全 文 ：B U L L E T I N O F B O T A N IC A L R E S E A R C H
笋1 4
V O I
.
卷 第 1期
1 4 N O
.
l
1 9 9 4年
J a n .,
1月
1 9 94
杨树花药培养筛选耐盐变异体的研究
詹亚光 刘玉喜 陆志华 齐立志
S T U D Y O N S E L E C T I O N O F S A L IN E T O L E R A N T
V A R I A N T S F R O M P O P L A R A N T H E R C A L L U S L IN E S
Z h a n Y a n 一 g u a n L i u Y u 一 x i L u Z h i一 h u a Q i L i一 z h i
〔摘 要 〕 以 杨 树花 药为 外植 体诱导 单倍体愈 伤 组 织 , 进行时氛化钠
(万 d cl ) 和碱性盐 (模仿 天然盐碱土 成份 配成 的 几种盐 的 泥合物 ) 变异体的 筛
选 。 结果表 明 , 不 同的杨树 品种时这两种选择剂 的衬性是不 同 的 , 分化态愈伤组
织比脱分化态愈伤组 织显示 出 更强 的杭性 , 不 同的花药愈伤 组织 无性 系间在抗盆
能力上也存在 差异 。 时再生 植株的叶 子和愈伤组 织进行过载化物同工璐分析 , 发
现时盆 变异体与对照 的岭讲是有差异的 , 前者比后 者在相 同带 区常常多出一 条讲
带 。
关键词 杨树 , 花药培养 ; 耐益 变异体 ; 植株再生 。
土壤盐渍化是限制林木生存的重要环境 因素 , 据报导 , 土壤溶液 中 N a CI 浓度超过
.0 3%时 , 各种杨树均不能忍受 。 为了培育耐盐新品种 , 利用组培能产生遗传性变异的特
点 , 不少学者进行 了耐变异体筛选方面的研究 。 李驹等 ( 19 84) 〔’ 〕 , 李玲等 ( 19 9 0) 〔2〕
均从营器官组培获得了耐盐小植株 , 为木本植物组培筛选耐盐变异体作了可行性尝试 。 为
了扩展类似的研究 , 我们选择了单倍体途径扩大变异 , 并根据我国盐渍化土壤多呈多种盐
混合的特点 , 利用杨树花药培养进行耐碱性盐和 N a CI 变异体的筛选 , 获得了耐不同浓度
选择剂的变异体系列 。 经过过氧化物 同工酶检验 , 证明所获变异体多数的谱带发生了变
异 。
材料和方法
以黑龙江省具有抗盐特性的杂种杨一小黑杨 (尸op ul us s im on i.t 尸 . n ig ar ) 和天然杂交
种 (小叶杨 x 德杂+ 胡杨 , 文 中以 B s 表示之 ) 一的花药为外植体 , 在小抱子单核靠边期
本文作者单位 : 黑龙江 , 哈尔滨 , 东北林业大学 ( o e p a r mt e n t o f F o er s t r y , N o r th e e s t e r n F o cr s t r y U n i v e r si ty ,
H a rb in 15 0 0 4 0 H e i lo n幻ia n g ) 。
· 国家自然科学荃金资助项目。
1 99 3年 9 月收到本文 。
1期 詹亚光等 : 杨树花药培养筛选耐盐变异体的研究
时接种 。 当在 32一 25℃下暗培养二十天以后 , 花药开裂 , 花粉形成愈伤组织 。 分别按各个
花药为单位繁殖成一系列花药愈伤组织无性系 , 以供筛选 。 所用基本培养基为 M S , 诱导
单倍体愈伤组织时 , 附加 2 . 4一 n ( Zm g / L ) , K T ( l m g / L ) 和蔗糖 ( 3 0 9 ) , 分化不定芽
时 , 进行光培养 , 光强度 一500 lu x , 培养基附加 B A ( 1m g / L ) 和蔗糖 ( 3 0 9 / L ) ; 生根
时 , M s 大 量 元 素 减半 , 附 加 N A A ( 0 . s m g / L ) , I A A ( 0 . Zm g / L ) 和 蔗 糖
(2 g0 / )L
, 琼脂均为 0 . 7一 0 . 8% , P H S . 8一 .6 0。 试验选用 N a cl 和碱性盐 两种选择剂 , 碱
性盐 是模仿 天 然 盐 碱 土 成分 配 制 成 约 几 种 盐 的 混 合物 , 其 配 比 是 : 6N a ZC O :3
6N
a H C O 3
:
IN ac l
:
2N a 2 s 0
4。 在培养基中加人各种浓度的选择剂 即成相应的选择培养
基 。 碱性 盐选择培养基在配制时 , 先配成 一定浓度 ( 10 % ) 的选择剂并进行抽滤 消毒 ,
然后在无菌条件下按比例加人经高温高压消毒过尚未凝固的培养基 中混合 , 配后不需再调
p H 值 (大致在 9一 1 0) , 分别装入培养瓶 。 愈伤组织在含盐培养基中培养三十天以上统计
变异率 (按所接愈伤组织块中生长者占总 数的百分比 ) 。 用垂直板式聚丙烯酞胺凝胶 电
泳 , 检验耐盐变异体的过氧化物同工酶的变异情况 。
结 果 分 析
1
.愈伤组织不同生长阶段对选择剂的反应
1
.
1 脱分化状态下愈伤组织的筛选 花药单倍体愈伤组织继代四次后 , 将 Ic m , 大小
的新鲜愈伤组织转入含不同浓度 N a cl 的选择脱分化培养基中进行筛选 。 在 1%浓度培养
基上 , 培养的第一周 , 愈伤组织生长正常 , 仍新鲜 , 呈黄绿色 ; 一周以后 , 多数愈伤组织
由绿变灰 , 二周时 , 变灰色的愈伤组织停止生长 , 趋向死亡 ; 培养一个月后 , 已变灰褐色
的没有生长的愈伤组织完全死亡 , 而那些生长的 , 不断产生新鲜的黄绿或深绿色愈伤组
织 , 呈扇形向四周扩增 , 其体积能达到筛选前的二倍左右 。 愈伤组织在 N a CI 选择压力下
的生长随 N a CI 浓度的增高 , 死亡速度加快 , 生长速度减慢或受到抑制 。
1
.
2 分化状态下愈伤组织的筛选 将继代四次以上 (每次 15 天 ) 的脱分化愈伤组织
转入分化培养基中 , 继代 l 一 2 ·次 (每次 15一 30 天 ) 后 , 愈伤组织开始分化出不定芽 。 将
此时的 愈伤组织块 ( I c m 3 大小 ) 转人含不同浓度选择剂的分化培养基中进行筛选 , 观察
接入 愈伤组织块的变化情况 。
在 2% N a cl 选择分化培养基 中 , 愈伤组织变化趋势与脱分化态时 相同 , 所不 同的是
分化态愈伤组织表现出的变褐 、 死亡和生长都很慢 。 前二周愈伤组织及丛芽无明显变化 ,
第三周以后变化明显 , 大部分愈伤组织出现褐化 , 表面干燥 , 芽黄化等现象 。 大量出现死
亡的时间是选择培养二十天以后 。 一个月时幸存的少部分愈伤组织块上有的出现新芽 。 芽
深绿 , 比正常芽小且长的极慢 、 不仲长 。 这种情况在 l % N a cl 选择分化培养基中培养 10
个月的丛芽上表现得更加明显 。 这些芽是在 愈伤组织块转入 1% N a CI 选择分化培养基以
后陆续分化出来的 。 但至今 , 在此培养基中已继代 10 一 12 次 (每次约 3 0 夭 ) , 丛芽仍未
能伸长 , 只是叶片展开 , 不定芽密麻麻布满整个愈伤组织表面 , 但叶子只有正常芽叶子的
l / 5一 l / 10 大小 。 迄今生长状态依然很好 , 叶深绿 、 新鲜 。
在 .0 5% 碱性盐分化培养基 中 , 接人的愈伤组织块在一周内就逐渐变褐 , 芽变 白 , 继
而死亡 。 存活的愈伤组织及芽仍为绿色 , 但也无明显生长迹象 。 在碱性盐选择压力下比单
纯 N a C I的危害大得多 。 似乎 p H 值 ( 9一 10) 的影响比盐本身的毒害作用更大 。
10 0 植 物 研 究 41 卷
2
.不同树种对选择剂的抗性差异
分化态愈伤组织在含 0 . 5% 、 0 . 75 %碱性盐的分化培养基中经 30一 4 0 天的筛选 , 将丛
苗新鲜 、 愈伤组织仍绿的愈伤组织块归为耐碱性盐变异体 , 而丛苗变白 , 愈伤组织白化或
褐化的都认为是死亡的 , 统计结果见表 l 。
表 1 愈伤组织生长阶段选择剂种类及浓度对耐盐变异率的影响
愈伤组织 N a C I浓度 (% ) 碱性盐浓度 (% )
生长阶段
0
.
7 1
.
0 1
.
2 1
.
5 1
.
8 2
.
0 2
.
2 2
,
5 3
,
0 0
.
5 0
.
7 5
脱分化阶段 8 5 . 0 4 5 . 0
小黑杨 4 5 . 0 2 0 . 0 14 . 3 6 . 5 0
B S
分化阶段 4 1. 2 2 2 . 4 15 . 1 10 . 0 5 . 3 0 4 5 . 5 3 0 . 4
小黑杨 13 . 2 4 . 1 2 . 4 1. 5 0 . 8 0 3 9 . 1 4 . 5
B S
注 : 表内数字为变异率即附盐变异体的比率 , 用百分数表示 。
从表 l 可以看出 , 小黑杨与 B s (小 x 德+ 胡杨 ) 二个树种在抗 N a cl 和碱性盐能力上
均存在显著差异 。 小黑杨的变异率均高于 sB , 尤其在 .0 75 %碱性盐浓度上更为明显 , 前
者的变异率为 30 .4 % , 而后者仅为 .4 5% , 从筛选过程中的生长状态上看 , 小黑杨也好于
B s
, 表现为长势好 , 叶子鲜绿 , 愈伤组织新鲜 。
这里 , 0 , 75 % 碱性盐浓度对于小黑杨和 Bs 来说都基本达到 了耐盐的极限 , 用 1% 筛
选则无一存活 。 这个结果在第二年的重复试验 中再一次得到证实 。 二树种抗 N a CI 的极限
都没超过 3% 。
3
.愈伤组织不 同生长阶段选择对耐盐变异率的影响 。
本试验 中对脱分化态和分化 态二种愈伤组织进行了 N a CI 不 同浓度的筛选 。 结果表
明 , 在分化态选择好于脱分化态 , 这个结果与李驹 〔 `〕 等报道的结果是一致的 : 害印 去
( l) 分化态选择的变异率在相 同选择剂浓 度上要高于脱分化态 , ( 2) 分化态的耐盐极限
(2
.
75 一 3
.
0% ) 高于脱分化态 (l . 5一 1 . 8% ) , ( 3) 对于脱分化态选出的耐盐细胞系来说还需
要再分化 , 以便成苗 , 在这过程 中还会遇到耐盐细胞系分化率低等困难 , 而分化态选出的
变异体可直接分化出苗 , 不仅解决了分化难的问题还简化了步骤 。
从表 l 可见 , 在脱分化态 , 以 B s 为例 , 愈伤组织能忍受 N a cl 的浓度最高为 1 . 5% ,
1
.
8%时则全部死亡 , 而此时在分化态 , 变异 率为 4 . 1% , 其忍耐的最高浓度可达 2 . 5% 。
4
.不同花药愈伤组织无性系对 N a CI 的抗性差异
以小黑杨每个花药开裂产生的单倍体愈伤组织算作一个花药愈伤组织无性系 , 经扩大
繁殖后 , 在分化态进行 10 个无性系的筛选 , N a cl 浓度为 1 . 8% , 结果见表 2。
表 2 不同花药愈伤组织无性系的抗性差异
无性系号 l 2 3 4 5 6 7 8 9 l 0
变异率 (% ) 0 41) . 0 3 5 . 7 15 . 4 2 7 . 3 3 3 . 3 0 3 3 . 3 l 0 22 . 2
1期 詹亚光等 : 杨树花药培养筛选耐盐变异体的研究 10 1
在 01 个愈伤组织无性系中 , 耐 N a cl 变异率存在较大的差异 , 变异率变化在 0一 40 之
间。 主要集中在 30 一 4 0%之 间 。 这样 , 为 了提高选择效率 , 可对 愈伤组织进行 2一 3 次选
择 , 筛除耐性极低的愈伤组织无性系 , 进而保证所选变异体的可靠性 。
5
.耐盐变异体的生根和移栽
为了使变异体分化成 苗 , 在选择后将其转入 无盐培养基中促进快速生长 , 增殖 、 生
根 , 同时保留部分变异体在含盐培养基中继续培养 。 在含盐与无盐生根培养基中无根苗的
生根情况见表 3。
从表 3可以看出 , 经一个月的生根培养 , 在无盐培养基 中变异体的生根率与对照相比
无明显区别 , 均在 90%以上 。 但在根的质里上有所不 同 , 变异体的根数最少 , 不发达 ,
因此移栽成活率仅为 2 . 1% l( / 4 8) 。 而在含盐培养基上均未分化出根 , 变异体无根苗表
现生长慢 , 但状态好 , 而对照则很快出现枯死现象。 从这可以看出 , 在含盐培养基中 , 根
的分化也受到抑制 , 这与前面芽的分化受到抑制是一致的 , 因而表现变异体分化速度慢 ,
但从生长状态看 , 仍有可能分化出根。
裹 3 耐盐变异体再生无根苗的生根率 (B s)
培养基 对照 变异体
接种无 生根 生根率 接种无 生根 生根率
根苗数 株数 (% ) 根苗数 株放 (% )
无盐生根培养基 l 8 ! 7 94 . 4 l 3 l 2 92 . 3
含 .0 6% N a C I的生根培养签 17 0 0 l 5 0 0
.6 耐盐变异体的过氧化物同工酶检验
将小黑杨分化态愈伤组织筛选得到的变异体分化成苗后 , 再从变异体植株再度诱导愈
伤组织。 分别取变异体植株的叶片和愈伤组织进行电泳 , 检验过氧化物同工酶酶谱 , 并以
未经选杯荆筛选过的愈伤组织及再生植株叶片的过氧化物同工酶酶谱作对照 。 结果见表
`
从语带类型上看 , 无论取材于变异体的脱分化愈伤组织还是取材于变异体的再生植株
的叶片 , 其酶讲与对照相比均存在明显差异 。 变异体的谱带类型大大多于对照 。 如取材于
耐 N a C I变异体再生植株叶子的过氧化物同工酶酶谱来看 , 变异体的谱带类型为 6 种 , 对
照为 l 种 , 在所测变异体中 , 除 36 %与对照相同外 , 其余均为变异型 , 表现为或者在 B
区少 一条带 (占 16 % ) 或者在 C 区多一条带 (占 40 % ) 。 取材于脱分化愈伤组织的检验
结果也与此相似 。
从上述结果可以看出 , 变异体的过氧化物同工酶酶谱与对照相比既有广泛的变异 , 又
有相同之处 , 这说明耐盐本身是个复杂的机制 , 而树木具有各种不同的耐盐方式 , 是个综
合的特性。 我们所选的耐盐变异体 中 , 既包含深度的生理适应 , 也可能包含某个或某些基
因的变异 , 两者结合在一起 , 使耐盐性有明显地提高 。 这一点与周荣仁等 ( 1 9 86) 〔 3〕在
烟草上的研究结果一致 。
102 植 物 研 究 1 4卷
表 4耐盐变异体的过叙化物 同工醉谱带类型及比率
树 材料 对照的 变异体谱带类型
种 来源 谱带类型N 压 CI 碱性盐
小 愈 C二二 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .黑 伤B: : 二二 . . . . . . .曰 . . . . .
杨 组 A一 -日 . . . . .` . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .织 目 . . . . .口 . . . . . .日 .月 . . . . .口 . . . . . . .口口 . . . . . . .曰 .口 . . .口 . . . . . . .
` . . . . . . . . . . . . . . . . . . .曰 . . . . .月 . . .曰 .口 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
` . . . .口 . .曰 . . . . . . . .口 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .口口 . . . . . . . . . . .
口 . . . . . . . . . . . . . . . . j. . . . . . . . . . . . . ., . . . . . 口. . . . . ` . . . .
门 . . . . . 曰 . . . . . . 月口.日口.巨 目. . . . . . .
样本数 3 4 艺7 1 12 1 2 4 1 1 2 艺2 4
% 4 3
.
0 57
.
0 4
.
2 50
.
0 4
.
2 8
.
4 16
.
6 4
.
2 4
.
2 8
.
4
B吕 叶 C 一 ! : 二 二二 _ _ 二二 }一 一子 B 一 { 一 一
A
-
样本数 6 艺6 9 3 1 1 1 10 艺2 5 2 I X 3
% 100
.
0 36
.
0 12
.
0 4 0 4
.
0 4
.
0 40
.
0 66
.
6 33
.
3
结 论
1
.本试验通过脱分化和分化两种状态的愈伤组织进行筛选 , 得到了耐河神珠盐浓脚的选
择剂的变异体 , 经过氧化物同工酶检验证明多数变异体的同工酶谱带发生了变异 , 表明其
遗传基础发生了改变 。 这说明在离体条件下 , 存在广泛的变异 , 在一定选择压力下能筛选
出耐盐变异体 。 但这种变异体的抗盐性能否长期稳定能否在无性后代 中继续保持等问题 ,
我们还将做进一步的试验来阐明 。
2
.在愈伤组织分化态进行筛选 , 其变异率高于脱分化态 , 但需要较长的筛选时间来区
别开真正的耐盐变异体和濒死的愈伤组织 。 经多年的试验 , 我们总结出 , 相应的理想筛选
时间为二个月左右 。
3
.对小黑杨和 sB 来说 , 耐碱性盐的极限为 .0 75 % , 而耐 N a CI 的极限不超过 3% 。
.4 在含 N a a 的生根培养基 中 , 耐盐变异体的无根苗的生根是困难的 。 且变异体再生
植株的移栽成活率很低 。
l期 詹亚光等 :杨树花药培养筛选耐盐变异体的研究 1 0 3
A B SAT R C T
Se e le ti o no f va ri a n t s to ] e a r n t to N
a CI a n da l ka i l ne sa l tw a sm a de fro m Po P la a r n the r
a c l lu si n vi t ro e u l tu e r
.
T he re su l t s s ho w e d t ha t di e fe r n t Po P la r s Pe ei e a s PPe a e r d di e f
e r n t
o t le a e er n to t he w to s
e e re ni ng a g e n t s
.
T he e a i i ll n di e f
re n ti a ti o n sa t te s ho w e d s to r ng e r to - l
e ra ne e t ha n t ha ti n de i de f
e r n ti a ti o n s ta te
.
T he i de f
e r n ti a te de a li lo f Po Pu lu s si m o nii x P
.
ni g a e o ru ld to le ra te 3% Na I C 0
.
7 5 % a lka li e an s lt
.
T he e rg e e a n r te d P la n to s f vai ra n t s ha d
t ra n sP la n te d to t he 5 011
.
I e no m Pa ri ng t he m a Po s f p la n t le ta e s le a r di e fe r
ne e w a so fu n d be
·
w te e
n sa l te to l
e a r n ta vi ra n ta s n de o n to r l s
.
Key w o r d s Po p la r :A n t he r Cu l tu e r : Sa l te t
o le ra n t vai ra n t
参 考 文 献
l[〕 李驹 , 陈维王月, 1 9 84 : 杨树附盐细胞系筛选及其不定苗再生的研究 , 林业科技通讯 ( 1) : 卜 o3
〔2〕 李玲 , 韩一凡 , 1 9 9 0: 杨树耐盐突变体筛选的研究 , 林业科学 2` ( 4 ) : 3 5 9一 3 62 。
〔3〕 周荣杜 , 杨燮荣 , 余权文 , 1989 : 利用组织培养研究植物耐盐机理与谛选耐盐突变体的进展 , 植物生理学通
讯 , ( 5 ) : 1 1一 19。
〔4〕 A M c hu g he n a n d M . Sw a血 , 19 8 4 : A t is u e e u lt u r e d e ir锐 d as lt一 t o l e r a n t lin e o f fl a x (L in um u is t a U s s im u m ) .
J o u rn
a l o f P la n t P h y is o lo gy
.
1 1 7: 1 0 9一1 1 7 .