全 文 ：第 23 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　1 月
Vol.23　No.1　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2003
蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进
朱 宏 王柏臣 张 帅 王同昌
(哈尔滨师范大学 , 哈尔滨 150080)
摘　要　讨论了蛋白质双向电泳检测的各种方法 。并对本实验室使用过的两种银染方法(非双胺
银染及双胺银染)进行对比研究。发现本实验室改进的双胺银染色方法具有以下特点:(1)背景异
常清晰 ,蛋白质与底色反差大;(2)敏感度大大提高 ,检测最低蛋白质量可达 fg 级 ,对微量表达的
蛋白质具有极好分离效果 ,能清晰地检测出低丰度表达的蛋白质 。
关键词　蛋白质;双向电泳;双胺银染
THE IMPROVEMENTON DIAMINE SILVER STAIN METHODS
OF PROTEINS TWO-DIMENSIONAL ELECTROPHORESIS
ZHU Hong WANG Bai-Chen ZHANG Shuai WANG Tong-Chang
(Harbin Normal Univ ersity , Harbin　150080)
Abstract　Some detective methods of proteins through two-dimensional electrophoresis are discussed
in this paper.We compare tw o silver stain methods(diamine and non-dianime silver stain)used in
our lab before.And the diamine silver stain method improved by us has the following st rengthens:
(1)the background is clearer;(2)sensitivity is st ronger largely , and the minimal quantity detected is
up to 10fg , which can separate the proteins expressed very lit tle and detect clearly the proteins that
o ther methods cannot detect.
Key words　protein;tw o-dimensional elect rophoresis;diamine silver stain.
前 言
蛋白质双向电泳技术是指将样品进行电泳后 ,
针对不同的研究目的 ,在它的直角方向再进行一次
电泳。目前双向电泳主要是将等电聚焦电泳与
SDS-聚丙烯酰胺电泳结合 ,利用蛋白质的等电点
和分子量的两种特性进行特异性蛋白质的分离。
最早提出聚丙烯酰胺凝胶双向电泳的是 O
Farrell(1975)[ 5] 。近三十年来 ,这项技术已得到了
充分的应用和发展 ,目前它已经和质谱结合成为蛋
白质研究的主要方法。双向电泳技术是目前所应
用的电泳技术中分辨率最高 ,信息量最大的技术 。
而且 ,双向电泳因不同的检测方法得到的分辨率也
不同 。蛋白质双向电泳中 SDS凝胶检测常采用的
染色方法有[ 1 , 2] :考马斯亮蓝 、硝酸银染色 、荧光染
色法 、免疫染色法以及蛋白质印迹法。
(1)考马斯亮蓝染色 在蛋白质染色中 ,考马
斯亮蓝染色最为简单。1965年 Meyer等首次应用
这种方法 ,检测灵敏度为 0.2 ～ 0.5(g)。
(2)银染技术　1979 年 , Sw itzer 和 Merril 等
本文得到蔡火石基金资助。
第一作者简介:朱宏(1968-),女 ,讲师 ,东北农业大学在读博士 ,主要从事小麦蛋白质双向电泳方面工作。
收稿日期:2002-10-22
首次在《Anal.Biochem.》上介绍了银染色的方法 ,
它的检测灵敏度是考马斯亮蓝的 100 倍。银染的
机制是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银 。
目前较为流行的染色方法有两种:化学显色和光显
色。化学显色又可以分为双胺染色和非双胺染色 。
双胺染色是利用氨水同硝酸银进行反应产生银-
双胺络合物 ,将固定后的凝胶浸泡其中 ,再通过酸
化使其显色;非双胺染色是将固定好的凝胶浸泡于
酸性的硝酸银中 ,在硝酸银和蛋白质发生作用后 ,
在碱性条件下 ,用甲醛还原使其显色。在本研究中
对比了这两种方法的实际效果后 ,采用了双胺染色
法 ,并对其进行了重大的改进 。光显色是使用光能
还原银离子成金属银。因为光能够在酸性 pH 还
原银 ,所以一旦凝胶被固定 ,光显色能使用单一染
色溶液 ,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶
液。
(3)荧光探针法　荧光探针实际上也是一种
蛋白染色 ,其特点是要求染料本身或反应产物必须
发荧光 。荧光探针法可以分为电泳前预标记和电
泳后再标记 。蛋白被荧光探针标记后可以在紫外
光下观察到荧光带。
(4)免疫方法 只要具有单特异性抗体 ,使用
免疫方法检测是比较简单而又具有专一性的方法 。
将电泳后的凝胶用含有专一性抗体的溶液浸湿 ,保
温 ,再用 IgG 偶联到辣根过氧化物酶上。进一步
在 3 , 3 -二氨联苯胺和过氧化氢中保温 ,抗原-
抗体-过氧化氢酶复合物就像染色的蛋白带一样
清晰 。
(5)蛋白质印迹(Protein blot ting)　即应用转
膜技术和免疫技术对蛋白质进行染色。最常用的
方法是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶电泳上转移到
硝酸纤维素膜上 。这个方法实质上是 Southern
DNA印记法的发展。
1 材料
2001年春季采小麦的幼穗 ,于-20℃冰箱中
保存 。
2 方法
2.1 对采集的幼穗进行可溶性总蛋白质的提取 。
方法参照[ 6] 。
2.2　对幼穗可溶性总蛋白质进行双向电泳。方法
参照[ 7] 。
2.3 蛋白质固定和染色的方法之一 ,非双胺硝酸
银银染参照〔2〕的方法
电泳结束后 ,剥下胶 ,浸入固定液中固定过夜
后 ,进行银染 。
(1)固定(至少 30min):固定液为 150mL 乙
醇 、30 mL 冰醋酸 、120 mL 蒸馏水 。
(2)浸泡(30min):浸泡液为 75 mL 乙醇 、17g
醋酸钠 、1.25 mL25%戊二醛 、0.5g 硫代硫酸钠(用
蒸馏水溶解至 250 mL)。
(3)漂洗:用蒸馏水洗三次 ,5min/次 。
(4)银染(20min):染液为 0.25g 硝酸银 ,50μL
甲醛 ,用蒸馏水溶解至 250 mL。
(5)显色(10min以上):显色液 6.25g 碳酸钠 ,
25μL 甲醛 ,用蒸馏水溶解后加至 250 mL。
(6)终止(10min):终止液 3.65g 乙二胺四乙酸
二纳 ,溶于 250mL 蒸馏水。
(7)漂洗:用蒸馏水洗三次 ,5分钟/次 。
(8)保存:25 mL 甘油用蒸馏水加至 250 mL ,
浸泡 30min后取出。
2.4 蛋白质固定与染色方法之二 ,采用本实验室
改进的双胺硝酸银银染 ,方法如下:
(1)固定:固定液为 150mL 乙醇 、30 mL 冰醋
酸 、120 mL 蒸馏水 。
(2)再固定:用去离子水漂洗后(时间短暂),用
10%戊二醛固定 30 min。
(3)漂洗:用去离子水漂洗三次每次 10 min ,
再用去离子水漂洗 3次每次 30 min 。
(4)银染:将凝胶置于新配制的 150 mL 的银
染液(1.4 mL 氨水 、31.5 mL 0.36%氢氧化纳 、6
mL 19.4%的硝酸银)中 ,银染 12 ～ 15 min。
(5)漂洗:用去离子水漂洗三次每次 5min。
(6)显色:用 0.005 %的三氯乙酸或柠檬酸和
0.019%的甲醛溶液显色 3 ～ 10min。
(7)终止:用 4 %的冰醋酸终止染色 。
采用扫描仪(UMAX 4400)直接对凝胶进行照
相和扫描 。然后用干胶仪进行干胶。
3 结果与讨论
聚丙烯酰胺凝胶银染技术源于摄影银染技术 ,
在摄影技术中就发现用双胺染色的灵敏程度要远
远好于非双胺银染方法。但由于其机制尚不清楚
加上它过于敏感 ,操作上要求极为严格 ,因而长期
以来并未得到广泛应用。本研究经过多次反复实
验后 ,对前人实验方法进行了尝试性的改进 ,取得
了较好的效果 。
951 期　　　　　　　　　　　　　　　　　朱　宏等:蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进
通过两种染色后电泳图谱可知含有 Na2S2O3
非双胺染液染色后胶表面背景深 ,呈褐黄色 ,影响
蛋白点检测 ,特别影响低表达蛋白点检测。不含
Na2S2O3双胺染液染色胶表面无任何背景 ,蛋白质
点异常清晰。本方法经多次重复 ,效果均良好见图
版 I 。
3.1 固定
在本研究中发现以往用的戊二醛或聚乙二醇
直接固定凝胶的双胺染色法存在着一些弊病:戊二
醛很容易同凝胶表面附着的杂质反应而结合到胶
上 ,从而影响银染的效果;聚乙二醇则在瞬间使凝
胶收缩 ,这样经显色的蛋白带常常发生扭曲。本研
究采用乙醇和醋酸固定 ,固定时间可因凝胶的厚度
不同而改变 ,一般过夜为宜。然后再采用戊二醛固
定。同时发现戊二醛绝不仅仅起固定作用 ,它在银
染过程中有一种未知的机制使银染的敏感性更强 。
3.2 本银染方法原理的揭示及硫对凝胶银染的
背景的影响
　　研究中发现:用接触过橡胶管的蒸馏水制备凝
胶 ,在银染后发现它的背景远逊于用没有接触过橡
胶管的蒸馏水制备的凝胶;凡是用硫代硫酸钠处理
过的凝胶的背景都不如没用硫代硫酸钠处理的凝
胶。经外籍教授 Jems Brush 先生帮助分析原因如
下:
当把胶放入银染液时一些自由的 Ag+凝结到
胶的蛋白上 ,这样它变得极为敏感 ,与蛋白质结合
的Ag 离子可能比染液中的 Ag+更快的被还原成
金属 Ag ,染液中的自由的 Ag+由于 NH3的存在而
形成了 Ag(NH3)2得以缓慢的保存;如果染液中没
有 NH3的存在的话 ,无论何处的 Ag+都可以被甲
醛还原 ,胶及染液都将变黑 ,无法分辨。Na2S2O3像
NH3一样与染液中的 Ag+形成化合物以防止被还
原。但是 S2O32-会增加胶上没有蛋白质的地方的
背景颜色 ,因为 S2O32-在氧化形式下包含 S ,虽然
它本身不会和胶上的 Ag+形成沉淀 ,但在产物中
混进微量的 Na2S ,它可以与 Ag+结合形成 Ag2S 。
尽管它是不溶解的沉淀 ,但在非常低的浓度下可以
溶解并且在溶液中看不到 ,就可能造成胶染色背景
的增加。
3.3 氨水的浓度对银染敏感度的影响
双胺银染的机制是利用氨水和银结合成络合
物 ,此络合物无法同甲醛进行反应而被还原。在银
染中同甲醛反应的是自由的银离子 ,如果氨水过量
则会大大的降低反应的敏感度 。为此本研究中曾
设计了一个用四倍过量的氨水进行银染 ,结果不显
色 ,从而给予了强有力的实验证明 ,并经过反复实
验摸索出最佳氨水浓度 。
3.4 本染色方法与质谱衔接的应对策略
近年来蛋白质双向电泳技术与质谱(mass
spect rometry)技术的结合而构成的 T -DE -MS
(双向电泳质谱技术),已经成为蛋白质组学研究中
最先进的技术[ 8] 。但是 ,这两项技术的衔接技巧
直接影响最终的结果 ,在双向电泳方面以下两个因
素影响着质谱测序的结果:(1)凝胶内的蛋白质的
修饰(2)染色对质谱的影响[ 9] 。前者主要表现在
在固定过程中 ,戊二醛的直接使用将会直接修饰部
分蛋白质 。因此在本研究中使用了双重固定的策
略 ,这样戊二醛只能修饰凝胶表面的蛋白质而不能
损伤其内部的蛋白质;考马斯亮蓝染色方法对质谱
几乎没有任何影响[ 9] ,但是其灵敏度要比普通银
染低 100倍 ,与双胺银染法比较就更低了 ,对于微
量表达的蛋白质根本无法检测 。随着图像分析系
统的发展出现了适合于分析双向电泳的荧光扫描
仪 ,使荧光染色技术将更多应用于蛋白质双向电泳
研究上 ,但荧光扫描仪应用受限目前仍以银染法为
主。虽然银染法中的银离子对质谱的峰值有一定
影响 ,进而影响氨基酸序列的测定 ,但是好在银离
子只附着在凝胶的表面 ,所以对此采取了适当增加
凝胶厚度 、染色固定后弱酸漂洗等策略应对 。
3.5 技术改进后的特点及意义
通过以上技术改进银染显色后的凝胶具有以
下的特点:A.背景异常清晰 ,蛋白质与底色的反差
特别大;B.敏感度大大地提高 ,能够很清晰地检验
出其他方法所不能检测到的蛋白质;C .最大限度
地杜绝了假阳性 ,这种改进方法的使用极大地提高
了银染的敏感度 ,检测最低量可达 fg 级 ,对微量表
达的蛋白质具有极好的分离效果 。在发育过程中 ,
很多调控基因的表达量很小 ,用一般的方法很难在
蛋白质水平上有所发现。因而蛋白质的研究只能
从 DNA 和 RNA 水平上推导 。在后基因组学的研
究中蛋白质研究显然已经占有了主要地位 ,对功能
基因所表达的蛋白质的分离已经成为研究蛋白质
的必然手段 ,因此这种改进的银染方法对于分子生
物学和发育生物学中微量表达蛋白质检测具有积
极的意义 。
参 考 文 献
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图 版 说 明
Explanation of plates
图版Ⅰ
1.改进的双胺银染方法染色的小麦穗双向电泳图
2.非双胺银染方法染色的小麦穗双向电泳图
PlateⅠ
1.two-dimensional electrophoresis o f whea t spike stained by
improved diamine silver stain method
2.two-dimensional electrophoresis o f whea t spike stained by
non-diamine silver stain method
971 期　　　　　　　　　　　　　　　　　朱　宏等:蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进