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木薯Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1057~1062 1057
收稿 2013-06-03  修定 2013-08-13
资助 农业部热带作物专项(12RZBC-11)、现代农业产业技术体
系建设专项资金(CARS-34-GW8)和海南省研究生创新科
研课题(Hyb2012-4)。
* 通讯作者(E-mail: yuzhang_rain@163.com; Tel: 0898-66192915)。
木薯Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析
覃碧1, 王萌2, 刘巧玲3, 郑服丛2, 张宇2,*
1中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 海南儋州571737; 2海南大学环境与植
物保护学院, 海口570228; 3海南大学应用科学技术学院, 海南儋州571737
摘要: Mlo基因家族是植物重要的抗病基因。本文通过系统分析木薯基因组数据库, 从中共鉴定出21个Mlo成员, 其中20个
具有完整序列, 1个只有部分序列。对其中20个具有完整序列的基因与其他物种的Mlo基因进行聚类关系分析, 结果显示,
可将木薯Mlo基因家族分为6类(I~VI), 其中4类都包括有来自拟南芥的Mlo基因, 第VI类只包括2个木薯Mlo基因, 可能是木
薯中特有的一类Mlo; 6个木薯Mlo与已知的抗病Mlo基因分别聚在第IV和第V类, 这6个基因可能是木薯基因组中具有抗病
功能的Mlo。对所有的木薯Mlo蛋白进行结构分析发现, 除了MeMlo20外, 其他蛋白均具有6~8个跨膜结构, 其中3个蛋白具
有N端信号肽。
关键词: 木薯; 基因家族; Mlo; 序列分析
Identification and Sequence Characterization of Mlo Gene Family from the
Genome of Manihot esculenta Crantz
QIN Bi1, WANG Meng2, LIU Qiao-Ling3, ZHENG Fu-Cong2, ZHANG Yu2,*
1Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2Environment and Plant Protection College, Hainan
University, Haikou 570228, China; 3College of Applied Science and Technology, Hainan University, Danzhou, Hainan 571737,
China
Abstract: Mlo gene family is an important class of plant disease resistance genes. Through systematic analysis
of the genome sequence database of Manihot esculenta, total 21 Mlo genes were identified in this study, of which
20 had full-size and one partial sequences. Phylogenetic analysis was performed to reveal the evolution of the
cassava Mlo genes with full-size sequences, and Mlo genes from other species. The results indicated that the cas-
sava Mlo family could be devided into 6 clades (I–VI), of which four contained Mlo members from Arabidopsis.
The VI clade contained only two cassava Mlo genes, suggested that it might be a specific clade for cassava ge-
nome. Furthermore, 6 cassava Mlo genes were grouped into the clades IV and V which contained the Mlo genes
of known function in disease resistance, suggested that the 6 cassava Mlo genes might be have their functions in
disease resistance. Protein domains analysis revealed that besides MeMlo20, all the other 19 cassava Mlo con-
sisted of 6 to 8 membrane-spanning domains, in which 3 proteins contained an N-terminal signal petide.
Key words: Manihot esculenta; gene family; Mlo; sequence analysis
Mlo基因家族是一类植物特有的抗病基因家
族, 最早在大麦中发现并得到克隆, 大麦Mlo基因
编码一个膜结合蛋白, 具有至少7个跨膜结构域,
是大麦抗白粉病的负调控因子, 缺乏野生型Mlo蛋
白的大麦突变体(mlo, 隐性纯合体)表现出对大麦
白粉菌具有广谱抗性(Buschges等1997)。随后,
Mlo同源基因相继从水稻、拟南芥、亚麻、玉米
和小麦等多种植物中分离出来, 构成了植物特有
的Mlo家族(Devoto等2003)。对不同物种的Mlo基
因结构和功能进行分析发现, Mlo是一类比较保守
的抗病基因。拟南芥AtMlo2、AtMlo6和AtMlo12
具有类似大麦Mlo的功能, 它们的缺失突变体也具
有抗白粉病的功能(Consonni等2006)。小麦(TaM-
lo1、TaMlo2和TaMlo3)、水稻OsMlo2及番茄SlM-
lo1也具有抗白粉病的功能(Bai等2008; Elliott等
2002)。Mlo基因在抗病中的作用使得其在植物抗
病育种中占有着十分重要的地位。
植物生理学报1058
木薯是大戟科木薯属植物, 广泛种植于热带
和亚热带地区, 是世界上重要的粮食作物与能源
作物。木薯生长过程经常遭受如粉蚧、粉虱、天
蛾幼虫、木薯花叶病毒、木薯褐病和木薯萎蔫病
菌等的侵袭(Bart等2012; 黄强等2013)。过去主要
通过化学防治, 但化学防治常常出现用药多、成
本高、环境污染严重等问题, 而培育和推广抗病
品种是防治病害最经济有效且环保的措施。随着
木薯基因组测序工作的完成, 使得鉴定和克隆木
薯的抗病虫基因变成可能, 从而为进一步通过转
基因技术培育木薯抗病虫害新品种提供丰富的基
因源。Mlo基因家族是植物重要的抗病基因, 但有
关木薯Mlo基因的克隆及其功能研究未见报道。
本研究通过系统分析木薯基因组数据库, 从中鉴
定木薯基因组所有的Mlo基因家族成员, 通过对木
薯与拟南芥基因组Mlo成员及其他物种中已知功
能的Mlo基因进行系统进化关系分析, 鉴定木薯基
因组中具有抗病功能的Mlo候选基因, 为进一步研
究木薯Mlo家族成员的功能及其在抗病分子育种
中的应用奠定基础。
材料与方法
采用2种方法系统地搜索和鉴定木薯(Manihot
esculenta Crantz)基因组中的Mlo基因家族成员: 一
方面以“Mlo”作为关键词在木薯基因组数据库
(http://www.phytozome.net/search.php?show=blast
&method=Org_Mesculenta)中进行搜索, 下载其蛋
白序列, 随后再以候选的Mlo序列为检索序列, 在
NCBI蛋白质数据库中进行Blastp搜索, 获得与其他
物种中已鉴定的Mlo蛋白同源的木薯Mlo蛋白; 另
一方面以已鉴定功能的Mlo蛋白(包括大麦HvMlo,
小麦TaMlo1、TaMlo2、TaMlo3, 水稻OsMLO2, 番
茄SlMlo1, 拟南芥AtMlo2、AtMlo6、AtMlo12)序
列为检索序列(表1), 分别在木薯基因组数据库
(http://www.phytozome.net/search.php?show=blast
&method=Org_Mesculenta)中进行Blastp搜索, E值
设为1×10-10, 获得同源的木薯Mlo蛋白。通过2种
搜索方法得到的木薯Mlo蛋白, 人工去除重复后,
再利用NCBI保守结构域分析工具(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)对所获得的
木薯Mlo蛋白家族成员进行鉴定, 检测是否含有
Mlo保守结构域。
采用SMART 在线分析软件(http://smart.embl-
heidelberg.de/)分析蛋白的结构(Letunic等2004); 用
SignalP 4.1 Server在线分析软件(http://www.cbs.
dtu.dk/services/SignalP/)分析信号肽结构(Petersen
等2011); 用TMHMM 2.0 Server在线分析软件
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋
白跨膜结构域。采用钙调素结合蛋白(CaMBP)数
据库(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/pub_
pages/search/index.htm)对可能的抗病相关Mlo蛋白
进行CaM结合结构域预测。
为了分析木薯Mlo基因家族成员与其他物种
Mlo成员之间的进化关系, 进一步将木薯Mlo基因
家族成员、模式植物拟南芥所有Mlo基因家族成
员以及大麦、小麦、水稻和番茄中已知功能的
Mlo基因(表1)构建了系统进化树。利用ClustalX
1.83软件进行多重序列比对(Thompson等2002), 采
用MEGA 4.1软件通过neighbor-joining方法构建系
统进化树, 并根据bootstrap重抽样1 000次进行置信
度分析(Kumar等2001)。
结果与讨论
1 木薯Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析
本文采用2种方法对木薯基因组数据库进行
系统地搜索, 共获得21个木薯Mlo基因家族成员,
分别命名为MeMlo1~MeMlo21 , 其中20个成员
MeMlo1~MeMlo20具有完整的序列, 而MeMlo21只
有部分序列(表2)。从表2可以看出, 具有完整序列
的Mlo基因编码蛋白的氨基酸长度、等电点及分
子量差异较大, 其中MeMlo17是开放阅读框(ORF)
最长的一个基因, 编码597个氨基酸, 蛋白分子量
为68.28 kDa; MeMlo20的ORF最短, 编码277个氨
基酸, 蛋白分子量为31.87 kDa; 这些Mlo的理论等
电点从6.51 (MeMlo5)至9.61 (MeMlo17)。进一步
对20个具有完整序列的木薯Mlo基因的编码蛋白
结构进行分析发现, 这些Mlo蛋白均具有一个Mlo
保守结构域, 包含有多次跨膜结构, 跨膜次数为4
(MeMlo20)到8次, 其中14个蛋白具有7次跨膜结构,
3个蛋白(MeMlo8、MeMlo10和MeMlo18)具有N端
信号肽, 而且信号肽均与第一次跨膜结构存在重
叠区。对拟南芥基因组所有Mlo成员及其他物种
覃碧等: 木薯Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析 1059
表2 木薯全基因组Mlo基因家族成员及其序列特征
Table 2 The sequence characterizations of Mlo genes from the genome of M. esculenta
基因 位点 氨基酸/个 蛋白分子量/kDa 等电点 跨膜结构 信号肽 钙离子结合区
MeMlo1 cassava4.1_033658m.g 564 63.79 9.46 7 0 RWIVAFFRQFFG
MeMlo2 cassava4.1_023541m.g 592 68.07 9.35 7 0 无
MeMlo3 cassava4.1_033120m.g 556 63.56 9.31 7 0 RWIVAFFRQFFA
MeMlo4 cassava4.1_028675m.g 540 61.74 8.18 6 0 无
MeMlo5 cassava4.1_025431m.g 517 59.58 6.51 7 0 无
MeMlo6 cassava4.1_004402m.g 578 66.34 8.78 7 0 VWIVCFFRQFFG
MeMlo7 cassava4.1_031151m.g 548 61.63 8.92 7 0 无
MeMlo8 cassava4.1_004507m.g 571 65.31 9.37 8 1* 无
MeMlo9 cassava4.1_029705m.g 514 58.83 7.39 7 0 无
MeMlo10 cassava4.1_031835m.g 453 51.65 9.11 7 1* 无
MeMlo11 cassava4.1_004793m.g 557 63.68 9.02 7 0 无
MeMlo12 cassava4.1_004283m.g 585 67.21 8.82 8 0 VWIVCFFRQFFG
MeMlo13 cassava4.1_007579m.g 448 51.77 9.31 6 0 无
MeMlo14 cassava4.1_004823m.g 555 63.59 9.22 7 0 无
MeMlo15 cassava4.1_005640m.g 516 58.15 8.61 7 0 KRKKGLKAAAAAAAA
MeMlo16 cassava4.1_033401m.g 514 58.83 7.69 7 0 无
MeMlo17 cassava4.1_030963m.g 597 68.28 9.61 7 0 无
MeMlo18 cassava4.1_022918m.g 577 65.97 8.60 6 1* 无
MeMlo19 cassava4.1_004964m.g 547 63.09 8.30 7 0 无
MeMlo20 cassava4.1_013598m.g 277 31.87 8.65 4 0 无
MeMlo21** cassava4.1_029787m.g 191 – – – – –
  *表示信号肽与第一个跨膜结构之间存在重叠区; **表示序列不完整。
表1 拟南芥、大麦、小麦、水稻和番茄Mlo基因及其结构特征
Table 1 The structure characteristics of Mlo genes from Arabidopsis, barley, wheat, rice, and tomato
种属 基因 位点/登录号 跨膜结构 信号肽
拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtMlo1 AT4G02600 7 0
AtMlo2 AT1G11310 7 0
AtMlo3 AT3G45290 7 0
AtMlo4 AT1G11000 6 0
AtMlo5 AT2G33670 7 0
AtMlo6 AT1G61560 8 0
AtMlo7 AT2G17430 8 1*
AtMlo8 AT2G17480 8 1*
AtMlo9 AT1G42560 6 0
AtMlo10 AT5G65970 8 1*
AtMlo11 AT5G53760 7 0
AtMlo12 AT2G39200 7 0
AtMlo13 AT4G24250 7 0
AtMlo14 AT1G26700 7 0
AtMlo15 AT2G44110 6 0
大麦(Hordeum vulgare) HvMlo CAB06083 7 0
小麦(Triticum aestivum) TaMlo1 CAC25081 7 0
TaMlo2 AAK94904 7 0
TaMlo3 CAC25080 7 0
水稻(Oryza sativa) OsMLO2 AAK94907 7 0
番茄(Solanum lycopersicum) SlMlo1 AAX77013 6 0
  *表示信号肽与第一个跨膜结构之间存在重叠区。
植物生理学报1060
中已知功能的Mlo进行结构分析也发现, 所有的
Mlo蛋白均具有6~8个跨膜结构, 拟南芥的3个蛋白
AtMlo7、AtMlo8和AtMlo10具有N端信号肽, 而且
信号肽均与第一次跨膜结构存在重叠区(表1)。
2 木薯Mlo基因家族成员系统进化关系分析
为了揭示木薯Mlo基因家族成员的进化关系及
其分类, 采用ClustalX 1.83软件对木薯MeMlo1~20、
拟南芥基因组所有Mlo成员(AtMlo1~15)、大麦
HvMlo、小麦TaMlo1~3、水稻OsMlo2和番茄SlMlo1
共41个基因的编码蛋白进行多重序列比对, 并采用
MEGA 4.1软件构建系统进化树。结果(图1)显示, 可
将所有木薯Mlo基因家族成员分为6类(I~VI), 除了
第IV和第VI类外, 其他4类都包括来自拟南芥的Mlo
基因成员。第III类是最大的一类, 包含有9个成
员。第VI类是最小的一类, 只包含2个基因木薯
(MeMlo18和MeMlo19), 因此推测, 这可能是木薯中
图1 木薯和拟南芥Mlo基因家族成员及其他已知功能Mlo基因的系统进化关系分析
Fig.1 Phylogenetic analysis of Mlo family members from the genomes of M. esculenta
and Arabidopsis, and other Mlo genes of known function
进化树中每个结点上的数值表示bootstrap重抽样1 000次进行置信度分析得到的置信值。
覃碧等: 木薯Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析 1061
特有的一类Mlo。这一研究结果与前人的研究存
在一定差异。Devoto等(2003)对拟南芥、玉米、
水稻、大麦、小麦和苔藓的Mlo基因家族成员进
行进化关系分析时, 将不同物种的Mlo分成了6个
亚族和5个类群(I~V), AtMlo3是一个独立的亚族但
没有将其进行归类(Devoto等2003)。本文结果的
木薯MeMlo18和MeMlo19两个基因可能与AtMlo3
类似, 应该归为独立的类群, 因此, 将MeMlo18和
MeMlo19划分为第VI类。MeMlo20属于第II类, 但
该蛋白只有4个跨膜结构域, 而且氨基酸序列长度
也明显比其他Mlo成员短很多, 推测MeMlo20可能
是进化过程中终止密码子提前插入, 使其突变成
为一个假基因。第IV类由木薯MeMlo1、MeMlo3
及禾本科作物已知的抗病Mlo基因, 包括大麦HvM-
lo、小麦TaMlo1~3和水稻OsMlo2组成(Buschges等
1997; Elliott等2002)。木薯MeMlo2、MeMlo6、
MeMlo12、MeMlo17与双子叶植物已知的抗病Mlo
基因, 包括拟南芥(AtMlo2、AtMlo6和AtMlo12)和
番茄SlMlo1聚在第V类(Bai等2008; Consonni等
2006)。第IV和第V类可能是植物抗病Mlo成员的
类群, 而木薯MeMlo1、MeMlo2、MeMlo3、MeM-
lo6、MeMlo12和MeMlo17可能是具有抗病功能的
Mlo成员。
3 木薯抗病Mlo候选基因的氨基酸序列特征分析
通过对木薯和拟南芥基因组Mlo基因家族以
及大麦、小麦、水稻和番茄的已知抗病Mlo基因
进行系统进化关系分析发现, 木薯MeMlo1、MeM-
lo2、MeMlo3、MeMlo6、MeMlo12和MeMlo17基
因可能是具有抗病功能的Mlo成员。为了更好地
揭示这6个抗病Mlo候选基因的序列特征 , 采用
ClustalX 1.83软件对这6个候选基因的氨基酸序列
进行多重序列比对。结果显示, 这6个候选基因的
编码蛋白在跨膜区及其附近序列具有很高的保守
性, 而C末端序列相似性比较低(图2)。MeMlo12具
有8个跨膜结构, MeMlo1、MeMlo2、MeMlo3、
MeMlo6和MeMlo17均具有7个跨膜结构, 它们都
缺失了MeMlo12的第5个跨膜结构(TM5) (图2, 跨
膜结构用下划线标出)。这与已知的抗病Mlo蛋白
结构类似, AtMlo6和SlMlo1分别具有8个和6个跨
膜结构 , 其他已知的抗病Mlo (HvMlo、TaM-
lo1-3、OsMlo2、AtMlo2和AtMlo12)均具有7个跨
膜结构(表1)。已有的研究表明, Mlo蛋白是一类钙
结合蛋白 , 具有钙离子结合区(CaMBD), 而且
CaMBD结构域能够提高Mlo蛋白的活性(Kim等
图2 木薯抗病Mlo候选基因的氨基酸多重序列比对
Fig.2 Multiple sequence alignment of cassava Mlo candidate genes for disease resistance in M. esculenta
下划线标出的是跨膜结构域(TM1~TM8); 方框标出的是钙离子结合区(CaMBD)。
植物生理学报1062
2002), 因此, 采用钙调素结合蛋白(CaMBP)数据库
对木薯的20个Mlo蛋白进行CaM结合结构域预
测。结果发现, 除MeMlo2和MeMlo17外, 其他4个
候选的抗病Mlo即MeMlo1、MeMlo3、MeMlo6和
MeMlo12分别在第238、225、226、227个氨基酸
可能具有一个CaMBD结构域(表2和图2)。除此之
外, MeMlo15虽然没有与已知的抗病Mlo聚在同一
类群上, 但它也具有一个CaMBD结构域(位于第
461个氨基酸, 表2)。这些抗病Mlo候选基因的鉴定
为木薯抗病育种提供了良好的基因资源。
参考文献
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