全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 465~470　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0544 465
收稿 2014-11-25　　修定 2015-03-12
资助 湖南省教育厅科学研究重点项目(2012A0146)和湖南省科
技厅科技计划项目(2013TZ2024)。
* 通讯作者(E-mail: ma_yingzi@163.com; Tel: 0731-85623494)。
蛇足石杉的离体培养
马英姿*, 刘江海, 许欢, 刘芬
中南林业科技大学生命科学与技术学院, 长沙410004
摘要: 本研究以蛇足石杉活体顶芽为外植体, 研究了其表面及内生菌灭菌方法、外植体的增殖和生根方法。结果表明, 表
面灭菌后再采用0.5 mg·L-1孔雀石绿及100 mg·L-1的AAS联合灭菌, 可获取较好的外植体灭菌效果。灭菌后的外植体仍带有
一种内生真菌, 但外植体可与该内生菌共生培养, 并获得了蛇足石杉的增殖侧芽, 侧芽极易从主茎分离, 且生根率较顶芽高,
30 d生根率可达90%, 培养的根也呈二叉分枝状。
关键词: 蛇足石杉; 离体培养; 内生真菌; 共生
In Vitro Culture of Huperzia serrata
MA Ying-Zi*, LIU Jiang-Hai, XU Huan, LIU Fen
College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China
Abstract: In this study, the terminal buds of Huperzia serrata were used as explants, to study the surface and
endophytic bacteria sterilization, the explant proliferation and rooting method. The results showed that after the
surface sterilization, the combined sterilization of 0.5 mg·L-1 malachite green and 100 mg·L-1 AAS could obtain
good effect on sterilization of explant. After sterilized, the explants still contained an endophytic fungus, but
could symbiosis culture with the endophytic fungus. And the proliferation buds of H. serrata were obtained,
these buds were separated from the stem easily, had a higher rooting rate than that of terminal buds. The rooting
rate reached 90% after 30 d, and the root were two forks branch.
Key words: Huperzia serrata; culture in vitro; endophyte; symbiotic
蛇足石杉, 系石杉科石杉属多年生植物, 又名
千层塔、金不换等, 民间常用于治疗痈疖肿毒、
跌打损伤等症(余红英等2011)。蛇足石杉内含石
杉碱甲, 它是乙酰胆碱脂酶的有效抑制剂, 能阻止
体内乙酰胆碱的衰竭, 被广泛用于治疗阿尔茨海
默氏症疾病(张守圭1985; Wang和Tang 2005)。蛇
足石杉在自然界中生长缓慢, 其孢子约需15年才
能自然萌发(郭斌等2009; Ma和Gang 2008), 过度地
开发采集, 使该种药材资源的再生受到了极大限
制。因此, 建立合适的人工繁殖体系成为解决和
保护蛇足石杉野生资源的重要途径。
关于蛇足石杉的繁殖问题一直受到关注, 盛
束军等(2000)及覃大吉等(2010)研究了蛇足石杉的
扦插繁殖, 王德立和冯锦东(2011)研究了蛇足石杉
的芽胞繁育, 国内还有多个实验室对蛇足石杉孢
子囊进行诱导培养(马华升等2008; 李贵等2009)。
但仅有韦景枫等(2011)以蛇足石杉孢子囊为外植
体, 诱导获得了蛇足石杉原叶体, 但未从原叶体获
取孢子体。包日双等(2012)对蛇足石杉孢子进行
诱导获得了原叶体, 并将原叶体诱导获得了少量
的孢子体。
由于蛇足石杉内生菌丰富, 而植株的叶片薄,
消毒极为困难, 成为蛇足石杉组织培养研究的最
大障碍。梁昊(2010)以茎尖为外植体建立了蛇足
石杉的组织培养体系, 但并未获得增殖侧芽, 因此
也未能达到组织培养快速繁殖的目的。国外对同
属的另一种石杉Huperzia selago的顶芽进行了离
体培养研究(Szypula等2005), 在其顶芽处培养出绿
色小球, 并进一步培养成二叉分枝的芽。目前, 尚
未有关于石杉属植物成功培养侧芽的报道。因此,
蛇足石杉的组织培养研究还有待进一步的努力。
本研究以蛇足石杉顶芽为外植体, 通过消毒后进
行离体培养, 首次获取了携带一种内生真菌共生
的试管苗, 并对试管苗进行培养观察, 研究其不同
生长形态及增殖、生根等过程, 为蛇足石杉的快
速繁殖和资源开发提供重要参考依据。
植物生理学报466
材料与方法
1 材料
蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb.) Trev.]活
体植株采自湖南省浏阳大围山。材料由中南林业
科技大学喻勋林教授鉴定。
2 蛇足石杉外植体消毒
2.1 外植体表面灭菌
剪取蛇足石杉顶芽3 cm长, 先用清洁剂在水
中清洗, 然后在自来水下冲洗3 h, 之后将材料浸入
0.01 mol·L-1 HCl+5% NaClO+0.0024 mol·L-1柠檬酸
配成的溶液中1 min, 再将材料先后置于70%乙醇
中1 min, 5% NaClO中15 min, 7% H2O2中10 min, 依
次消毒, 无菌水冲洗干净后, 接种于1/2MS培养基
中, 在25 ℃、5~10 µmol·m-2·s-1、12 h·d-1的光照条
件下培养20 d。
2.2 内生菌灭菌培养
将培养20 d后的表面没有微生物污染的顶芽
移入含有不同浓度的孔雀石绿(malachite green ox-
alate)和混合抗生素(AAS)的1/2MS培养基中进行
内生菌消毒, 每100 mg AAS溶液中包含30 mg青霉
素、50 mg的链霉素及125 µg的两性霉素, 将孔雀石
绿配成0.1、0.5和1.0 mg·L-1的浓度, AAS配成50、
100和500 mg·L-1的浓度单独使用或联合使用(表
1)。每种处理10瓶, 每瓶接种1个外植体, 实验重复
3次。接种后置于2.1节中同样的条件下培养20 d。
3 外植体的初代培养
将进行过2次消毒后的无明显感染的外植体,
修剪因消毒引起的黄叶及茎基部, 转入不同配方
的改良MS培养基(表2)中。培养条件同2.1节, 30 d
后统计外植体存活率。存活率=存活的外植体数/
接入初代培养基中的外植体数×100%。
所有培养基中均添加7 g·L-1琼脂、20 g·L-1蔗
糖, 高压灭菌前调pH值为5.75, 再在121 ℃、1.1
kg·cm-2条件下灭菌20 min。
4 试管苗的继代培养
将经过初代培养后存活下来的外植体在
1/2MS培养基上继续培养, 每60 d换一次培养基, 观
察其生长中出现的形态变化, 包括分枝、增殖及
孢子的形成过程。
5 试管苗的生根培养
选择MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS作为生根
表1 灭菌后蛇足石杉的外植体存活率
Table 1 Explants survival rate of H. serrata
after sterilization
编号
孔雀石绿浓 AAS浓度/ 外植体感 外植体存
度/mg·L-1 mg·L-1 染率/% 活率/%
1 0.1 0 100 0
2 0.5 0 100 0
3 1.0 0 0 0
4 0 50 100 0
5 0 100 100 0
6 0 500 100 0
7 0.1 50 100 0
8 0.1 100 100 0
9 0.1 500 90 10
10 0.5 50 80 20
11 0.5 100 80 20
12 0.5 500 0 0

基本培养基, 截取培养的蛇足石杉2~3 cm的顶芽
及1.5~2 cm的侧芽, 分别接种到生根培养基中。每
种生根培养基接种10瓶, 每瓶接种1株, 试验重复3
次, 60 d后统计生根率。基本培养基中添加20 g·L-1
蔗糖和2.0 mg·L-1谷氨酰胺。
实验结果
1 蛇足石杉外植体的灭菌
成功培养蛇足石杉试管苗的非常关键的环节
就是对初始外植体的有效消毒。经过表面消毒后
培养20 d的培养, 40%的外植体没有微生物污染迹
象; 10%的外植体无感染, 但出现消毒过度逐渐死
亡的现象。
用孔雀石绿和AAS对植物内生微生物进行消
毒的方法已广泛被应用(Szypula等2005)。将培养
20 d后的表面没有微生物污染的顶芽移入含有不
同浓度的孔雀石绿和AAS的1/2MS培养基中进行
内生菌消毒。
如表1所示, 单独使用0.1和0.5 mg·L-1的孔雀
石绿, 及单独使用AAS进行内生菌灭菌时, 感染率
达100%。单独使用1.0 mg·L-1的孔雀石绿消毒, 或
0.5 mg·L-1孔雀石绿+500 mg·L-1 AAS混合消毒时,
外植体没有被感染的现象, 但所有的外植体在14 d
后迅速死亡。只有当0.5 mg·L-1 孔雀石绿+50、100
mg·L-1 AAS联合使用时, 获得最佳的内生菌灭菌效
果, 通过14 d的培养后, 20%无感染的外植体存活。
马英姿等: 蛇足石杉的离体培养 467
2 蛇足石杉外植体的初代培养
孔雀石绿和AAS联合杀灭内生菌, 但也会对
植株造成损害, 故时间不宜过长。本研究在添加
孔雀石绿和AAS混合液的1/2MS培养基中培养14 d
后, 转入初代培养基中进行初代培养, 30 d后统计
外植体的存活率。如表2所示, 培养30 d后, 发现
MS基本培养基及加植物激素的培养基内的外植体
全部逐渐变褐死亡。1/2MS和1/4MS培养基中都有
外植体存活, 但1/2MS培养基中的外植体存活率可
达80%, 比1/4MS培养基的存活率高, 且外植体在
1/2MS培养基内的生长状态较1/4MS好。
可以形成2个侧芽。
3.1 侧芽的分离生长培养
将外植体初代培养形成的侧芽从母株上分离,
接种在新的1/2MS培养基上, 分离侧芽时发现, 侧
芽与母体仅有较细的维管束相连, 用镊子轻轻撕
扯, 侧芽即可脱离母体。
侧芽接种后生长良好, 生长状况有两种: 一是
从母株基部产生的侧芽, 在分离时携带了内生真
菌, 培养一段时间后, 侧芽长势良好, 生长成幼苗
同时,内生真菌也继续生长(图1-C和D); 二是在母
株中部或上部产生的侧芽, 分离培养后, 侧芽生长
后没有发现内生菌出现(图1-E), 说明内生真菌存
在于蛇足石杉植株的下半部, 并没有侵入外植体
的上端, 因而也没有侵入上部产生的侧芽。
侧芽从母体分离后培养, 初期生长相对较快,
30 d后伸长约1.5 cm; 60 d顶芽开始分化, 形成新的
二叉分枝; 90 d后, 新分化的二叉分枝芽伸长约3
cm (图1-E)。
3.2 新二叉分枝的继代培养
为了使新分化的二叉分枝(第1次分叉)芽能更
好的生长, 当二叉分枝芽长到3 cm左右, 将其从分
叉处剪断 , 分离成2株新的植株 , 又分别接种于
1/2MS培养基上进行继代培养。培养60 d后又可形
成新的二叉分枝(第2次分叉); 90 d后可同样从分叉
处将新的顶芽剪下, 再次分离培养可形成新的二
叉分枝(第3次分叉)。试管苗在3次分叉后, 生长时
形成新的枝条, 在外形上基本相同, 无明显差异。
3.3 侧芽3次二叉分枝后的成熟生长
将第3次二叉分枝生长后的顶芽分离后培养,
苗的生长速度减慢, 在30 d后, 顶芽的分化缓慢; 60
d后, 顶芽逐渐开始出现新的生长, 且新产生的叶
形也出现了明显的差异, 新产生的叶为小叶, 且在
叶腋内开始分化产生孢子囊(图1-H和I); 继续培养
至90 d, 可见枝的上端多处产生新的侧芽(图1-H)。
4 试管苗的生根培养
将蛇足石杉新芽接种到生根培养基中, 观察
不定根的生长情况, 40 d后发现产生的根也出现二
叉分枝状(图1-G)。试管苗的生根情况依试管苗的
来源而不同, 生根培养的试管苗来源有两种: 一种
是主枝上产生的侧芽, 一种是截取主枝的顶芽。
实验结果表明, MS基本培养基不利于蛇足石杉试
表2 不同基本培养基对蛇足石杉初代成活率的影响
Table 2 Effects of different media on primary
explants survival rate of H. serrata
培养基
肌醇浓度/ 烟酸浓度/ IBA浓度/ KT浓度/ 外植体存
mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 活率/%
MS 100 0.5 0 0 0
1/2MS 100 0.5 0 0 80
1/4MS 100 0.5 0 0 50
1/2MS 100 0 0.05 1.0 0
1/4MS 100 0 0.05 1.0 0

3 蛇足石杉的侧芽(增殖)培养
将初代培养的外植体继续在原培养基中培养,
约60 d后, 发现有黑色内生真菌在原始外植体的茎
基部出现, 生长缓慢; 约90 d后, 内生菌生长成一团
愈伤组织状堆积在茎基, 对外植体的生长没有不
良的影响, 其菌种的鉴定将另文发表。
在内生菌生长的同时, 外植体并没有出现明
显的不良变化, 说明该内生真菌对外植体没有不
良影响, 故继续培养。约90 d后, 外植体开始出现
生长变化, 主要有两种变化类型: 一种为外植体本
身没有出现明显的生长, 但靠近茎基部的同一节
点处开始分化出新芽, 且新芽的数量较多, 最多可
达到7个(图1-A), 丛芽状。内生菌的存在没有影响
新芽的生长, 新芽产生后生长60 d, 芽高度可达2~3
cm, 同时原始外植体的茎叶出现枯黄, 逐渐趋于死
亡, 这可能是由于新芽较多, 在基部将营养吸收,
主茎得不到足够的营养导致死亡。另一种变化为
外植体有少量的生长, 且在茎的上部形成了多个
小侧芽(图1-B), 一个节点处可以形成1个侧芽, 也
植物生理学报468
图1 不同培养时期蛇足石杉试管苗的形态变化
Fig.1 Morphological changes of H. serrata tube seedling in different culture duration
A: 外植体基部产生多个侧芽; B: 外植体上部不同点产生多个侧芽; C: 基部侧芽分离后继代培养(含内生菌); D: 带内生真菌侧芽继代
培养后长势良好形成二叉分枝; E: 上部侧芽与母体分离后继代培养(不含内生菌); F: 侧芽继代培养90 d后, 顶芽展开后出现了四叉分枝; G:
侧芽生根培养后产生二叉分枝状的不定根; H: 第3次二叉分枝后的顶芽再次继代培养, 出现了大小叶之分, 叶腋内形成了孢子囊, 240 d后
在枝条上部又产生了多个侧芽; I: 第3次二叉分枝后的顶芽分离后再次继代培养120 d, 产生了三叉分枝(a)、二叉分枝及大叶(b)和小叶(c)
交替现象。
管苗的生根, 60 d后侧芽及顶芽的生根率都为0。
来源于侧芽的试管苗比来源于顶芽的试管苗更容
易生根 (表3 ) , 60 d后来源于侧芽的试管苗在
1/2MS、1/3MS、1/4MS的基本培养基中的生根率
都可达30%, 而来源于顶芽的试管苗在1/2MS、
1/3MS和1/4MS的基本培养基中的生根率仅达
10%。在基本培养基中添加IBA 1.0 mg·L-1+2.0
mg·L-1谷氨酰胺, 对试管苗的生根率有明显的促进
作用, 其中在1/3MS基本培养基上添加的效果最
好, 侧芽的生根率可达90%, 顶芽的生根率也可达
30%。分析其原因, 可能是侧芽的基部仅有细小的
部分与主枝相连, 茎基部的伤口创面细小, 幼嫩,
较易生根。
5 植株培养过程中的形态发生
5.1 侧芽的发生
在自然界中, 蛇足石杉的生长呈二叉分枝状,
除此以外, 仅有关于芽胞的形成报道(王德立和冯
锦东2011), 尚未发现有侧芽的形成。自然生长中,
蛇足石杉叶腋内着生半月形孢子囊, 无腋芽存在,
表3 不同培养基对蛇足石杉生根培养的影响
Table 3 Effects of different media on rooting of H. serrata

培养基
生根率/%
侧芽 母株顶芽
MS 0 0
MS+1.0 mg·L-1 IBA+2.0 mg·L-1谷氨酰胺 0 0
1/2MS 30 0
1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA+2.0 mg·L-1谷氨酰胺 60 10
1/3MS 30 10
1/3MS+1.0 mg·L-1 IBA+2.0 mg·L-1谷氨酰胺 90 30
1/4MS 30 10
1/4MS+1.0 mg·L-1 IBA+2.0 mg·L-1谷氨酰胺 40 30

因此, 无法像其它高等植物一样采用扦插繁殖而
产生新植株个体。曾汉元和张伍伯(2008)对蛇足
石杉的营养繁殖进行了研究, 发现去顶芽的茎段
扦插后可以长根, 但扦插2年后仍未长出新芽。本
研究发现, 蛇足石杉试管苗在生长过程中, 主茎上
的某些叶腋内不产生孢子囊而能产生侧芽 (图
1-A、B和H), 且侧芽的数量不定, 有1~7个, 发生的
马英姿等: 蛇足石杉的离体培养 469
部位可以是枝条的基部, 也可以在枝条的上部。
这些侧芽的基部与主茎的连接细弱, 其侧芽基部
仅有细弱的维管束与主茎相连, 用镊子轻轻撕扯,
即可将侧芽从主茎上分离, 侧芽脱离母体后生长
较好, 且较易生根。
5.2 顶芽的多叉分化
蛇足石杉的正常生长为二叉分枝, 即每次其
顶芽分化出2个新芽, 但我们在培养过程中发现, 除
了形成正常的二叉分枝外, 试管苗还出现了三叉分
枝和四叉分枝, 即一次从顶芽分化出3个新芽(图
1-I)和4个新芽(图1-F)。多叉分枝形成前, 其顶芽的
分化时间较长, 比正常的产生二叉分枝顶芽的分化
时间长, 形态也较正常的二叉分枝芽膨大, 这种变
异是我们期待的, 但多叉分枝的顶芽经过继代培养
后, 又可恢复到正常的二叉分枝, 说明这种变异不
具有稳定的遗传性。多个顶芽的形成可能与培养
条件有关, 特别是与光照强度增强有关。
5.3 大小叶交替出现及孢子囊的产生
自然界中多年生蛇足石杉茎上有大叶与小叶
交替产生的现象, 通常每年各产生一次, 每年产生
的所有大叶或所有小叶称为一个叶层。齐耀和冯
锦(2011)对没有出现明显叶层分化的小苗称为幼
苗, 有叶层但没有生成孢子囊的植株称为幼株, 有
孢子囊产生的植株称为成株。本研究中发现, 试管
苗在培养在1年后, 明显出现了叶层的分化(图1-H
和I)。试管苗第1次孢子囊的形成, 在二月底或三月
初开始分化, 七、八月生长成熟, 但随着进一步的
培养, 试管苗产生孢子囊的时间并不确定, 可以在
任何季节形成, 这可能是由于培养条件与外界自然
条件不同, 没有四季温度和光照的变化原因。
讨　　论
获得具有完全生长活性的无菌外植体是蛇足
组织培养初始取得成功的重要因素。而蛇足石杉
的叶片表面角质层薄, 极易被消毒过度而死亡。
为了有效地进行表面消毒, 本研究将蛇足石杉顶
芽依次浸泡在: 次氯酸钠液、柠檬酸、酒精和过
氧化氢等几种不同的溶液中进行表面消毒。以往
的研究认为, 在建立无污染的新芽培养过程中主
要的困难是由内生细菌和真菌引起的污染。本研
究对外植体的内生菌消毒方法进行了优化, 采用
两性霉素B、链霉素、青霉素配成的AAS消毒液
和孔雀石绿对外植体内生菌的抗菌效果进行研究,
发现同时使用剂量为0.5 mg·L-1的孔雀石绿与50和
100 mg·L-1的AAS消毒液, 能达到最佳的内生菌杀
菌效果。
β-内酰胺类抗生素在高浓度下依靠与核糖体
30S亚基的结合来阻止叶绿体分离, 这也是为高剂
量的青霉素可能导致外植体死亡的原因, 但是剂
量在100 μg·mL-1的时候对外植体几乎没有损害, 青
霉素也可能是在组织培养中唯一能够安全使用的
抗生素。
本研究中有两个创新点, 一是证明了蛇足石
杉的组织培养时可以携带部分内生真菌共同培养,
当内生真菌灭菌不彻底时, 可以继续培养观察, 只
要内生真菌的生长速度不影响外植体的生长即可
继续培养。本研究中, 外植体内还存留了一种内
生真菌(子囊菌纲), 但事实证明, 真正的内生真菌
并不会影响外植体的生长, 因为内生真菌在植物
体内生的长是缓慢的, 离开植物体后在植物培养
基上的生长也很慢, 可能对外植体的侧芽分化反
而有促进作用。本研究的另一个创新点, 是在培
养过程中获得了蛇足石杉的侧芽, 在自然界, 蛇足
石杉的叶腋内是着生的肾形的孢子囊, 不形成侧
芽, 只在8月左右可在顶芽处形成少量的芽孢, 但
在本研究中, 在试管苗的培养过程中获得了不同
部位的侧芽, 且在茎的同一个节点上可以同时长
出多个侧芽, 这种变化正是蛇足石杉组织培养所
期待的结果, 为以后蛇足石杉的组织培养提供了
很好的参考价值。
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