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EFFECTS OF CULTURE ENVIRONMENT ON CALLUS GROWTH AND DL-TETRAHYDRO-PALMATINE CONTENT IN CULTURES OF CORYDALIS REMOTA

培养条件对齿瓣延胡索愈伤组织生长及延胡索乙素含量的影响



全 文 :第 23 卷 第 1 期             植   物   研   究 2003年 1 月
Vol.23 No.1           BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan.,  2003
培养条件对齿瓣延胡索愈伤组织生长及延胡索乙素含量的影响
张东向
(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院 ,齐齐哈尔 161006)
摘 要 研究了不同培养条件对齿瓣延胡索(Corydal is remota)愈伤组织生长及延胡索乙素
(THP)含量的影响 。结果表明 ,2 ,4-D较 NAA 更有利于提高培养物鲜重 ,加速细胞增殖。培养
基添加 2.0mg/L 2 ,4-D 和 1.0mg/L BA 不仅有利于干物质积累 ,而且显著提高 THP 水平。蔗
糖不仅可提高培养物鲜重 ,而且与半乳糖组合可显著促进干物质积累和 THP 水平的提高。水解
酪蛋白和水解乳蛋白均有利于愈伤组织生长和 THP 含量的提高 ,450mg/ L 的水解乳蛋白处理组
THP 含量最高。光照可提高培养物鲜重和 THP 含量 。
关键词 齿瓣延胡索;愈伤组织培养;延胡索乙素;培养条件
EFFECTS OF CULTURE ENVIRONMENT ON CALLUS
GROWTH AND DL-TETRAHYDRO-PALMATINE CONTENT
IN CULTURES OF CORYDALIS REMOTA
ZHANG Dong-Xiang
(Colleg e of Life Science and Technology , Qiqihaer University , Qiqihaer 161006)
Abstract The ef fects of culture environment on callus grow th and content of dl-tet rahydro-palma-
tine(THP)in the cultures from stem tubers of Corydalis remota were discussed.The resul ts showed
that 2 ,4-D was bet ter for g row th of callus cells than NAA.The dry weight of the callus and level
of THP were promoted when 2 mg/L 2 , 4-D and 1 mg/L BA were added to the medium.Sucrose
increased the f resh w eight of callus , and the combination of sucrose and galactose promo ted the in-
crease of callus dry weight and raise of THP level , significant ly .Either casein hydrolysate (CH)o r
lactolbumin hydrolysate (LH)was favored to the grow th of callus and raise of THP level , and there
was highest level of THP in the group treated w ith 450 mg/ L LH.Light enhanced the grow th of cal-
lus and raise the level of THP .
Key words Corydalis remota;callus culture;THP ;culture environment
  延胡索(Corydalis Y anhuso W.T .Wang),为
罂粟科紫堇属植物 ,其干燥块茎即为著名的中药
———元胡 ,具有行气止痛 、活血散瘀的功效 ,对妇女
病有良效 ,系《中国药典》法定药材[ 1] 。在黑龙江
省主要有两个种 、一个变种 ,即齿瓣延胡索(C.re-
mota Fisch.et M axim.)、东北延胡索(C.ambigua
Cham.et Schltd.var.amurensis Maxim)和全叶延
胡索(C.repens Mandl.et M ǜhld.)[ 2] 。其中齿瓣
本研究为齐齐哈尔市青年基金项目。
作者简介:张东向(1963-),男 ,理学硕士 ,副教授 ,从事植物生理学与植物细胞工程研究。
收稿日期:2001-03-16
延胡索主要分布于黑龙江省大 、小兴安岭地区 ,全
草含多种生物碱 ,其中延胡索乙素(dl-tetrahydro
-palmatine)是临床上主要的镇痛制剂 ,又名四氢
巴马亭;其块茎入药 ,对胃痛 、泻痢腹痛 、关节痛 、妇
科痛经和外伤肿痛均有良效 ,是黑龙江省重要的药
用资源植物。然而 ,由于连年采挖 ,齿瓣延胡索的
野生资源日益匮乏 ,加之少有栽培 ,市场上供求矛
盾日益突出 。通过植物组织和细胞培养提取药物
无疑为解决这一问题提供了有效途径。
在国内 ,曾针对浙江东阳延胡索组织和细胞培
养及有效成分分析开展过研究[ 3 ,4] ,有关齿瓣延胡
索的同类研究国内外尚未见报道。我们以齿瓣延
胡索为材料 ,研究其愈伤组织培养和发生的条件 ,
以及培养条件中主要物理 、化学因素对 THP 形成
和水平的影响 ,旨在为药用植物组织和细胞培养技
术的发展积累资料 ,为植物细胞大量(发酵)培养奠
定基础 ,以达到合理开发利用植物资源的目的 。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料齿瓣延胡索(Corydalis remota Fisch
et Maxim)由沈阳药科大学药用植物园提供。
1.2 愈伤组织的诱导
以齿瓣延胡索块茎为外植体 ,用50 mg/L GA3
溶液浸泡 24 h ,打破休眠。于超净台上经 70%酒
精消毒 20 s , 0.1%HgCl2 表面灭菌 5 min ,无菌水
水洗 5次后 ,切成厚 2 mm 的半圆形(每块外植体
间质量无显著差异),接种于培养基上 ,于 25±1℃
培养。培养基以 MS为基本培养基 ,附加一定比例
的植物激素 ,3%的蔗糖和 450 mg/L 水解酪蛋白 ,
pH5.8。每三周继代一次 ,选择松散 、易碎的鲜黄
色愈伤组织做为继代培养的材料。
1.3 实验条件设计
植物激素用 2.4-D 、NAA 和 BA 、KT 组成 8
个不同的种类及浓度组合;碳源则以蔗糖 、半乳糖
和甘露糖设计 4个组合;有机附加物则重点比较水
解乳蛋白与水解酪蛋白的作用效果;此外 ,还对光
照和黑暗条件下愈伤组织生长和延胡索乙素含量
的差异做了比较 。实验设 3个重复 。
1.4 生理生化指标的测定
1.4.1 细胞鲜重 、干重的测定 愈伤组织鲜重直接
在无菌电子天平上称重;将鲜培养物于 60℃下烘 4
小时至恒重 ,测干重 。设 3个重复 。
1.4.2 延胡索乙素含量测定 采用薄层层析—紫
外分光度法检测[ 5] 。取齿瓣延胡索培养物于 60℃
下烘至恒重 , 粉碎后过 60 目筛 , 准确称取粉末
0.5 g于具塞试管中 ,0.1 mL 氨水润湿 ,加苯 4 mL
冷浸提 24h 。用定量毛细管吸取样品液 5μL ,点于
硅胶 G薄板(20cm ×20 cm)上 ,样点直径 d=2 ~ 3
mm ,同板有标准品随行。展层剂用苯+95%乙醇
(4:1v/v).展层后吹干 ,碘熏蒸 1 min ,再将碘挥尽 。
于紫外检测仪上观察延胡索乙素的绿色荧光斑 。
设 6个重复 ,求得其平均 Rf=0.76±0.09。
用自制抽滤装置收集含延胡索乙素的硅胶 G
粉末 ,用无水乙醇洗脱 ,洗脱液于 755-紫外分光
光度计上λ280 nm 下读取 O.D 值 ,以盐酸延胡索
乙素标准液绘制标准曲线 ,并换算延胡索乙素含量
(mg/g干重)。
2 实验结果及分析
2.1 植物激素对延胡索愈伤组织生长和 THP 含
量的影响
采用两种生长素类(2.4-D 、NAA)及细胞分
裂素(BA 、K T),编成 8 种浓度组合 ,结果见表 1。
2.4 -D 及其与细胞分裂素组合(1 ~ 4 号), 较
NAA(5 ~ 8号)更有利于提高培养物鲜重 ,加速细
胞增殖 、生长 ,其中 2 mg/L 2.4-D效果最显著 。
在本实验中单独使用NAA 和2.4-D ,均显著提高
培养物干重 , 3种处理之间没有显著差异 , 2 mg/L
2.4-D+1.0 mg/ L BA(3号)的组合可显著提高
延胡索乙素(THP)含量 ,其次 4 号和 8号处理对
THP 积累最有利。结果表明 ,3号处理不仅有利于
干物质累积 ,而且显著提高 THP 含量 。
2.2 不同碳源对愈伤组织生长和 THP 含量的影

采用蔗糖 、半乳糖和甘露糖为碳源在表 2的四
个组合中 ,蔗糖对于细胞鲜重提高最为有利;蔗糖
+半乳糖显著高于蔗糖+甘露糖 ,而且对于提高干
物质积累的作用最为显著 ,与之相比 , 3和 4 号的
效果其次 ,且二者之间没有显著差异 ,四种处理中 ,
蔗糖+半乳糖处理组的 THP 含量最高 , 4 号处理
与之水平相接近 ,表明附加半乳糖和甘露糖对于促
进 THP 生物合成是有利的 。
871 期           张东向:培养条件对齿瓣延胡索愈伤组织生长及延胡索乙素含量的影响
表 1 植物激素对延胡索愈伤组织生长和 THP含量的影响
Table 1 Effects of phytoho rmones on callus culture and content of THP in C.remota
编号
No.
植物激素
Phytohormone
浓度
Concent rat ion
(mg/ L)
鲜重(g/瓶)
Fresh w t.
(g/Flask)
干重(g/瓶)
Dry w t.
(g/ Flask)
THP 含量
Conten t of THP
(mg/ gDW)
1 2.4-D 1.0 14.9±1.0 bB 0.49±0.10 aA 0.032 dE
2 2.4-D 2.0 19.3±1.6 aA 0.46±0.05 abA 0.048 bC
3 2.4-D+BA 2.0+1.0 12.6±0.9 cC 0.45±0.03 abB 0.052 aA
4 2.4-D+KT 2.0+1.0 14.11±1.4 bB 0.43±0.06 bB 0.051 bB
5 NAA 2.0 11.2±1.4 cdC 0.51±0.07 aA 0.044 cC
6 NAA+BA 2.0+1.0 10.0±1.1 cdC 0.39±0.03 cC 0.040 cCD
7 NAA+KT 2.0+1.0 6.1±0.8 fE 0.24±0.05 dD 0.037 cD
8 NAA+KT 0.5+1.0 9.0±1.0 deD 0.40±0.04 bC 0.056 bB
  注:大写字母表示 0.05水平显著;小写字母表示 0.01水平显著。下同。
Capi tal let ters represents diff erence is highly signi ficant;Low ercase letters represents significant diff erence.
表 2 碳源对愈伤组织生长及 THP含量的影响
Table 2 Effects of different carbon sources on callus grow th and content of THP in C.remota
编号
No.
碳源
Carbon sources
浓度
Concent rat ion
(mg/ L)
鲜重(g/瓶)
Fresh w t.
(g/Flask)
干重(g/瓶)
Dry w t.
(g/ Flask)
THP 含量
Conten t of THP
(mg/ gDW)
1 蔗糖 Sucrose 3 15.3±1.3 aA 0.46±0.05 bC 0.045 bC
2 蔗糖+半乳糖 Suc.+Gal. 3+1 11.1±1.4 bB 0.63±0.17 aA 0.057 aA
3 蔗糖+甘露糖 Suc.+Man. 3+1 9.6±0.8 bC 0.51±0.10 aB 0.036 cD
4 蔗糖+甘露糖+半乳糖 Suc.+Man.+Gal. 2+1+1 8.5±1.0 cD 0.50±0.03 aB 0.051 bB
2.3 有机附加物对愈伤组织生长和 THP 含量的
影响
对水解乳蛋白(LH)和水解酪蛋白(CH)的作
用效果与对照进行了比较(表 3)。结果表明 ,添加
两种有机附加物均有利于提高培养物鲜重 、干重和
延胡索乙素(THP)含量;而这两种有机物各浓度之
间的作用效果又存在显著差异 。有机附加物采用
450 mg/L ,细胞鲜重水平最高 ,其中水解酪蛋白更
有利于干物质积累 ,但从提高 THP 含量来看 ,450
mg/L 水解乳蛋白的作用效果最佳 ,其培养物 THP
含量显著高于水解酪蛋白。
表 3 有机附加物对愈伤组织生长和 THP 含量影响
Table 3 Effects of o rganic additives on callus g rowth and content of THP in C.remota
有机附加物
Organic addit ives
浓度
C oncent ration
(mg/ L)
鲜重(g/瓶)
Fresh w t.
(g/ Flask)
干重(g/瓶)
Dry w t.
(g/ Flask)
THP 含量
Content of THP
(mg/ gDW)
1CK 0 8.4±1.2 cD 0.35±0.05 cD 0.016 dE
水解乳蛋白 300 8.9±1.0 cD 0.39±0.02 bC 0.033 cD
Lactalbumin hydrolysate 450 13.9±1.8 aA. 0.43±0.08 aB 0.058 aA
600 9.5±1.3 bC 0.42±0.06 bB 0.051 aB
水解酪蛋白 300 9.3±1.5 bC 0.40±0.10 bC 0.042 bC
Casein hyd rolysate 450 14.0±2.0 aA 0.48±0.08 aA 0.053 aB
600 13.2±1.7 aB 0.54±0.11 aA 0.047 bC
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图 1 光照对愈伤组织生长和 THP含量的影响
.1 Effects of lig ht on callus g rowth and content of THP in C.remota
2.4 光照对愈伤组织生长和 THP 含量的影响
在固体培养中 ,我们采用了光照(荧光灯 2000
Lx ,16 h光照/8 h黑暗)及黑暗两种处理。结果如
图1所示 ,光照显著促进培养物鲜重和干重的增
加。并提高延胡索乙素(THP)含量 ,其中鲜 、干重
分别比黑暗条件下提高了 31%和 30.3%;THP 含
量则为黑暗的 4倍。
3 讨 论
各种植物激素对植物愈伤组织诱导和分化的
影响存在差异 。本实验表明 , 2 , 4-D 对于诱导齿
瓣延胡索愈伤组织和提高延胡索乙素的含量的作
用效果比 NAA 更为显著 , 2 , 4-D 与 BA组合有
利于培养物干物质积累和 THP含量的提高 。
碳源对于植物组织和细胞生长具有两方面的
作用 ,一是提供必要的碳源和能源 ,二是维持培养
基的渗透压 ,调节细胞对水分及营养物质的摄取 。
在植物组织培养中 ,通常以蔗糖为主要碳源。近来
报道葡萄糖 ,半乳糖和甘露糖做为真菌诱导物的组
成成分 ,由它们组成的多糖及糖蛋白对愈伤组织生
长及次生代谢产物的产生发挥重要作用[ 6] ,我们
对半乳糖和甘露糖做为辅助碳源与蔗糖组合 ,不仅
增加愈伤组织的鲜重和干重 ,而且 THP 含量显著
提高 ,蔗糖与半乳糖组合对于提高干重和 THP 含
量更为有利。
水解乳蛋白和水解酪蛋白这两种有机附加物
的作用效果比较的表明 ,对于提高鲜重而言 ,二者
在450 mg/ L时效果最好 ,而对于提高培养物干重
和 THP 含量而言 ,二者存在差异 ,其中水解酪蛋白
有利于干物质积累 ,而水解乳蛋白在提高鲜重的同
时 ,还促进 THP 的合成 。
有关光照对于细胞生长和次生代谢产生的影
响报道不一 ,一方面认为光照抑制黄连[ 7] 紫草[ 8]
的细胞生长和生物碱形成 ,另一方面足够的光照强
度适于青蒿细胞生长和芽形成 ,提高青蒿素的含
量[ 9] ,此外还有利于雪莲培养细胞中黄酮的形
成[ 10] ,在人参色素自养型细胞中也有类似的结
果[ 11] 。本实验结果表明 ,光照对齿瓣延胡索愈伤
组织生长及延胡索乙素的形成具有促进作用 ,在光
照条件下不仅生物量积累提高了 1/3 ,而且 THP
含量为暗培养的 4 倍。有关培养基中各主要无机
离子和有机成分的作用效果我们将做进一步研究 。
参 考 文 献
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