全 文 ：　
第 25卷　第 2期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　4月
Vo .l 25　No. 2　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH April, 　2005
基金项目:国家高技术 863计划(2002AA241111)
第一作者简介:程玉祥(1972— ),男 ,讲师 ,博士研究生 ,主要从事植物生物化学与分子生物学研究。
*　通讯作者 Au th or for correspondence　E-m ail:shenku iliu@ nefu. edu. cn
收稿日期:2004 - 10 - 07
茶树叶糖蛋白分离及鉴定的初步研究
程玉祥　柳参奎*
(东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心 , 哈尔滨　150040)
摘　要　茶叶是一种有益健康的保健食品 ,保健功能在于它有多种化学活性成分 。近年来研究表
明 ,茶叶糖蛋白可能是茶叶的保健因子之一 。从茶树叶中提取了总蛋白 、45% ～ 70%硫酸铵分级
总蛋白 、分级蛋白 Sephadex G-100凝胶层析分离出粗糖蛋白 ,根据糖蛋白糖链及蛋白的对照染色
鉴定出多种茶树叶糖蛋白 ,并从 SDS-胶上快速纯化了三种茶叶糖蛋白。 ConA-Sepharose 4B亲和
层析从茶树叶总蛋白中分离出 16种天然活性糖蛋白 。
关键词　茶树;糖蛋白;分离;鉴定;ConA-Sepharose 4B亲和层析
Study on isolation and determ ination of glycoprote in from tea p lant leaves
CHENG Yu-X iang　LIU Shen-Kui*
(A lka li So ilNa tura l Env ironm en tal S cience Center, Northeast Fo rest University, H arbin　150040)
Abstract　Tea is a hea lthy food, beacause it has various bioactive components. Recent research indica-
ted that tea g lycoprote inm igh t be a b ioactive component in tea. In this repo rt, to tal prote insw e re ex trac-
ted from tea fresh leaves, and coarse g lycoproteins we re iso lated through the methods of ammon ium su l-
fate frac tions (45% ～ 70%) and SephadexG-100 chromatog raphy. A ccording to con trol staining o f g ly-
can and polypeptide, glycopro teinsw ere de te rm inated by using Pierce Ge lCode©G lycoprote in Staining
K it and Coomassie B rillian t B lue R250, and three tea g lycoprote ins w ere fast purified from the SDS-
ge ls. Six teen na tive b ioactive g ly coprote insw e re gained from tea to tal prote ins by ConA-Sepha rose 4B af-
finity chromatog raphy.
Key words　 tea plant;g ly copro te in;isola tion;de term ination;ConA-Sepharose 4B affin ity chromatog-
raphy
茶叶是一种非常有益健康的保健食品。绿茶
的抽提物在抗癌 、防衰老 、防治心血管疾病等 [ 1 ～ 4]
多个方面有着显著的功效。粗老茶中茶多糖在降
血糖 、治疗糖尿病方面的功效也已被人们所广泛接
受 [ 5 ～ 8] ,汪东风从粗老茶提取的粗多糖中纯化出一
种糖蛋白 ,免疫活性实验表明它具有显著的活性功
能 [ 9 ～ 11] ,可能是茶叶的保健因子之一 。目前 ,在茶
树叶中茶叶糖蛋白研究还几乎没有报道 。为了进
一步研究茶叶糖蛋白保健功能 ,对加工成茶叶的原
料———茶树叶中糖蛋白种类及含量的研究显得较
为必要。本研究从茶树叶中提取了总蛋白 、45% ～
70%硫酸铵分级总蛋白 、分级蛋白 Sephadex G-100
凝胶层析分离出粗糖蛋白 ,根据糖蛋白糖链及蛋白
的对照染色精确地鉴定出多种茶树叶糖蛋白 ,并从
SDS-胶上快速纯化了三种茶叶糖蛋白。另外 , Co-
nA-Sepharose 4B亲和层析从茶树叶总蛋白中分离
出 16种天然活性糖蛋白。从而 ,建立了茶树叶糖
蛋白高感度准确鉴定及分离法。这一方面使得茶
树叶中活性成分———糖蛋白的研究变得方便 、快
捷;另一方面此方法能快速 、简便地纯化未知植物
糖蛋白 (包括茶叶糖蛋白 ),用于质谱分析 、其氨基
酸测序 、糖链研究及其活性 、药理实验等。
1　材料与方法
1. 1　材料
取自茶树品种为龙井 43号 ,一芽 4, 5叶茶的
鲜叶 ,来自安徽农业大学茶叶系品种茶园 。
1. 2　方法
1. 2. 1　茶树叶总蛋白的提取
取 10 g茶树叶丙酮粉 [ 12] ,加入配制好的 、预
冷的 200 mL Buffer A(75mmol /L、pH 7. 2磷酸钠;
0. 15mo l /L NaC l;5mmo l /L EDTA;5%甘油;2%
PVP - 40;0. 05 % TritonX - 100;5mmol /L盐酸苯
甲脒;1mmo l /L PM SF;10mmol /L V c,其中盐酸苯
甲脒 、PM SF、V c为临用前加入到缓冲液中 ),用微
型匀浆机以 20 000 r /m in高速匀浆 60 s,抽提液在
4℃、13 000 r /m in、离心 45m in,收取上清液 。
1. 2. 2　茶树叶总蛋白硫酸铵分级
向总蛋白提取上清液中加入硫酸铵 , 收集
45% ～ 70%硫酸铵饱和度的分级蛋白组分 , Buffer
A转溶 、透析 、浓缩 、BCA P ro tein A ssay K it定量蛋
白 , 0℃保存 、用于凝胶层析上样 。
1. 2. 3　Sephadex G-100凝胶层析
制备 Sephadex G-100凝胶层析柱 [ 12] ,取 45%
～ 70%硫酸铵饱和度分级蛋白样品 5mL,上样到
AK 2. 6 /85层析柱 , Buffer B(75 mmo l /L、pH 7. 2磷
酸钠;0. 15 mo l /L N aC l)洗脱 , 280 nm检测 ,流速为
0. 5mL /m in,每管收集 2. 5 mL。
1. 2. 4　茶树叶糖蛋白的鉴定
用苯酚 —硫酸法 [ 13]对凝胶过滤的每一收集管
进行糖量的测定 ,绘制各收集管的糖含量趋势峰 ,
比较收集管中蛋白 280 nm的吸收峰与糖含量的高
低趋势峰的关系 ,若二者呈现一致重叠的趋势 ,可
初步判断糖蛋白的存在[ 13] 。为了进一步准确鉴定
糖蛋白 ,进行 SDS-PAGE ,电泳完毕 ,对 SDS-胶分别
进行考马氏蓝染色[ 14]和糖蛋白试剂盒染色(Pierce
G elCode© G lycopro tein S taining K it)。
1. 2. 5　茶树叶糖蛋白的 SDS-胶上纯化
电泳两组同样样品的粗糖蛋白 ,完毕后取出
SDS-胶 ,把胶切成两部分 ,分别进行考马氏蓝染色
和糖蛋白试剂盒染色 。由于两块胶的条件完全一
样 ,根据糖蛋白试剂盒染色结果 ,找到对应考马氏
蓝染色的蛋白带 ,并切下它 ,放入一个 1. 5mL的离
心管中 , 用 20%的甲醇清洗胶至中性 , 加入含
0. 5 % SDS的 pH 7. 4、0. 125 mol /L Tris—HC l,用
微型匀浆器以 20 000 r /m in匀浆 1 m in,放入37℃水
浴4 h。 20 000 r /m in、离心 25 m in,移取上清液 ,加
入等体积的 50% TCA (W /V)沉淀蛋白 ,沉淀用
- 20℃冷丙酮清洗 3次后冷冻干燥。
1. 2. 6　茶树叶总糖蛋白亲和层析分离
ConA-Sepharo se 4B亲和层析柱 (XK 1. 6 /20)
用 Buffer C ( pH 7. 4, 25mmol /L Tris—HC l;
0. 5mo l /L N aC l; 1mmo l /L C aC l2; 1mmo l /L
M nC l2;1mmol /L M gC l2)平衡 ,把 Sephadex G-100
凝胶层析完的粗糖蛋白样品全部上样到 ConA-
Sepharose 4B亲和柱上。接着用 Buffe rC洗去未结
合到 ConA-Sepha rose 4B亲和柱上的杂蛋白 ,直到
在紫外 280 nm检测不到蛋白吸收 。用 Buffer D
(Bu ffe rC +0. 5 mol /L methy lα-D-g lucopyranoside)
竞争洗脱下茶叶糖蛋白 ,流速为 0. 15 mL /m in,糖
蛋白按峰收集 ,并对蒸馏水透析 、冷冻干燥。
2　结果与分析
2. 1　茶树叶粗糖蛋白的分离
茶树鲜叶富含大量的多酚类物质 ,是茶叶活性
物质之一 [ 15] ,但在蛋白质的提取过程中 ,多酚存在
严重影响茶树叶总蛋白的提取[ 16] 。制备丙酮粉及
加入多酚吸附剂是去除茶树叶中大量酚类物质 、提
高总蛋白浸出率的有效方法 。在进行茶树叶糖蛋
白的分离时 ,硫酸铵分级沉淀茶树叶总蛋白质 ,使
含糖蛋白的粗蛋白与水溶性的多糖等杂质分离
开[ 17] 。茶树叶 45% ～ 70%硫酸铵分级蛋白的
Sephadex G-100凝胶层析使粗糖蛋白从混合蛋白
中进一步得到分离。
2. 2　茶树叶糖蛋白的鉴定
从茶树叶 45% ～ 70%硫酸铵分级蛋白 Sepha-
dex G-100凝胶层析的各管收集液中 ,苯酚—硫酸
法测定糖含量高低 ,结合各管收集液280 nm蛋白吸
收峰 。结果发现有一部分蛋白吸收峰与其对应的
收集液中糖含量峰呈现一致的重叠 ,其它收集管中
未发现两者的重叠峰 ,结果如图 1所示:洗脱液的
60 ～ 82管中 ,可能含有糖蛋白 ,因为在同样的收集
管中蛋白质含量高低与糖含量高低正好呈现一致
的趋势。糖蛋白是糖链通过 N-或 O-共价键的方式
连接到多肽链上[ 18, 19] 。为了准确地鉴定其是否为
糖蛋白 ,进行了糖蛋白 SDS-胶上鉴定 。
182 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
图 1　45% ～ 70%硫酸铵分级蛋白的 Sephadex G-100洗脱
实线为 280 nm检测;虚线为苯酚—硫酸法 490 nm检测。
F ig. 1　E lution o f pro teins prec ipitated by 45% ～ 70%
amm onium sulfa te on Sephadex G-100 co lum n
solid line, 280 nm;dotted line, 490 nm.
糖链染色鉴定糖蛋白结果发现:分级蛋白洗脱
液的 67 ～ 80管中含有糖蛋白 (如图 2 ,糖蛋白
SDS— PAGE呈现洋红色带 ),第 67 ～ 70管中糖蛋
白的种类较多 ,且含量较高 ,第 72 ～ 75管中可能只
有一种高含量的糖蛋白 。在其它收集管中没有检
测出糖蛋白 ,这与糖蛋白的初步鉴定结果相一致。
图 2　45% ～ 70%硫酸铵分级蛋白 SephadexG-100
层析收集液中糖蛋白染色鉴定
1～ 14分别为第 67 ～ 80号收集管
F ig. 2　 De tec tion o f g lycopro te ins from the e lu tions of
pro teins in Sephadex G-100 co lum n, prec ip itated by
45 ～ 70 pe rcen t amm onium sulfa te, by P ierceG elCode©
G lycopro-te in Sta ining K it
No. 67 ～ 80 tubesw ere denoted by num ber 1 to 14 respectively
2. 3　茶树叶糖蛋白的纯化
茶树叶糖蛋白的纯化是对同一种糖蛋白的蛋
白部分及糖链部分分别进行考马氏蓝染色和糖蛋
白试剂盒染色对照染色 ,从 SDS胶上准确地鉴定
了茶树叶糖蛋白带 ,采用蛋白质被动扩散回收方式
从巳考染的胶中回收了茶树叶糖蛋白带 。图 3 A、
B图是同一块10% SDS胶电泳后切开染色的 , A、B
泳道是同一个样品 (45% ～ 70%硫酸铵分级蛋白
Sephadex G-100凝胶过滤的 76 ～ 78管收集液 ), A
图为 SDS胶的考马氏蓝染色 , B图为糖蛋白试剂盒
染色 。在 B图上 ,糖蛋白试剂盒染色的糖蛋白呈
洋红色 ,其它非糖蛋白则不呈现洋红色带 。根据 B
图上呈洋红色糖蛋白带 ,从对应的考马氏蓝染色的
SDS胶分别切下 a、b、c糖蛋白带 ,进行被动扩散回
收。
图 3　粗糖蛋白在 SDS-胶上对照染色鉴定
(A) SDS-胶的考马氏蓝染色;(B)糖蛋白鉴定试剂盒染色
F ig. 3　De tection of the g ly copro tein by the contro l staining
re spective ly w ith Coom assie B lue
(A)and w ith P ierce GelCode©G lycoprotein S taining K it(B) in the SDS-gels.
图 4　SDS-胶上纯化的 a、b、 c三个茶树叶糖蛋白的鉴定
(考马氏蓝染色和糖蛋白鉴定试剂盒染色).
1蛋白标准分子量(29 000～ 116 000);2, 4辣根过氧化物酶
(糖蛋白标样);A:3, 5. SDS-胶上纯化的茶树叶糖蛋白 a;
B:3, 5纯化的茶树叶糖蛋白 b;C:3, 5纯化的茶树叶糖蛋白 c
F ig. 4　Determ ination of a, b, c th ree tea g ly copro teins
purified from SDS-ge l( the sta ining w ith C oom assie B lue and
w ith P ierce Ge lCode© G lycop ro te in Staining K it respective ly)
1. ProteinM aker(29 000 ～ 116 000);2, 4. peroxidase( glycoprotein
Maker). A:3, 5. tea glycoprotein s‘ a’ pu rified from SDS-ge.l ;
B:3, 5. tea g lycoprotein s‘ b’ ;C:3, 5. tea glycoproteins ‘ c’ .
1832期 程玉祥等:茶树叶糖蛋白分离及鉴定的初步研究
被动扩散回收的 a、b、c茶树叶糖蛋白带进行
SDS-PAGE和染色鉴定结果如图 4。从 SDS-PAGE
的结果看 ,纯化的茶树叶糖蛋白达到电泳纯且没有
分解的迹象 。这样糖蛋白可以从 SDS胶上得到纯
化 ,纯化后的糖蛋白可直接用于糖蛋白的蛋白部分
氨基酸标签测定或制备糖蛋白抗体等用途。用这
种方法我们得到 10多个未知茶树叶糖蛋白 ,并正
在进行它们的蛋白部分氨基酸及糖链功能的研究。
2. 4　天然活性茶树叶糖蛋白的亲和层析
用 ConA-Sepharose 4B亲和层析柱我们分离了
具有天然活性的茶叶总糖蛋白 ,通过染色鉴定发现
有 16种之多 ,结果如图 5。我们并在 SDS-胶进行
了糖蛋白的含量的密度扫描。粗老茶中茶多糖在
降血糖 、治疗糖尿病方面的功效也已被人们所广泛
接受[ 7 ～ 9] ,汪东风从粗老茶提取地粗多糖中纯化出
一种糖蛋白 ,免疫活性实验表明它具有显著的活性
功能[ 9 ～ 11] 。但是 ,分离天然活性的茶叶总糖蛋白
这还是第一次。目前 ,我们将这个总的茶树叶天然
活性的糖蛋白进行动物活性及药理实验。
图 5　ConA-Sepha rose 4B亲和层析分离的
天然茶叶总糖蛋白的鉴定
A为考马氏蓝染色 、B为糖蛋白鉴定试剂盒染色 、
C为泳道 A SDS-胶上茶叶总糖蛋白含量的密度扫描
F ig. 5　De te rm ina tion o f na tive tea tota l g lycoprote ins iso lated
by ConA-Sepha rose 4B a ffin ity ch rom a tog raphy
A . w ith C oomassie B lue;B. w ith Pierce GelCode© G lycop rotein
S tain ing Ki t;C. dens itom etry of lane A of the C oom assie-stained
SDS-ge l con tain ing the native tea total glycoprotein s.
3　讨论
茶树叶糖蛋白是从茶树叶总蛋白中分步分离
出的 ,多酚存在严重影响茶树叶总蛋白的提取 [ 20] ,
茶树叶丙酮粉加 PVPP研磨法能有效地去除酚类 、
脂类成分 ,可明显提高茶树叶总蛋白提取量 [ 21] 。
另外 ,多糖是分离 、纯化糖蛋白最大障碍 ,多糖的存
在不但影响糖蛋白的 SDS电泳[ 22] ,还干扰糖蛋白
的纯化 、鉴定。在进行茶树叶糖蛋白的分离时 ,硫
酸铵分步沉淀蛋白质使粗蛋白与水溶性的多糖等
杂质分离开[ 17] 。 Sephadex G-100凝胶层析使茶树
叶粗糖蛋白得到了进一步分离 。
糖蛋白的检测 、鉴定依靠蛋白检测 、糖链鉴定
两种方式相结合[ 13, 23] 。茶树叶糖蛋白的鉴定采用
了初步鉴定和糖蛋白染色鉴定 , 初步鉴定根据
280 nm蛋白吸收峰与糖量高低趋势峰二者是否呈
现重叠 ,可初步判断可能存在糖蛋白;糖蛋白染色
鉴定采用蛋白质考马氏蓝染色 、糖蛋白糖链染色从
SDS-胶准确地鉴定了糖蛋白。此法鉴定感度达到
微克级 ,可准确鉴定植物材料中表达量微量的糖蛋
白。
糖蛋白不同于蛋白 ,它含有两个部分蛋白和糖
链[ 18, 19, 23] ,茶树叶糖蛋白从 SDS胶上快速纯化法
是通过糖蛋白的蛋白 、糖链两种染色及蛋白质 SDS
胶上回收。其蛋白和糖链对照染色可以从 SDS-胶
准确地分辨出糖蛋白带 ,从而回收 。从 SDS胶上
回收考染的蛋白带巳是成熟的方法 ,有多种试剂盒
可用 ,但从 SDS-胶上回收糖蛋白带没有文献报道 。
我们的结果表明:糖蛋白可以从 SDS -胶成功地纯
化 ,并且回收的茶树叶糖蛋白没有出现异常 ,纯化
的茶树叶糖蛋白可用于其多肽链 、糖链结构及功能
的分析。另外 ,我们从茶树叶分离出总的天然活性
的糖蛋白 ,这对研究茶叶及其糖蛋白对人体的保健
功能具有重要意义。
总之 ,以茶树叶为研究材料 ,我们建立了糖蛋
白高感度准确鉴定及胶上快速分离法。它是制备
植物糖蛋白的简便 、快速 、有效的方法 ,一方面能够
快速分离 、纯化出多种茶树叶糖蛋白 ,便于研究茶
树叶糖蛋白的免疫 、药理等方面的功效。另一方面
SDS胶上快速纯化糖蛋白法能够纯化植物体内表
达量极少的糖蛋白 ,并且回收的糖蛋白纯度高 ,可
直接进行糖蛋白肽链氨基酸序列的测定 ,使研究高
等植物体的糖蛋白及其相关基因较为方便;另外 ,
还可以用于糖蛋白结构鉴定 、糖链功能的解析 。
致谢　感谢中国海洋大学生命科学部汪东风教授提供
部分实验材料和对论文给予了宝贵指导。
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