全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 1期，2010年 1月 3 7
收稿 2009-10-28 修定 　2009-11-24
资助 湖北省自然科学基金(2008CDA061)、湖北省教育厅科
学研究计划优秀中青年人才项目(Q20091201)和长江大
学博士基金(0 0 1 0 1 1 3 )。
* 通讯作者(E-mail: s_y_cheng@sina.com; Tel: 0713-
8 8 3 3 5 9 9 )。
银杏叶绿体 petD基因的克隆与表达
许锋 1, 张威威 1, 唐寅 1, 王燕 1, 程水源 2,*
1长江大学园艺园林学院, 湖北荆州 434025; 2黄冈师范学院生命科学与工程学院, 湖北黄冈 438000
提要: 根据黑松、云杉、菠菜与玉米叶绿体 petD基因序列设计引物, 以银杏叶绿体基因组DNA为模板, PCR 扩增克隆了
银杏叶绿体 petD基因(GenBank登录号为DQ923066, 命名为GbpetD)的序列。序列分析显示, GbpetD基因组DNA序列编
码区长 1 243 bp, 含 1个内含子和 2个外显子, 其外显子序列编码 177个氨基酸。相似性比对显示, 该基因编码区序列与云
杉、台东苏铁、黑松、莴苣、木薯、北美落叶松的 petD基因核苷酸同源性为 84%~99%, 氨基酸序列同源性为 85%~93%。
系统进化树分析结果表明GbpetD蛋白质与黑松、北美落叶松、云杉、苏铁等裸子植物的 petD蛋白质聚类关系最近。半
定量RT-PCR分析表明, GbpetD基因在银杏叶和茎中表达, 在叶中表达量最大。
关键词: 银杏; GbpetD基因; 序列分析; 表达
Cloning and Expression of A Chloroplast petD Gene from Ginkgo biloba L.
XU Feng1, ZHANG Wei-Wei1, TANG Yin1, WANG Yan1, CHENG Shui-Yuan2,*
1College of Horticulture and Garden, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China; 2College of Life Science and Engineering,
Huanggang Normal University, Huanggang, Hubei 438000, China
Abstract: A chloroplast petD gene, named GbpetD, was cloned from Ginkgo biloba using a pair of primers,
which were designed according to the homologous sequences in Pinus thunbergii, Picea abies, Spinacia oleracea,
and Zea mays. The genomic DNA of GbpetD had 1 243 bp coding sequence, including one intron and two
exons, which encoding a 177-amino-acid protein. The Blast results showed that the homology of the GbpetD
nucleotide sequence with petD genes from P. abies, Cycas taitungensis, P. thunbergii, Lactuca sativa, Manihot
esculenta, and Larix occidentalis was from 84% to 99%, and the homology of amino acid sequences was from
85% to 93%. Phylogenetic tree analysis indicated that the GbpetD protein had the closest relationship with petD
proteins from gymnosperm plants. The expression analysis with semi-quantitative RT-PCR revealed that GbpetD
gene expressed in leaves and young stems, and the highest level was detected in leaves.
Key words: Ginkgo biloba; GbpetD; sequence analysis; expression
高等植物叶绿体的类囊体膜由 PSI、PSII、
ATP合酶和细胞色素 b6/f复合体 4种复合物构成。
其中, 细胞色素 b6/f复合体参与光合作用电子传递
过程, 它是类囊体膜结合多亚基蛋白, 介导质体醌
将电子传递给位于类囊体腔一侧的含铜蛋白质体蓝
素(Hurt和Hauska 1981), 在光合作用中起作用。在
蓝藻类囊体中的研究表明, 细胞色素 b6/f不仅参与
光合作用的电子传递, 而且参与呼吸作用的电子传
递, 它的氧化还原状态更容易受到呼吸作用的影响
(Scherer和 Böger 1982)。叶绿体 petD基因编码细
胞色素b6/f复合体亚基IV, 这种亚基是细胞色素b6/
f复合体的组成结构和活性必不可少的(Esposito等
2001)。在过去的 20多年中, petD基因的研究已取
得了很大进展, 如Chen等(1993)发现, 衣藻petD基
因起始密码子突变为AUU或者AUC后, 翻译起始
效率下降, 翻译效率降低和亚基 IV积累减少后, 光
合生长速率降低。此外, 由于高等植物叶绿体基因
组中的petD基因序列高度保守(Dixit等2002), 因此
petD基因序列也用于检测植物间的系统关系和分
子进化(Löhne和 Borsch 2005)。许多植物的叶绿
体 pe tD 基因已被克隆和分析, 如水稻(Côté 等
1988)、衣藻(Turmel等 1989)和杨树(Dixit等 2002)
等, 然而在银杏中有关 petD基因的研究鲜有报道。
银杏为雌雄异株的裸子植物, 是地球上现存种子植
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物中最古老的孑遗植物, 由于其系统发育有独特地
位, 人们从不同方面对其进行了广泛的研究。基于
此, 本文克隆了银杏叶绿体 petD基因的完整序列,
并对其进行了相关生物信息学和组织表达谱的分
析, 以期为研究银杏叶绿体细胞色素 b6/f复合体的
结构和功能提供必要的信息, 并为进一步研究银杏
光合作用电子传递途径建立基础。
材料与方法
银杏(Ginkgo biloba L.)各组织的试验材料采
自本校银杏科技园中品种为 ‘家佛手 ’的15年生嫁
接树, 树的长势良好。银杏叶片采自当年长出的新
梢, 大小一致, 生长旺盛, 无病虫害; 幼茎均为新梢
1 cm的长茎尖; 所采用的果实饱满且大小一致; 根
样为 2 cm的根尖部分。上述样品均于 2007年 4
月中旬采集, 采集过程中均戴一次性无菌手套操作,
所采样品带回实验室立即清洗干净后置于−80 ℃冰
箱中。
大肠杆菌DH5α为本实验室保存, 限制性内切
酶、Taq酶、pMD18-T载体、氨苄青霉素均购
自于大连 Takara公司; DNA纯化回收试剂盒购自
美国Axygen公司。引物合成及序列测定由上海生
工生物技术有限公司完成。
取20 g左右银杏叶片用于叶绿体基因组DNA
的提取, 提取参考龙兴等(2008)文中方法。提取的
叶绿体DNA分别用琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光
度计检测浓度及纯度。
根据黑松、云杉、菠菜与玉米叶绿体基因组
的 petD基因序列, 用软件 Primer Premier 5.0设计
引物, 引物序列分别为 PetDSP: 5 ATGGGAGTG-
TGTGACTTGAACTACT 3; PetDAP: 5 CTAATAT-
AAACGAAAGATTGAAACT 3。PCR反应在PTC-
100 Peltier基因扩增仪上完成, 反应程序为: 94 ℃
预变性 3 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃
延伸 90 s, 共 32个循环; 最后于 72 ℃延伸 10 min。
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测, 目的产物用胶回
收试剂盒回收, 胶回收产物克隆进 pMD18-T载体,
转化大肠杆菌DH5α菌株, 选取阳性克隆提取质粒
DNA后, 经酶切鉴定后测序。
DNA序列相似性比较及氨基酸活性位点在
NCBI网站上用 Blast和 RPS2Blast完成, 氨基酸序
列比较利用Vector NTI 10.0完成, 蛋白质修饰位
点及保守结构域分析在www.expasy.org网站上利
用相关软件分析, 氨基酸序列进化树由Clustalx1.81
和MEGA 4.0完成(Saitou和Nei 1987)。
银杏的叶、幼茎、果实和根的总 RNA提取
采用 CTAB法(蔡荣等 2007), cDNA链的合成用
Ferment公司的逆转录试剂盒(RevertAdi. first strand
cDNA synthesis kit)完成。以银杏看家基因 3-磷酸
甘油醛脱氢酶基因(GAPDH, GenBank登录号为
L26924)作为参照, 进行半定量 RT-PCR分析。
GbpetD基因使用特异引物 petDRT1 (5 TTTCCC-
TTGCATTCATTCC 3)和 petDRT2 (5 ATTTTTC-
ATCATCCGGCTC 3)进行30个循环的扩增, GAPDH
采用特异引物GAPDH1 (5 ATGAGTTCCACCGG-
AAAGATT 3)和GAPDH2 (5 TTAGACAGTGG-
AGGCCATATG 3)进行 25个循环的扩增。
结果与讨论
1 GbpetD基因的克隆及序列特征
通过特异引物PetDSP与PetDAP进行PCR扩
增获得一个约 1 300 bp的片段, 与预期的基因片段
大小一致, 回收后与T载体连接进行测序分析可知
该DNA序列长 1 243 bp。经NCBI网站 Blast比
较的结果显示, 该序列与其它植物的petD核苷酸序
列高度同源, 如云杉(Picea abies, 同源性为 99%,
GenBank登录号为AJ001024, 下同)、柳杉(Crypto-
meria japonica, 90%, NC_010548)、台东苏铁
(Cycas taitungensis, 86%, NC_009618)、黑松(Pinus
thunbergii, 86%, NC_001631)、北美落叶松(Larix
occidentalis, 84%, FJ899578)、木薯(Manihot
esculenta, 87%, NC_010433)、金粟兰(Chloranthus
spicatus, 87%, NC_009598)、小叶黄杨(Buxus
microphylla, 86%, NC_009599), 表明该序列为银杏
叶绿体petD基因, 因此将该序列片段命名为GbpetD
(GenBank登录号为DQ923066)。
进一步分析GbpetD序列的结果显示, 所克隆
的片段包含GbpetD基因的编码区, 含1个内含子和
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2个外显子, 与所报道的陆地植物petD基因的序列
结构非常相似(Löhne和 Borsch 2005), 而且与所有
分析的petD基因相同, GbpetD的外显子/内含子的
剪接位点位于一个保守的缬氨酸位点(Turmel等
1989; Dixit等 2002)。图 1为部分代表植物 petD基
因的内含子和外显子的结构, 其中不管是裸子植物
如银杏、红松(Pinus koraiensis, GenBank登录号为
AY228468, 下同)、云杉、北美落叶松、台东苏
铁, 还是被子植物如玉米(Zea mays, NC_001666)、
烟草(Nicotiana tabacum, Z00044)、胡萝卜(Daucus
carota, NC_008325), 它们的 petD基因外显子 1均
为 8 bp长, 外显子 2的长度均在 500 bp左右, 如裸
子植物中银杏、红松、云杉的外显子 2分别为 526
bp、562 bp和 529 bp, 被子植物中玉米、烟草和
胡萝卜的外显子 2均为 475 bp。一般而言在 petD
基因的内含子水平上, 亲缘关系较近的植物是较为
保守的, 因此petD基因内含子的序列已作为研究植
物分子进化与亲缘关系的一个分子标记(Löhne和
Borsch 2005)。
2 GbpetD蛋白质的特征
GbpetD基因编码一个 177 aa的蛋白, 采用
Computer pI/Mw Tool软件预测该蛋白的等电点和
分子量大小分别为6.57和19.4 kDa, 与所报道的其
它植物的 petD蛋白性质相似。用Vector NTI 10.0多
重比较GbpetD蛋白与其它植物 petD蛋白序列, 结
果表明, GbpetD蛋白与其它裸子植物和被子植物的
petD蛋白高度同源, 其同源性都达到 85%以上, 如
与柳杉、木薯、拟南芥、云杉、台东苏铁、黑
松和北美落叶松蛋白质序列相似性分别为 92%、
91%、90%、88%、93%、85%和 85% (图 2)。
GbpetD蛋白的修饰位点预测分析表明, 其含
有1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点
(169RKIS)、2个蛋白激酶 C磷酸化位点(4TKK、
165TVK)、2个酪蛋白激酶 II磷酸化位点(26SYGE、
71TPSE)和 4个 N-豆蔻酰化位点(21GMGHNS、
46GTIACT、136GTAVAL和144GIGAAL), 这与黑
松和云杉 petD蛋白的修饰位点类型和数量是一致
的(Wakasugi等1994), 同时也反映petD蛋白在植物
进化上的保守性, 而这些活性位点的存在说明蛋白
翻译后修饰在实现 pet D 蛋白的功能中起作用。
ProtScale和CDS保守结构域搜索结果表明, GbpetD
蛋白C端存在1个高度保守的细胞色素b6碳 -末端
结构域, 而且该结构域还存在1个petD蛋白中恒定
不变的三联氨基酸位点(77PEW), 它对于细胞色素
b6复合体蛋白在辅酶/泛醌氧化还原场所的电子传
递作用具有重要意义(Esposti等 1993)。GbpetD蛋
白上述的活性位点与保守结构域与已被研究的
petD蛋白高度一致, 暗示GbpetD与它们可能有相
似的功能。
3 GbpetD蛋白的系统进化树分析
为了研究GbpetD蛋白和其它植物petD蛋白之
间的进化关系, 用软件 Clustalx 1.81和MEGA 4.0
通过邻接法(neighbor-joining, NJ)构建了 petD的系
统进化树(图 3)。系统进化树显示: 首先, 所有petD
蛋白被分成裸子植物与被子植物 2大类, 如银杏与
云杉、黑松、北美落叶松、台东苏铁组成裸子
植物类, 而南天竺、小叶黄杨、玉米和胡萝卜等
图 1 GbpetD基因与其它部分代表植物 petD
基因外显子 /内含子比较
Fig.1 Comparison of the exon/intron organization among
petD genes from G. biloba and several
other representative plant species
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聚成被子植物类, 因此从这个角度而言, 银杏与其
它裸子植物在进化上的亲缘关系比与被子植物的亲
缘关系近。系统进化树的分析结果暗示GbpetD和
其它植物的 petD源于共同的祖先。
4 GbpetD基因的组织特异性表达
提取银杏的叶、幼茎、果实和根的总 RNA,
采用半定量RT-PCR的方法分析GbpetD在银杏各
图 2 GbpetD蛋白与其它植物 petD蛋白氨基酸序列的多重比较
Fig.2 Sequence multialignment of the deduced GbpetD protein with other plant petD proteins
黑底白字表示氨基酸完全一致的序列, 灰底白字表示高度保守的氨基酸序列, 白底黑字表示完全不相似氨基酸序列。各种植物
petD蛋白的 GenBank登录号如下: 银杏, ABI95800; 拟南芥(Arabidopsis thaliana), NP_051089; 木薯, YP_001718468; 小叶黄杨,
YP_001294215; 柳杉, YP_001806639; 北美落叶松, ACP52220; 黑松, NP_042435; 云杉, O47044; 台东苏铁, YP_001312237; 菠菜
(Spinacia oleracea), NP_054965; 金粟兰, YP_001294129; 莴苣(Lactuca sativa), YP_398359; 玉米, NP_043054; 胡萝卜, YP_740148;
台湾蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana), YP_358612; 南天竺(Nandina domestica), ABI49895; 烟草, NP_054531。
器官中的表达情况。半定量 RT-PCR检测的结果
显示, GbpetD基因只在叶和幼茎中表达, 在根和果
中不表达, 而且叶中的表达量显著高于茎(图4), 这
与玉米和菠菜 petD基因的表达模式相似(Rock等
1987)。植物光合代谢主要发生在含有叶绿体的组
织中, 如叶和茎, 而细胞色素 b6/f复合体的主要功
能就是参与光合作用电子传递过程, GbpetD基因组
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织特异性表达模式也表明银杏叶与幼茎是发生光合
作用的主要场所。
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图 4 RT-PCR分析GbpetD基因在银杏各组织中的表达
Fig.4 Expression pattern of GbpetD gene in
different tissues by RT-PCR
图 3 用邻接法构建的GbpetD蛋白与其它植物 petD蛋白的系统进化树
Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of the sequences of GbpetD and other plant petD proteins