全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 1期，2010年 1月 2 9
收稿 2009-08-31 修定 　2009-11-18
资助 国家科技攻关课题(2001BA701A59)和国家科技支撑计
划(2 006 BA1 06 A15 )。
* 通讯作者(E-mail: sqcau@126.com; Tel: 010-62732775)。
种皮蜡质与乌拉尔甘草种子抗菌及抗老化能力的关系
张文静, 孙群 * , 王建华, 孙宝启
中国农业大学农学与生物技术学院植物遗传育种系, 农业部基因组学与遗传改良重点实验室, 北京市作物遗传改良重点实
验室, 北京 100193
提要: 本文研究了乌拉尔甘草种子种皮蜡质的厚度与蜡质抑菌效果、蜡质与种子抗老化能力和种子吸水能力的关系。结
果表明: 用浓硫酸浸泡2~3 min可完全除去蜡质, 蜡质的厚度约为30 μm; 接种菌液后, 脱蜡种子在PDA培养基上形成的青霉
和曲霉菌斑的直径显著大于不脱蜡的种子形成的菌斑直径, 但蜡质的体外抗菌能力不明显; 随着老化时间的延长, 脱蜡种
子的含水量增加速度和发芽率下降速度明显快于未脱蜡种子, 且在湿度较高的环境下, 脱蜡种子的平衡水分比未脱蜡种子
显著升高, 说明蜡质在一定程度上可以保护种子不易受外界湿度的影响。
关键词: 乌拉尔甘草; 种子; 蜡质; 抗菌; 抗老化
Relation between Surface Wax and the Ability of Antisepsis and Anti-Aging of
Licorice (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) Seeds
ZHANG Wen-Jing, SUN Qun*, WANG Jian-Hua, SUN Bao-Qi
Department of Plant Genetics and Breeding, College of Agronomy and Biotechnology, Key Laboratory of Crop Genomics and
Genetic Improvement of Ministry of Agriculture, Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, China Agricultural University,
Beijing 100193, China
Abstract: The relation between surface wax and its ability of antisepsis, anti-aging and water-content in licorice
(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) seeds was analyzed. The result showed that the wax thickness of seed surface
was about 30 μm, and it could be completely removed by soaked with concentrated sulfuric acid for 2–3 min.
After inoculated with mildew, the dewaxed seeds formed bigger blaques on PDA medium than the control seeds,
but the antiseptic effect of wax in vitro was not obvious. With aging, the water content of dewaxed seeds rose
more quickly than control, with much more quickly declining in germination rate. Under high humidity
environment, the equilibrium water content of the dewaxed seeds was significantly higher than the original
seeds, indicated that the wax could protect the seeds from intrusion of external humidity.
Key words: licorice (Glycyrrhiza uralensis); seed; wax; antiseptic; anti-aging
硬实是豆科植物种子的一种普遍现象, 其活力
和耐贮藏能力均显著高于非硬实种子(曹帮华等
2005; 徐本美等 2005; 田娟等 2007)。一般长寿命
种子均为硬实种子, 如古莲、羽扇豆硬实种子寿命
可达几百年甚至上千年, 而一般作物种子在同样的
条件下贮藏不出数年便已不能发芽(Shen-Miller等
1995)。室温下保存 4年的大豆硬实种子发芽率可
保持在90%以上, 而非硬实种子保存2年左右即失
去生活力(王金龙 1999)。硬实种子的这种抗衰老
特性是否与种皮的蜡质有关, 尚有待研究。植物叶
片或茎秆蜡质的抗逆性研究表明, 蜡质具有防止水
分丧失、防御病菌侵入和抵抗紫外线辐射的作用
(Mariani和Wolters-Arts 2000; Sieber等 2000)。梁
炫强等(2003)报道, 花生的种皮蜡质含量与其抗黄
曲霉感染有关。本实验前期的研究(杨力钢等
2006)也表明, 甘草硬实种子的带菌量极少, 这是否
与蜡质有关仍待研究。为此, 本文比较乌拉尔甘草
种子脱蜡与否对抵御霉菌侵染、抗老化能力以及
种子含水量的影响, 探讨蜡质在种子抗老化和抗逆
中的作用。
材料与方法
乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)种子
于2007年采自甘肃省张掖地区, 从中选择完整无破
损、色泽相似(棕绿色)和大小均一(直径为 2.5~3.0
mm)的种子进行实验, 种子千粒重约 12.0 g。
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用扫描电镜观察种皮结构时, 取 20粒乌拉尔
甘草种子, 用导电胶粘在样品台上, 用 IB-5型离子
镀膜仪喷涂厚约 2.3 nm的金膜后, 置于 S-570型扫
描电子显微镜下观察种子表皮结构, 并记录和拍
照。
脱蜡时, 用过量浓硫酸浸泡种子, 浸泡时间分
别为 1、2、3、4、5和 10 min, 然后用清水冲净
种子, 并迅速擦干和晾干种子表面水分。然后将种
子用导电胶粘在样品台上, 用IB-5型离子镀膜仪喷
涂金膜, 用扫描电镜检测种皮蜡质的残留。取浓硫
酸处理 1、2、3和 5 min的种子进行吸胀实验, 各
取100粒按照上述方法脱蜡的种子用过量蒸馏水浸
泡, 每天记录吸胀种子的数目, 绘制吸胀率曲线。
以未脱蜡种子为对照, 重复 3次。
检测蜡质厚度时, 准确称取 10 g甘草种子, 用
浓硫酸处理2 min, 脱去蜡质后, 将种子擦干和晾干
后, 室内放置 2周备用。徒手切片, 切取种皮平面
部分, 用游标卡尺测量 30粒种子的种皮厚度。以
未脱蜡种子作为对照, 计算蜡质部分的厚度, 重复
3 次。
作抑菌实验时, 将未脱蜡种子和脱蜡种子用
1%次氯酸钠消毒10 min, 用无菌水清洗后, 分别在
浓度相同[107个(孢子)·mL-1]的青霉菌液和曲霉菌
液中浸泡4 h, 取出晾干, 接种在马铃薯葡萄糖琼脂
(PDA)培养基上, 放在 25 ℃黑暗条件下培养 4 d观
察真菌生长情况, 并测量菌斑直径。每组 50粒种
子, 重复3次。
测定蜡质体外抑菌能力时, 参考梁炫强等
(2003)的方法, 先将种子放在氯仿中浸泡 1 d, 捞出
种子, 待氯仿挥发完全后, 再用3 mL氯仿溶解蜡质,
加入到 PDA培养基中, 调整蜡质浓度为 1 mg·mL-1,
将培养基倒入培养皿, 敞口放置2 h, 待氯仿挥发完
全后在培养基上滴加10滴青霉菌液[每滴10 µL, 浓
度为 107个(孢子)·mL-1], 放置于 25 ℃黑暗条件下
培养 4 d后观察霉菌生长情况, 并测量菌斑直径。
以不添加蜡质的培养基为对照, 重复 3次。
作老化实验时, 将未脱蜡种子和脱蜡种子于温
度为 42 ℃和相对湿度为 100%的条件下分别老化
1、2、3和 4 d后, 计算种子含水量变化, 人工切
破种皮后测定种子的发芽率(尹燕枰和董学会
2008)。
测定脱蜡和未脱蜡种子在不同相对湿度条件
下的平衡水分时, 首先根据国际种子检验协会
(International seed testing association, ISTA)种子检
验规程(2003)的方法, 将种子放在 105 ℃的烘箱中
烘干 17 h, 测定种子原始含水量。再取 5只广口
瓶, 分别加入相对湿度为 10%、30%、50%、70%
和 90%的硫酸溶液各 100 mL。分别称取 3 g (准
确到 0.001 g)脱蜡和未脱蜡的种子, 放入尼龙网袋
中。然后将尼龙网袋吊在不同相对湿度的广口瓶
内, 瓶口盖严, 置于 20 ℃的恒温箱内。第 12天称
重, 计算种子的含水量, 重复 3次。
实验数据用DPS (data processing system)数据
处理系统进行方差分析和多重比较。
结果与讨论
1 种皮蜡质的电镜观察与种皮厚度
扫描电镜观察表明甘草种子表面覆盖有大量
的鱼鳞状蜡质(图 1), 并散布有不定形的蜡质(呈水
晶状、片状、点状等多种形态)。经二甲苯、三
氯甲烷、丙酮、乙醚、石油醚等溶剂以及超声
处理后, 可除去部分蜡质, 但均未除净。浓硫酸处
理 2 min和 3 min均能除去种子表皮蜡质, 种皮的
角质层均明显可见, 在实验所用的10粒种子表面均
未发现破坏孔(图2), 说明这样处理的时间不会损伤
角质层, 角质层内镶嵌的一些内蜡质也同时被除
去。处理时间达到 4 min及以上时, 角质层出现轻
微浅裂孔; 处理时间过短, 种子上还存在较多的残
存蜡质, 且大部分种子只是除去了外蜡质, 内蜡质
图 1 甘草种子表面上的蜡质
Fig.1 The surface wax on licorice seed
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依然保持完整。本文结果表明甘草种皮蜡质厚度
约为 30 µm。
图 2 浓硫酸处理 2 min后的甘草种子表皮
Fig.2 The licorice seed surface after treatment with concen-
trated sulfuric acid for 2 min
2 蜡质与种子抗菌能力的关系
脱蜡种子与对照(未脱蜡种子)接种青霉和曲霉
并在PDA培养基上培养4 d后, 脱蜡种子形成的青
霉菌斑和曲霉菌斑(其直径分别为 1.59 cm和 1.24
cm)均显著大于未脱蜡种子形成的青霉菌斑和曲
霉菌斑(其直径分别为1.47 cm和1.21 cm) (P>0.05),
说明种子表皮蜡质具有一定的抗菌能力。为了排
除种子内含物外泌对于实验结果的影响, 仅测量实
验过程中未吸胀种子周围形成的菌斑大小。此外,
就蜡质的体外抑菌能力来说, 添加蜡质与未添加蜡
质的培养基上菌斑的平均直径分别为 1.37 cm和
1.38 cm, 没有显著差异, 说明种皮蜡质并不含有抗
菌的化学物质, 而对照种子表现出的抗菌性可能是
蜡质起到了机械阻碍霉菌侵染的作用。
3 蜡质与种子耐老化的关系
随着老化时间的增加, 种子发芽率逐渐降低, 与
对照种子相比, 脱蜡种子发芽率降低的幅度更大(表
1), 说明蜡质的存在能够提高种子的抗老化能力。
表 1 种子老化过程中的含水量和发芽率变化
Table 1 Changes of water content and germination during aging of licorice seeds
发芽率 / % 含水量 / %
老化时间 /d
对照 脱蜡种子 对照 脱蜡种子
0 92±1.9 92±1.9 7.87±0.17 9.30±0.07**
1 94±4.3 74±10.0* 7.87±0.00 9.81±0.29**
2 82±10.0 66±10.0* 7.87±0.00 10.78±0.42**
3 78±5.5 56±7.3* 8.25±0.20 11.68±0.84**
4 66±7.6 56±3.0 8.49±0.67 14.38±1.20**
　　表中 *表示与对照存在 0.05 水平上的显著差异, **表示与对照存在 0.01 水平上的显著差异。
对老化过程中种子含水量的测定发现, 脱蜡种子的
含水量增加更快, 而对照种子含水量的增加比较缓
慢, 变化幅度很小(表 1)。
4 蜡质与种子吸湿性的关系
从图 3和图 4可以看到: (1)用浓硫酸处理 1
min, 即蜡质尚未除净的种子, 吸胀速率与对照没有
差异, 但是处理 2 min即除去蜡质的种子的吸胀速
率显著快于未除蜡质的种子(图3), 说明蜡质起到了
延缓水分进入种子的作用。处理 5 min的种子吸
胀速率快于处理2 min的种子(图3), 这可能与处理
时间长, 种子表皮形成破坏孔有关系。(2)脱蜡种子
更易受到环境湿度的影响。在相对湿度为 10%的
环境下, 脱蜡种子的平衡水分为 3.75%, 未脱蜡种
子的平衡水分为 4.11%, 方差结果表明二者没有显
著差异; 相对湿度超过 50%以后, 脱蜡种子的平衡
水分呈直线上升; 相对湿度为 90%时, 脱蜡种子的
平衡水分达到15.18% (图4), 而一般作物种子的安
全贮藏水分标准仅为 12%~13%。相比脱蜡种子，
未脱蜡质的种子的平衡水分变化范围较小, 在相对
湿度超过 50%以后, 其平衡水分变化很小, 一直保
持在 8.50%以下。这些显示, 有蜡质的甘草种子
不易受外界湿度的影响, 因而其耐老化能力高。
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图 4 脱蜡种子与对照种子在不同相对湿度中含水量的变化
Fig.4 Changes in water contents of dewaxed and control
seeds at different relative humidity
　　图中 *表示与对照存在 0.05 水平上的显著差异, **表示与
对照存在 0 . 0 1 水平上的显著差异。
参考文献
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图 3 蜡质对乌拉尔甘草种子吸水性的影响
Fig.3 Effect of wax on water uptake of licorice seeds
图中 *表示与对照存在 0 .0 5 水平上的显著差异。