全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (11): 1749~1752　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0316 1749
收稿 2014-07-02　　修定 2014-10-16
资助 西南大学实验教改项目、农业部中华农业科教基金(NKJ-
201203022)和重庆市精品资源共享课(29号: 植物生理学)。
* 通讯作者(E-mail: libangxiu@126.com; Tel: 023-68250794)。
蔬菜硝酸盐含量测定方法的改进
李帮秀*, 张贺翠, 王三根, 万华方, 杨昆, 刘文清
西南大学农学与生物科技学院, 重庆北碚400716
摘要: 针对水杨酸消化比色法测定植物体内硝酸盐含量中存在的问题, 经过优化筛选, 将此测定方法的提取条件优化为: 温
度90 ℃、时间30 min; 每10 g绿色蔬菜加入0.2 g活性炭能消除颜色的影响, 回收率达到96%。
关键词: 蔬菜; 硝酸盐; 消化比色法
An Improved Testing Method for Determining Nitrate Contents in Fresh Vege-
table
LI Bang-Xiu*, ZHANG He-Cui, WANG San-Gen, WAN Hua-Fang, YANG Kun, LIU Wen-Qing
College of Agronomy and Biothechnology, Southwest University, Beibei, Chongqing 400716, China
Abstract: In order to solve the problems of nitrate contents in fresh vegetables, the contents of nitrite in the dif-
ferent vegetables in storage were studied by visible spectrophotometry method in this paper. The results showed
that the stability was good and the absorbance fluctuates was at 90 ℃, the time of chromogenic reaction was 30
min, and the recovery was up to 96% when we added 0.2 g activated carbon if the darker material was 10 g.
Key words: fresh vegetable; nitrate nitrogen; visible spectrophotometry method
人类从蔬菜中摄入硝酸盐占摄入总量的72%~
94% (吴大付等2010)。研究表明, 食物中的硝酸盐
在体内还原成亚硝酸盐后, 可在胃酸的作用下与
仲胺等胺类化合物反应生成N-亚硝基化合物, 引
起核酸代谢紊乱或突变, 从而诱发动物消化器官
癌变(陈君石和闻芝梅1999; 皇甫超申等2009), 并
有造成胎儿畸形的危险(任敬红2002)。人体中的硝
酸盐在细菌作用下被还原成亚硝酸盐进入血液后,
与血红蛋白强有力结合, 使其失去携氧能力, 导致
高铁血红蛋白症, 严重者可致死亡(王利群等2003);
联合国世界卫生组织和粮农组织早在1973年就制
定了食品中硝酸盐的限量标准: 人体硝酸盐允许日
摄入量(ADI)为0~0.37 mg·kg-1 (体重) (都韶婷等
2007), 确切指出蔬菜中硝酸盐含量的高低已成为
衡量蔬菜安全与否的一项重要指标(徐霞等2005)。
因此, 准确地测定蔬菜中硝酸盐含量极为重要。
在植物生理学和植物生理生化等课程的本科
实验教学中蔬菜硝酸盐的测定方法通常采用水杨
酸消化比色法(宗学凤和王三根2011)。原方法通
常使用花菜等白色或浅色蔬菜做为实验材料, 提
取条件为温度45 ℃、时间60 min, 在此提取条件
下, 因实验材料含硝酸盐量极少, 测定中不易显色,
导致吸光值过小而不易进行准确测定; 如果使用
绿色等深色蔬菜, 则因提取液颜色较深会严重影
响显色而不能准确测出材料中硝酸盐的含量。为
了扩大实验蔬菜种类和提高有色蔬菜中硝酸盐含
量测定的准确性, 我们对绿色蔬菜的硝酸盐提取
条件和脱色方法进行了探索, 使本项实验合理优
化, 硝酸盐含量测定更准确。
材料与方法
1 材料
实验材料分浅色蔬菜和深色蔬菜。白色或浅
色蔬菜为绿豆芽[Vigna radiate (L.) Wilczak]和甘蓝
‘莲花白’ (Brassica oleracea var. capitata), 绿色蔬菜
为空心菜(Ipomoea aquatica Forsk.)和小白菜(Bras-
sica chinensis L.)。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报1750
2 仪器和试剂
实验所用仪器: 721分光光度计等。
实验试剂: NO3
--N标准液、5%水杨酸-硫酸溶
液(显色剂)、2 mol·L-1 NaOH溶液和活性炭(宗学
凤和王三根2011)。
3 设计及方法
原实验方法: 标准曲线(回归方程)只有一条,
NO3
-浓度为50~300 μg·mL-1标准溶液;
NO3
--N测定: 称取5~10 g新鲜植物材料研磨成
匀浆后装入50 mL容量瓶中, 加去离子水30 mL于
45 ℃恒温水浴中浸提60 min (浸提过程中不时摇
动), 冷却后定容至刻度, 然后过滤(如含色素需脱
色), 取0.2 mL滤液于50 mL三角瓶中, 加0.8 mL显
色剂混匀后静置20~30 min使其充分反应显色后加
入19 mL的2 mol·L-1 NaOH溶液, 冷却后于410 nm
下测定吸光值(宗学凤和王三根2011)。
改进后方法: 设3条回归方程, 即回归方程1
(NO3
-浓度为10~60 μg·mL-1标准溶液)、回归方程2
(NO3
-浓度为10~100 μg·mL-1标准溶液)和回归方程
3 (NO3
-浓度为10~250 μg·mL-1标准溶液)。NO3
--N
测定时操作相同, 但提取过程中使用大试管加热
(非容量瓶), 加热一定时间后, 待其冷却后定容至
50 mL; 确定提取最适条件时, 为了避免色素干扰,
选择白色或浅色蔬菜 , 硝酸盐提取温度设置为
45、70、90 ℃和沸水浴(简称FSY, 下同), 时间设
置为30和60 min, 共8个组合, 实验过程中每一种蔬
菜每一组合重复3次, 每一重复进行3次平行测定,
从上述设计中筛选出最适条件; 为了消除绿色或
深色蔬菜中色素的影响, 在提取过程中, 每10 g绿
色蔬菜分别加入0 (对照)、0.1、0.2、0.3 g活性炭
搅拌均匀后提取NO3
-, 筛选出活性炭的最适量。实
验过程每一种蔬菜不同的活性炭加入量重复3次,
每一重复进行3次平行测定和一次加标测定。
本文用DPS数据处理系统的新复极差法统
计。表中小写字母表示1%差异, 大写字母表示5%
差异。
实验结果
1 标准曲线的制作
从表1可知, 3条不同浓度NO3
-溶液与吸光值
的回归方程的相关系数(R2)均达极显著水平, 3条
回归方程及其相关系数间差异不显著。学生在实
验中根据材料的吸光值选择不同浓度所得的回归
方程计算NO3
-的含量。
2 提取白色或浅色蔬菜中NO3-含量的最适条件筛选
从表2可知, 无论是绿豆芽还是‘莲花白’, 在90
℃-60 min和90 ℃-30 min条件下, 其NO3
-含量无显著
差异, 都是所有组合中最高的, 与其他条件下测定
的NO3
-含量有显著差异。对照及原方法的提取条
件45 ℃-60 min和45 ℃-30 min下, NO3
-含量极显著
低于其他组合。当温度恒定时, 随着时间的增加,
NO3
-含量也增加; 当时间恒定时, 随着温度(沸水浴
除外)的增加, NO3
-含量也增加, 但增加幅度不同。
90 ℃时NO3
-含量与45、70 ℃的NO3
-含量均达到极
显著水平, 与FSY的NO3
-含量无显著差异。90 ℃-60
min条件下NO3
-含量与90 ℃-30 min NO3
-含量无显
著差异。为了节约时间和成本, 确定温度90 ℃、时
间30 min为蔬菜NO3
-的含量测定的最适条件。
3 最适条件(温度 90 ℃、时间30 min)提取绿色蔬
菜中NO3-含量时活性炭加入量筛选
根据吸光值的不同选择不同的回归方程计算
含量。用Y=0.0075x–0.0114计算小白菜NO3
-含量;
用Y=0.0072x–0.0032计算空心菜NO3
-含量; 加标回
表1 NO3
-标准溶液浓度对吸光值的影响
Table 1 The effects of different NO3
- standard solutions on
light absorption value
NO3
-浓度/μg·mL-1 吸光值 回归方程 相关系数
10 0.067 Y=0.0072x–0.0033 R2=0.9983
20 0.139
30 0.213
40 0.290
50 0.345
60 0.429
10 0.067 Y=0.0072x–0.0032 R2=0.9995
20 0.139
40 0.290
60 0.429
80 0.596
100 0.742
10 0.067 Y=0.0075x–0.0114 R2=0.9997
50 0.345
100 0.742
150 1.097
200 1.481
250 1.877

李帮秀等: 蔬菜硝酸盐含量测定方法的改进 1751
收率(%)=(加标试样测定值–试样测定值)/加标量
×100% (赵嵩林2013)。
从表3可知, 小白菜加入0.1或0.2 g活性炭时,
NO3
-含量低于对照; 加入0.3 g活性炭时, NO3
-含量
略高于对照, 但四者间差异不显著。空心菜加入
0.1或0.2 g活性炭时, NO3
-含量与对照相近; 加入
0.3 g活性炭时, NO3
-含量略高于对照, 四者没有显
著差异。
从表3也可看出, 二种材料加入不同活性炭后
的回收率不同。其中以加入0.2 g活性炭样品的回
收率最高, 加入0.3 g活性炭样品的回收率最低, 极
显著低于前三者。
表2 不同温度和时间组合下绿豆芽及‘莲花白’的NO3
-含量
Table 2 The content of NO3
- under different combinations of temperatures and periods in V. radiate and B. oleracea
温度与时间组合
绿豆芽 ‘莲花白’
平均吸光值 含量/μg·g-1 平均吸光值 含量/μg·g-1
45 ℃-30 min 0.0746 54.10C,d 0.275 193.26E,e
45 ℃-60 min 0.0811 58.61BC,cd 0.281 197.43DE,de
70 ℃-30 min 0.0841 60.69ABC,bcd 0.289 202.99CD,cd
70 ℃-60 min 0.0907 65.28AB,abc 0.295 207.15BC,bc
90 ℃-30 min 0.0968 69.51A,a 0.311 218.26A,a
90 ℃-60 min 0.0980 70.35A,a 0.310 217.57A,a
FSY-30 min 0.0923 66.39AB,ab 0.301 211.32AB,b
FSY-60 min 0.0947 68.05AB,ab 0.303 212.71Ab,ab
　　NO3
-含量采用Y=0.0072x–0.0033计算。表中小写字母表示1%差异, 大写字母表示5%差异。
表3 不同量的活性炭对小白菜和空心菜NO3
-含量的影响
Table 3 The effects of different amounts of activated carbon on NO3
-content in B. chinensis and I. aquatica
活性炭/g
小白菜 空心菜
吸光值 含量/μg·g-1 回收率/% 吸光值 含量/μg·g-1 回收率/%
0 (对照) 1.074 723.6a 86.56 0.650 453.61a 106.48
0.1 1.017 685.6a 86.21 0.653 455.69a 89.34
0.2 1.020 687.6a 95.99 0.650 453.61a 96.40
0.3 1.082 728.93a 79.52 0.675 470.69a 76.57
　　小白菜NO3
-含量采用Y=0.0075x–0.0114计算, 空心菜NO3
-含量采用Y=0.0072x–0.0032计算。表中小写字母表示1%差异。
讨　　论
各种蔬菜NO3
-含量相差很大, 实验时或研究
时根据实验材料的吸光值选择不同浓度的回归方
程计算NO3
-的含量, 可避免原方法由于实验材料吸
光值太小, 甚至比回归方程中最小浓度的吸光值
还小的情况下, 仍使用唯一的回归方程计算NO3
-
含量。
在实验器材的配置中, 我们根据实验所需配
置器材, 原方法中使用容量瓶加热液体(王三根和
宗学凤2011), 但容量瓶不能进行加热, 因为容量瓶
的容量定义为: 在20 ℃时, 充满至标线所容纳水的
体积。因此容量瓶在加热过程中, 温度升高会引
起瓶体膨胀, 造成所量溶液的体积误差较大(北京
大学化学系分析化学教研组1998), 因此改进后选
用大试管加热液体, 然后将冷却液定容刻度, 从而
减小了实验误差。
在筛选最适条件时, 对于浅色材料来说, 无论
是绿豆芽还是‘莲花白’, 在45、70和90 ℃条件下,
NO3
-含量都随着温度升高而升高, 但沸水浴的NO3
-
含量却低于90 ℃时NO3
-含量, 可能是在沸水浴提
取过程中, 试管中的样品加热到沸腾后溅到高于
水浴锅液面的试管壁上并附着其上而无法提取,
造成结果偏低; 在90 ℃-60 min和90 ℃-30 min条件
下, 所有组合中NO3
-含量均最高, 相互间没有显著
植物生理学报1752
差异, 由此可知, NO3
-含量提取的最佳条件为: 水浴
温度90 ℃, 时间为30 min。在优化后的最佳提取
条件下, 绿豆芽中硝酸盐含量是原提取方法的1.19
倍; ‘莲花白’中硝酸盐含量是原方法的1.11倍, 且时
间减少30 min。优化后的方法更有利于实验教学
和科学研究中对不同蔬菜中NO3
-的含量进行准确
测量。
在提取NO3
-最适条件(温度90 ℃, 时间30 min)
下, 对于深色的两种绿色蔬菜, 没有加入活性炭时,
过滤后溶液显黄色, 是因为材料中的叶绿素被破
坏呈现出类胡萝卜素的颜色(黄色), 与秋天或不良
环境下叶片中较易降解的叶绿素数量减少、而类
胡萝卜素比较稳定时呈现的黄色(王忠2008)一
致。加入活性炭后(贾翠英等2010), 因色素被吸附
而黄色递减; 但随着活性炭的增加提取液颜色加
深呈灰黑色, 是因为蔬菜中的色素被完全吸附而
呈现出活性炭的颜色。实验的两种绿色蔬菜, 加
入不同量的活性炭后NO3
-含量均无差异, 但回收率
存在差异, 且以加入0.2 g活性炭回收率最适宜, 因
此, 每10 g绿色蔬菜加入0.2 g活性炭为最适量。加
入活性炭后可准确地测定绿色蔬菜中NO3
-含量, 拓
展了实验材料的取材范围。
综上所述, 适用水杨酸消化比色法测定绿色
蔬菜硝酸盐的硝酸盐提取条件为: 10 g样品加入
0.2 g活性炭, 水浴温度90 ℃, 时间为30 min。
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