全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (4): 393~396 393
收稿 2012-01-09　　修定 2012-02-03
资助 国家自然科学基金项目(31000144)和陕西省教育厅科研计
划项目(09JK746)。
* 共同通讯作者(E-mail: weiyahui@nwu.edu.cn, guobin@
nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
蛇足石杉原叶体的培养及孢子体的诱导
包日双, 尹培培, 郭斌*, 尉亚辉*
西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室, 陕西省生物技术重点实验室, 西北大学生命科学学院, 西安
710069
摘要: 以蛇足石杉孢子囊为材料培养得到蛇足石杉原叶体, 进一步对原叶体进行增殖培养并诱导产生蛇足石杉孢子体。结
果表明, 适合蛇足石杉原叶体增殖的培养基是无激素的MS培养基, 在该培养基上培养60 d, 原叶体的增殖倍数达到131.1;
较高浓度的外源激素对原叶体的增殖有抑制作用, 而低浓度的外源激素对原叶体的增殖影响不大; 原叶体在无激素培养基
上培养90 d, 孢子体的诱导频率为4.0%; 通过HPLC检测蛇足石杉原叶体中石杉碱甲的含量为0.0059%, 是野生孢子体中含
量的0.25倍。
关键词: 蛇足石杉; 原叶体; 孢子体; 石杉碱甲
Prothallium Culture and Sporophyte Induction of Huperzia serrata (Thunb.) Trev.
BAO Ri-Shuang, YIN Pei-Pei, GUO Bin*, WEI Ya-Hui*
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Shaanxi Provincial Key Labo-
ratory of Biotechnology, College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: Huperzia serrata prothallium was obtained from sporangium by in vitro culture and prothallium pro-
liferation and sporophyte induction of H.serrata were studied. The results showed that MS medium without any
hormone was optimal medium for prothallium proliferation and the prothallium quantity reached 131.1-fold of
inoculation after 60 days. High concentration of exogenous hormones had inhibitory effect on prothallium pro-
liferation, while low concentration of exogenous hormones didn’t have obvious effect on prothallium prolifera-
tion. The induction frequency of sporophyte was 4.0% after 90 days on MS medium without any hormone.
HPLC analysis results showed that the content of huperzine A in the prothallium of H.serrata was 0.0059%,
which was a quarter of the content in wild plants.
Key words: Huperzia serrata; prothallium; sporophyte; huperzine A
蛇足石杉为石杉科石杉属植物, 全草入药, 药
名千层塔, 具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效(浙
江药用植物志编写组1980)。研究表明从该植物中
分离的石杉碱甲是一种强效、低毒的可逆性胆碱
酯酶抑制剂, 具提高学习和记忆效率的功能, 对重
症肌无力和老年痴呆症有良好的治疗效果(张守圭
1985; Wang和Tang 2005)。然而, 蛇足石杉在自然
界中繁殖缓慢, 需要15年才能生长成熟(郭斌等
2009; Ma和Gang 2008), 再加上人为采集, 使该种
药材资源的再生受到了极大限制, 因此人们试图
通过多种途径寻找石杉碱甲新的来源。盛束军等
(2000)及覃大吉等(2010)以枝条或茎梢为材料建立
了蛇足石杉的扦插育苗繁殖体系, 为千层塔资源
的可持续开发利用奠定了一定的技术基础; 王德
立和冯锦东(2011)以蛇足石杉的芽孢为研究对象,
建立了蛇足石杉的芽胞繁育体系, 但是芽孢的数
量终归有限, 繁殖效率仍然不高。梁昊(2010)以千
层塔茎尖为外植体建立了蛇足石杉的组织培养体
系, 但是蛇足石杉在培养基上的生长速度并不快,
因此也未能达到组织培养快速繁殖的目的。韦景
枫等(2011)以蛇足石杉孢子囊为外植体, 萌发获得
蛇足石杉原叶体 , 但未报道获得石杉碱甲的药
源——蛇足石杉的孢子体。本实验用蛇足石杉的
孢子囊萌发得到蛇足石杉原叶体, 对原叶体快速
增殖的培养条件进行摸索, 并通过诱导成功获得
蛇足石杉孢子体, 为蛇足石杉的快速繁殖和资源
开发提供依据。
植物生理学报394
材料与方法
1 材料
蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb.) Trev.]采
自湖北省恩施州建始县, 蛇足石杉孢子囊从成熟
原植物上摘取。
2 孢子的萌发
将蛇足石杉孢子囊在清水中漂洗2~3次, 然后
转入75%乙醇中浸泡30~60 s, 再用0.1%升汞灭菌
6~8 min, 用无菌水漂洗3次后接种于MS培养基
中。培养30 d后对孢子囊的污染情况进行统计, 90
d后对孢子囊的萌发率进行统计。在温度(25±2)
℃, 光强12 μmol·m-2·s-1, 每天14 h光照的条件下进
行培养。
3 原叶体的培养
将生长60 d的蛇足石杉原叶体切成3 mm×3
mm的小块(约2.4 mg)接种于含不同浓度激素的MS
固体培养基上, 分8组(表2), 每组40个外植体重
复。培养60 d后对培养物的形态进行观察, 并称量
每组原叶体的生物量。原叶体的增殖系数等于60
d后原叶体的生物量与接种量的比值。
4 孢子体的诱导
将生长60 d的蛇足石杉原叶体切成5 mm×5
mm的小块接种于无激素的MS固体培养基上, 然
后在培养基表面铺上一层薄薄的MS液体培养基。
培养90 d后统计孢子体的诱导情况, 孢子体的诱导
率为长出孢子体的原叶体数与原叶体接种总数的
比值。
5 组培原叶体和野生孢子体中石杉碱甲含量的检测
参考王峻等(2003)的方法检测石杉碱甲含
量。精确称取石杉碱甲标准品2.50 mg于25 mL容
量瓶中以无水乙醇溶解并定容 , 得到标准品溶
液。样品的制备方法如下, 取在培养基上培养了60
d的蛇足石杉原叶体和野生孢子体全株分别于60
℃下烘干至恒重, 粉碎后用研钵研成粉末, 精确称
取粉末0.12 g置于5 mL离心管中, 加入3 mL 2%酒
石酸溶液, 密封, 在70 MHz下超声3 h后12 000×g离
心5 min, 取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤即得样
品液。
色谱条件如下, 色谱柱为Diamonsil C18不锈
钢柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(Dikma), 流动相为甲
醇 -0 .8%醋酸铵溶液 (v /v=40 :60 ) , 流速为0 .8
mL·min-1, 检测波长为308 nm, 柱温为25 ℃, 进样量
为10 μL。按上述色谱条件进样, 记录石杉碱甲峰
面积, 用外标法计算样品中石杉碱甲的含量, 重复
3次取平均值。
实验结果
1 孢子的萌发
本实验室对蛇足石杉孢子囊进行过多次培养,
每次的取材时间都不一样, 分别为3~4月份、7~8
月份和11~12月份。其中只有11~12月份收集的孢
子囊在培养3个月后成功萌发出原叶体, 萌发率为
2.1%。自孢子囊萌发长出肉眼可见的心形原叶体
后(图1-A), 原叶体的生长速度加快, 并很快形成不
规则体(图1-B)。心形原叶体生长一周后于显微镜
下观察, 可见原叶体的心形下端长出大量毛状不
定根, 而上端的部分细胞形成疣状突起。灭过菌
的孢子囊在培养过程中部分受菌物(包括真菌、细
菌、放线菌)污染(表1), 初步统计真菌的污染率为
3.3%, 细菌的为0.6%, 放线菌的为0.8%。另外, 灭
图1 蛇足石杉原叶体的离体培养
Fig.1 In vitro culture of H. serrata prothallium
A: 蛇足石杉的原叶体(心形, 培养10 d); B: 蛇足石杉的原叶体(不规则体, 培养60 d); C: 蛇足石杉的原叶体在激素诱导下形成的愈伤组
织; D: 蛇足石杉的原叶体中长出孢子体。
包日双等: 蛇足石杉原叶体的培养及孢子体的诱导 395
过菌的孢子囊在培养基上培养的过程中长出了一
种绿色的藻类, 污染率为23.2%。
2 原叶体的培养
表2中的数据表明实验所用培养基中最适合
蛇足石杉原叶体增殖的培养基是无激素的8号培
养基, 在该培养基上培养60 d原叶体的增殖倍数达
到131.1, 原叶体的存活状态很好。最不适合原叶
体增殖的培养基是1号培养基, 在该培养基上培养
60 d原叶体的增殖倍数为59.8, 并发生了严重褐
化。在添加低浓度激素的4、5、7号培养基上原
叶体的增殖倍数和存活状态与8号培养基上的较
相近, 说明较高浓度的外源激素对原叶体的增殖
有抑制作用, 而低浓度的外源激素对原叶体的增
殖影响不大。实验还发现在MS培养基中含2.0
mg·L-1以上的2,4-D即可诱导原叶体形成愈伤组织
(图1-C, 表2)。
3 孢子体的诱导
蛇足石杉原叶体在MS培养基上培养90 d后成
功繁殖出孢子体(图1-D), 诱导率为4.0%, 随后孢子
体生长较缓慢。
4 组培原叶体和野生孢子体中石杉碱甲含量的测定
通过HPLC对蛇足石杉组培原叶体及野生孢
子体中的石杉碱甲含量进行测定, 结果表明在蛇
足石杉组培原叶体中石杉碱甲的含量为0.0059%,
是野生孢子体中石杉碱甲含量的0.25倍(图2)。
表1 蛇足石杉孢子囊培养过程中污染率的统计
Table 1 The endophytic contamination during H. serrata
sporangium culture
污染微生物的类型 污染率/%
绿藻 23.2
真菌 3.3
放线菌 0.8
细菌 0.6
合计 27.9
表2 不同培养基对原叶体生长的影响
Table 2 The effects of different media on growth of H. serrata prothallium
培养基编号
激素/mg·L-1
60 d后形成愈伤的比率/% 存活状态
60 d后培养物的
2,4-D 6-BA 平均增值倍数
1 5.0 0.5 100 生长较缓慢, 暗绿色愈伤整体出现褐化 59.8
2 2.0 0 67 生长较快, 愈伤稍有点褐化, 原叶体叶片翠绿 76.0
3 2.0 0.5 100 愈伤呈翠绿色, 生长较快 75.5
4 0.2 0.5 0 原叶体叶片翠绿, 生长较快 126.9
5 0.2 0 0 原叶体叶片翠绿, 生长快 129.5
6 0 2.0 0 原叶体叶片翠绿, 生长较快 100.2
7 0 0.5 0 原叶体叶片翠绿, 生长较快 121.5
8 0 0 0 原叶体叶片翠绿, 生长快 131.1
讨　　论
国内有多个实验室曾对蛇足石杉孢子囊进行
培养(马华升等2008; 李贵等2009; 韦景枫等2011),
其中只有韦景枫等(2011)报道成功萌发出原叶体,
但他们的培养用了219 d才得到原叶体, 比我们的
90 d要长2倍之多, 这差异可能与不同的取材有
关。我们在进行蛇足石杉孢子囊萌发实验的过程
图2 野生蛇足石杉和组培原叶体中石杉碱甲含量的测定
Fig.2 Determination of huperzine A in wild H. serrata and in
vitro culture prothallium
植物生理学报396
中, 经过表面灭菌后的孢子囊在培养基上培养30 d
后开始受绿藻和各种菌物的污染, 绿藻和这些菌
物应该源自孢子囊内部或皮层部分; 尤其是绿藻,
在其中出现的频率较大, 且有些原叶体萌发时周
围也有大量绿藻出现, 因此猜想绿藻在蛇足石杉
的生活史中可能起着一定的作用, 这方面的研究
还在进一步进行。
我们首次对蛇足石杉原叶体进行了增殖培
养。发现含2.0 mg·L-1以上2,4-D的MS培养基可诱
导蛇足石杉原叶体形成愈伤组织, 但随2,4-D浓度
的增加愈伤的生长速度减慢并伴随不同程度的组
织褐化, 低浓度的生长素和细胞分裂素对原叶体
的生长影响不大。总的来说, 外源激素对于蛇足
石杉的增殖意义不大。在实验过程中我们也尝试
采用不同的激素组合对原叶体外植体进行分化诱
导, 我们发现像蕨类这样的低等植物与被子植物
有很大差异, 被子植物的单倍体在激素的诱导下
可以发育长成二倍体母本所具有的形态特征, 只
是在个体大小上比二倍体略小, 然而蕨类植物的
单倍体(原叶体)则不能, 只能长愈伤或原叶体本身
所具有的叶片。我们还发现蕨类植物即使是很小
的外植体在无激素的MS上也能很好的生长发育,
长成一个完整的原叶体个体并进行有性繁殖, 说
明蕨类植物的原叶体细胞具有极强的再生能力和
全能性。
蛇足石杉原叶体人工培养3个月后长出孢子
体, 这也是首次在培养基上通过有性繁殖得到蛇
足石杉孢子体。在实验过程中我们将生长2个月
的原叶体进行切割并重新接种于新培养基上, 这
样反复接转, 但始终不能产生孢子体(说明只有生
长足够时间且个体足够大的原叶体才能产生孢子
体)。实验条件下从孢子萌发至原叶体中长出孢子
体的初始叶片共需要6个月以上的时间, 如若想用
目前的方法培养得到大量蛇足石杉幼苗还远远赶
不上生产的需要, 因此在这方面我们还需要进行
大量的工作提高育苗效率。
经HPLC检测, 蛇足石杉原叶体中石杉碱甲含
量为0.0059%, 仅为母本 (野生孢子体 )中含量
(0.0223%)的0.25倍。石杉碱甲属于次生代谢产物,
在植物体内的积累需要一个过程, 原叶体在培养
基上的培养时间远远短于天然状态下孢子体的生
长时间, 而且原叶体与孢子体相比分化程度较低,
分化程度较低的组织其次生代谢物的含量也相对
会较低(邓盾等2009)。孢子体的生长较慢, 目前材
料还不够石杉碱甲测定的需要, 因此对组织培养
得到的蛇足石杉孢子体中石杉碱甲的含量还有待
检测。
参考文献
邓盾, 王永飞, 马三梅,李晓东(2009). 采用植物离体培养技术生产
精油. 植物生理学通讯, (1): 97~102
郭斌, 徐玲玲, 尉亚辉, 刘春朝(2009). 千层塔的研究进展. 中国中药
杂志, (16): 2018~2022
李贵, 李菁, 黎有有, 唐源江, 魏华(2009). 蛇足石杉外植体表面消
毒及内生菌消除方法. 吉首大学学报(自然科学版), 30 (4):
100~103
梁昊(2010). 千层塔组织培养体系的建立及激素对丛生苗生长和石
杉碱甲合成的影响[硕士论文]. 合肥: 合肥工业大学
马华升, 孙玉强, 童建新, 阮松林, 忻雅, 钱丽华, 祝水金(2008). 千层
塔组织培养中外植体消毒灭菌研究初报. 杭州农业科技, (4):
15~18
盛束军, 徐建中, 王志安, 俞旭平, 张建华(2000). 千层塔扦插繁殖研
究. 资源开发与市场, 16 (5): 268~269, 293
覃大吉, 杨永康, 向极钎, 曾凡忠, 李亚杰, 殷红清, 邹迎春, 马进
(2010). 千层塔NFT扦插育苗技术研究. 湖北民族学院学报(自
然科学版), 28 (1): 18~21
王德立, 冯锦东(2011). 蛇足石杉的芽胞特性和芽胞繁育技术. 安徽
农业科学, 39 (2): 805~807
王峻, 吴伟, 潘胜利(2003). HPLC法测定6种石杉科植物中石杉碱
甲的含量. 中草药, 7: 607~608
韦景枫, 陶文丞, 钟漫, 蒙先举, 张声涛, 覃凤好(2011). 千层塔孢子
萌发研究初报. 黑龙江生态工程职业学院学报, 24 (5): 9~10
张守圭(1985). 治疗重症肌无力新药——石杉碱甲通过鉴定. 中国
新药与临床杂志, 4: 235
浙江药用植物志编写组(1980). 浙江药用植物志. 杭州: 浙江科学
技术出版社, 51
Ma XQ, Gang DR (2008). In vitro Production of Huperzine A, a
promising drug candidate for Alzheimers disease. Phytochemis-
try, 69: 2022~2028
Wang R, Tang XC (2005). Neuroprotective effects of huperzine A. A
natural cholinesterase inhibitor for the treatment of Alzheimer’s
disease. Neurosignals, 14: 71~82