸分子量标准(DNA marker ladder)、T4
DNA连接酶、限制性内切酶HindIII和BamHI等购
自TaKaRa公司。葡萄糖苷酸酶(glucuronidase,
GUS)组织化学染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡萄
糖苷酸酯(X-Gluc)购自Sigma公司。卡那霉素(ka-
namycin, Kan)购自Amresco公司; 氨苄青霉素(am-
picillin, Amp)购自Sigma公司; 利福平(rifampicin,
Rif)购自MYM公司; 乙酰丁香酮(acetosyringone,
AS)购自Sigma-Aldrich公司; 蛋白胨、酵母提取
物、NaCl和琼脂等其余试剂均为国产分析纯。
2 毛果杨PtAREB9基因启动子的克隆及序列分析
根据Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/
pz/portal.html#)提供的序列设计一对PtAREB9基因
启动子特异引物。上游引物: 5′-CCAAGCT T CAA-
C TCGCATGCAATCCCCT-3′ (划线部位为增加的
HindIII酶切位点, 酶切位点前加两个保护碱基);下
游引物: 5′-CGGGATCCTTTCCAAAGTTCTT-
GAAGTCCCAA-3′ (划线部位为增加的BamHI酶切
位点, 酶切位点前加两个保护碱基)。利用CTAB法
提取毛果杨(Populus trichocarpa)基因组DNA, 以
毛果杨基因组DNA当模板, 用LA Taq (TaKaRa, Ja-
pan)进行PCR反应, 扩增出PtAREB9启动子。扩增
条件为: 95 ℃预变性3 min; 然后95 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s,
72 ℃ 2 min, 共35个循环; 最后72 ℃延伸7 min。扩
增产物经1.2%琼脂凝胶电泳分离, 回收扩增片段,
纯化后插入pMD18-T载体 , 热激转化大肠杆菌
DH5α菌株感受态细胞, 接种到含50 mg·L-1 Amp的
LB固体培养基(1 L LB固体培养基含10 g蛋白胨、
5 g酵母提取物、10 g NaCl和12 g琼脂)平板上, 于
37 ℃倒置培养14~16 h, 挑取单菌落进行PCR获得
阳性克隆。阳性克隆委托吉林省库美生物科技有
限公司进行测序 , 并与毛果杨基因组序列进行
BLAST比对。将pBI121-GUS质粒和基因重组质粒
分别进行HindIII和BamHI双酶切, 回收纯化目的片
段, 用T4 DNA连接酶连接, 并将连接产物转化大
肠杆菌感受态细胞DH5α, 经50 mg·L-1 Kan筛选和
PCR扩增后, 进行双酶切验证, 获得pBI121-PPtAREB9-
魏明等: 毛果杨PtAREB9基因启动子的克隆与功能初步分析 1929
GUS启动子植物表达载体。
3 农杆菌介导的花粉管通道法转化拟南芥
通过电击法将pBI121-PPtAREB9-GUS启动子表
达载体转化到根癌农杆菌EHA105中。用花粉管
通道法将拟南芥花絮放入用蔗糖水悬浮的农杆菌
菌液(OD=0.8~1.2)中浸泡3 s, 取出后用保鲜膜包
好, 并遮盖不透光的塑料袋, 暗培养16~24 h, 取下
袋子和保鲜膜, 正常光照培养。侵染1周后, 按照
上述方法进行第二次侵染。待角果成熟发黄后,
收集T0代种子, 于37
℃烘箱中烘干2 d, 放入4 ℃中
3~5 d后 , 筛选种子。种子消毒后 , 播种于含50
mg·L-1 Kan的1/2MS培养基中, 种子萌发生长后, 取
抗性植株种于土壤中, 成熟后收T1代种子, 并通过
PCR鉴定出转基因植株。重复以上步骤, 筛选出T3
代转基因株系。
4 胁迫处理及GUS染色
将T3代转基因种子用20%白猫牌漂水消毒25
min, 双蒸水清洗干净, 均匀播种在添加50 mg·L-1
Kan的1/2MS培养基上。将生长7 d的转基因植株
分别转移至含200 mmol·L-1甘露醇、300 mmol·L-1
甘露醇、150 mmol·L-1 NaCl、200 μmol·L-1 ABA、
100 μmol·L-1水杨酸(salicylic acid, SA)的培养基上
进行幼苗期干旱、盐、ABA、SA处理, 2 d后取
样。取处理后的植株进行GUS组织化学染色分析,
37 ℃染色20 h, 然后用70%乙醇脱色, 观察并拍
照。GUS活性检测液包含0.1 mol·L-1 K4Fe(CN)6、
0.1 mol·L-1 K3Fe(CN)6、50 mmol·L
-1磷酸钠缓冲液
(pH 7.0)、10 mmol·L-1 Na2EDTA、0.001% (V/V)
Triton X-100、0.5 mg·mL-1 X-Gluc。
实验结果
1 毛果杨PtAREB9基因启动子的克隆
以毛果杨基因组DNA为模板, 通过PCR扩增
得到大小约为1 635 bp的片段(图1), 与预期基本一
致。将此片段回收, 与pMD18-T载体连接, 经菌液
PCR验证后, 证明该启动子片段已克隆到pMD18-T
载体上。阳性克隆测序结果表明, 该序列长度为
1 635 bp。
2 毛果杨PtAREB9基因启动子的序列分析
通过PLACE (http://www.dna.afifrc.go.jp/
PLACE/)数据库及PlantCARE (http://bioinformat-
ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库对
PtAREB9基因起始密码子ATG上游1 635 bp的启动
子序列进行启动子作用元件的分析。结果表明:
PtAREB9基因启动子序列上存在多个与植物抗逆
功能相关的顺式作用元件, 有厌氧诱导反应过程
中的顺式作用元件A R E和 S A顺式作用元件
TCA-element, 尤其还存在逆境胁迫响应元件TC-
rich repeats、干旱胁迫响应元件CCAAT-box、
MBS和ABA应答元件CE3 (表1)。
3 pBI121-PPtAREB9-GUS植物表达载体的构建及工程
菌制备
为研究PtAREB9启动子的功能, 将pBI121-
GUS质粒与引入酶切位点的PPtAREB9-T重组质粒分
别进行HindIII和BamHI双酶切, 使用T4 DNA连接
酶连接, 新的重组质粒经菌落PCR和双酶切验证
图1 PtAREB9基因启动子的PCR检测
Fig.1 PCR detection of the PtAREB9 promoter
M: DNA Marker DL2000。
表1 毛果杨PtAREB9基因启动子中顺式元件预测
Table 1 Predicted cis-elements in the promoter of the
PtAREB9 gene from P. trichocarpa
元件名称 核心序列 功能注释
ARE TGGTTT 厌氧诱导元件
CE3 GACGCGTGTC ABA应答元件
CCAAT-box CAACGG 干旱应答
MBS TAACTG 干旱诱导元件
TCA-element CCATCTTTTT SA应答元件
CGTCA-motif CGTCA 茉莉酸甲酯应答元件
TGACG-motif TGACG 茉莉酸甲酯应答元件
ERE ATTTCAAA 乙烯应答元件
GARE-motif AAACAGA 赤霉素应答元件
TATC-box TATCCCA 赤霉素应答元件
HSE AAAAAATTTC 高温应答顺式作用元件
LTR CCGAAA 低温应答顺式作用元件
TC-rich repeats ATTTTCTTCA 逆境胁迫应答元件
circadian CAANNNNATC 节律顺式作用元件

植物生理学报1930
(图2-B), 获得植物表达载体pBI121-PPtAREB9-GUS。
采用电击转化法, 将其转入根癌农杆菌EHA105感
受态细胞中, 菌液经PCR鉴定(图2-A), 获得阳性克
隆, 完成工程菌制备。
叶片表达较高, 染色加深, 且茎尖也有表达。相同
胁迫时间下, 200和300 mmol·L-1甘露醇胁迫下的
幼苗叶片、茎尖的染色均有不同程度的加深; 在
300 mmol·L-1甘露醇和SA胁迫下, 根尖表达较高,
颜色加深; 在盐胁迫下, 根上部表达较高, 颜色加
深; 在ABA胁迫下, 根上部和根尖都有表达, 颜色
较深。值得一提的是, 200 mmol·L-1甘露醇胁迫下
的幼苗新生子叶未染色, 而在300 mmol·L-1甘露醇
胁迫下的染色明显(图4)。从总体来看, 甘露醇、
ABA、盐、SA胁迫都能促进GUS的表达。
图2 pBI121-PPtAREB9-GUS的PCR (A)和双酶切(B)验证
Fig.2 Identification of pBI121-PPtAREB9-GUS by PCR (A) and
double restriction-enzyme digestion (B)
M1: DNA Marker DL2000; M2: DNA Marker DL15000。
4 转基因拟南芥植株的获得
用花粉管通道法浸染野生型的拟南芥, 收获
的种子在添加50 mg·L-1 Kan的1/2MS固体培养基
上筛选转染成功的植株, 直到筛选到T3代6个转基
因株系, 并用GUS特异的引物进行PCR验证, 扩增
出相应条带(图3), 证明是转基因成功的植株。
图3 T3代转基因植株的PCR检测
Fig.3 PCR detection of T3 transgenic plants
M: DNA Marker DL2000; +: pBI121-PPtAREB9-GUS; −: 野生型拟
南芥; 1~6: 转基因拟南芥T3代。
5 PtAREB9基因启动子的GUS活性分析
对T3代PPtAREB9-GUS转基因植株进行幼苗期
冷、甘露醇、ABA、SA和盐胁迫处理, 通过显微
镜观察处理前后转基因植株的GUS染色情况, 以
确定启动子表达特异性。由图3可见, 未胁迫时
PPtAREB9-GUS转基因幼苗在叶片、根尖部位表达较
低, 着色较浅; 在甘露醇、ABA、SA、盐胁迫下,
图4 转PPtAREB9-GUS植株在不同胁迫下GUS的组织化学定位
Fig.4 GUS histochemical localization of transgenic PPtAREB9-
GUS plants under different stresses
A: 未处理; B: 200 mmol·L-1甘露醇; C: 300 mmol·L-1甘露醇; D:
200 μmol·L-1 ABA; E: 100 μmol·L-1 SA; F: 150 mmol·L-1 NaCl。
讨　　论
目前, 全球性的环境恶化已经得到了人们的
重视。在影响杨树生长过程的诸多环境因子中,
水是不可或缺的一部分(莫康乐等2014)。因此, 研
究杨树抗旱机理是非常必要的。ABA依赖途径是
干旱胁迫应答途径之一(洪岚等2011)。ABA在植
物干旱适应中很重要, 大量研究表明ABA含量可
作为评价植物抗旱能力的指标之一 (季孔庶等
2006)。AREBs是ABA反应元件结合蛋白。每个
ABF转录因子在不同胁迫条件下的应答反应有不
同的趋势, 比如, ABF2和ABF3在盐胁迫下有明显
的应答反应, ABF4在低温、盐和干旱条件下存在
魏明等: 毛果杨PtAREB9基因启动子的克隆与功能初步分析 1931
明显应答反应(Uno等2000)。有研究表明, 水稻中
bZIP转录因子第三亚族中OsbZIP46是ABF转录因
子相似度比较高的基因, 该基因的过表达在植物
幼苗时期对ABA敏感性较高并在干旱和渗透胁迫
下能够高效表达(Tang等2012)。bZIP转录因子家
族中的水稻OsAREB8基因在植物营养阶段能够响
应干旱胁迫(Maruyama等2012)。
生物在生长发育过程中对外界环境的响应有
着明显的有序性。这种有序性来自于该基因的有
序表达, 这需要归功于启动子对该基因的精确调
控。因此, 研究启动子的功能是研究基因表达特
异性的首要条件。由于启动子中存在着不同的顺
式元件, 因此不同顺式元件调控的方式不同, 有的
是组织特异性启动子, 有的是诱导型启动子, 而干
旱响应的启动子包含保守的干旱响应元件(dehy-
dration responsive element, DRE)和ABRE等。本文
构建了PtAREB9基因的启动子融合GUS表达载体,
通过GUS活性来研究PtAREB9启动子的功能。由
于PtAREB9基因与ABF2同源, 由此推测PtAREB9
与ABF2基因功能相似。预测分析PtAREB9启动子
序列的顺式作用元件, 发现该启动子含有干旱和
A B A应答相关的应答元件 , 如C E 3、M B S、
CCAAT-box、LTR、TCA-element、circadian识别
位点等, 初步推测PtAREB9可能与逆境胁迫下植物
应答相关。所以分析了转PPtAREB9-GUS的拟南芥植
株的GUS活性, 结果显示, 在ABA、盐、甘露醇和
SA胁迫下 , PtAREB9表达量都显著提高 , 表明
PtAREB9基因主要应答于ABA、盐和渗透胁迫。
Fujita等(2005)在之前的研究中已经证明PtAREB9
的同源基因ABF2在ABA、高盐和缺水条件下上调
表达。由于PtAREB9基因启动子中含有SA的应答
元件, 所以转入该启动子的T3代转基因拟南芥在
SA的胁迫下也有明显的反应。Harms等(1995)的
研究表明, SA在环境胁迫反应中是驱动植物防御
基因表达信号传递的重要组成部分。在本研究中
发现 , A B A、盐、甘露醇和 S A胁迫可诱导
PtAREB9启动子在拟南芥叶片和根部的表达, 推测
逆境胁迫下PtAREB9基因主要在毛果杨叶片和根
部诱导表达。在不同胁迫下, 转PtAREB9启动子的
T3代拟南芥根部的表达区段不同, 推测PtAREB9在
毛果杨根上部及根尖部位的表达机制可能不同。
有研究表明, bZIP转录因子家族中的ABI5在ABA
胁迫下在根部表达较强 (Yang等2011)。水稻
OsAREB1基因的表达受ABA、盐和干旱的诱导,
在水稻根、茎、叶中都有表达, 但根中表达量最
高(金晓芬2008)。在本研究中发现, 200 mmol·L-1
甘露醇胁迫下转PPtAREB9-GUS的幼苗新生子叶中
GUS未表达, 300 mmol·L-1甘露醇胁迫下的表达较
高, 说明新生子叶表达可能存在一定的阀值, 当甘
露醇浓度达到一定程度时, PtAREB9启动子才可以
驱动GUS基因在幼苗新生子叶中的特异表达。有
研究表明, 在一定干旱阈值(drought threshold)胁迫
范围内, 很多植物进行相关抗旱基因的表达, 随后
产生一系列生理、生化及形态结构等方面的变化,
从而表现出抗旱性的综合性状(赵雅静等2009)。
值得一提的是, 在ABA和渗透胁迫下, 转基因T3代
拟南芥叶片的GUS表达情况显著提高, 可以推测该
基因可能通过ABA依赖途径来控制叶片气孔开
关。有研究证明, 在逆境条件下, ABA在植物体内
合成或者已经存储的ABA被释放, 诱导气孔开关,
从而有效调控植物体内水分平衡, 来达到响应干
旱胁迫的目的(Liang等2015)。
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