全 文 ：植物保护学报 !"#$%&"()&%*)$"*+,*-"%! ./01! 2."2#$110 411E 678$ 0/90:3/.;<=,%>-=?@ABCA=./019/29/00
基金项目$国家现代农业产业技术体系建设专项"TFZ[K.3# !通讯作者"F#*B"$G("$,"$+GH"%I+%,+#! JKL&-$<-&%GB+&HH+N0E:=,"L! @&%M%&11:0N0.E=,"L 收稿日期$ ./02 40. 4/0
一种高效的苹果褪绿叶斑病毒 M$TI$*探针实时
荧光定量 !MHD@!检测方法
秦子禹
0!.O孙建设0!O王O娜.!O邵建柱0
"0=河北农业大学园艺学院! 保定 /50//0 .=河北科技师范学院园艺科技学院! 昌黎 /EEE//#
摘要! 为建立一种检测苹果褪绿叶斑病毒$?,,"%42").)$/4"%&<*,)$B/.#*!FTP[g&的 Y&ha&% 探针实 时荧光定量ZYK)TZ方法!根据FTP[g外壳蛋白基因$,"&*H$"*+-%!4,&保守序列设计了特异性引物 和Y&ha&%探针!以构建的FTP[gK4,重组质粒为阳性标准品绘制标准曲线!并对该方法的特异性 灵敏性重复性进行检验" 结果显示!以FTP[gK4,重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达 /9DDD!扩增效率为 0/:95e#建立的 Y&ha&% 探针实时荧光定量 ZYK)TZ方法特异性好!与苹果茎 沟病毒$?,,"%*$%90.))B/30 B/.#*!F[Rg&苹果茎痘病毒$?,,"%*$%9,/$/30 B/.#*!F[)g&苹果锈果类
病毒$?,,"%*4&.*C/3 B/.)/-!F[[gI&均无交叉反应#灵敏度为 0// 拷贝;"P!比常规 ZYK)TZ高 0// 倍#批内和批间变异系数均小于 /932e" 表明 Y&ha&% 探针实时荧光定量 ZYK)TZ方法具有特异 性强灵敏性高重复性好的优点!适用于实际样品中FTP[g的快速准确检测" 关键词! 苹果褪绿叶斑病毒$FTP[g&# Y&ha&%探针# 实时荧光定量ZYK)TZ
1*"/+&+"*,M$TI$*%"$BH,+-"!MHD@!$##$4 /.%(","&,+*A 3))".-*"&+&0(-".#<$)&05(+1$"1@RNO# d-% _-S#0!.O[#% !-&%GB+0!O]&%Mb&.!O[B&"!-&%?B#0 "0=T"+M+"(X"$*-,#*#$+! FM$-,#*#$&U%-V+$G-*S"(X+A+-! W&"I-%M/50//0! X+A+-)$"V-%,+! TB-%& .=X"$*-,#*#$&T"+M+"([,-+%,+` Y+,B%""MS! X+A+-b"$L&U%-V+$G-*S"([,-+%,+` Y+,B%""MS! TB&%M-/EEE//! X+A+-)$"V-%,+! TB-%&#
12#,%$&,$ Y"+G*&A-GB &Y&ha&% $+&K*-L+ZYK)TZ&GG&S("$I+*+,*-%M?,,"%42").)$/4"%&<*,)$B/.#*
"FTP[g#! &H&-$"(H$-L+$G&%I &Y&ha&% H$"A+@+$+I+G-M%+I A&G+I "% *B+,"%G+$V+I %#,+"*-I+
G+h#+%,+"(FTP[g,"&*H$"*+-% "4,# M+%+! &%I *B+$+,"LA-%&%*H&GL-I "(FTP[gK4,@&G,"%G*$#,*+I &GH"G-*-V+G*&%I&$I *"M+%+$&*+G*&%I&$I ,#$V+=YB+GH+,-(-,-*S! G+%G-*-V-*S&%I$+H$"I#,-A--*S"(*B-G L+*B"I @+$++V&#&*+I=YB+$+G#*GGB"@+I *B&**B+,"$+&*-"% ,"+(-,-+%*"(G*&%I&$I ,#$V+@&G/9DDD
&%I *B+&LH-(-,&*-"% +(-,-+%,S@&G0/:95e=YB+$+@&G%",$"GG-%M$+&,*-"% @-*B ?,,"%*$%90.))B/30
B/.#*"F[Rg#! ?,,"%*$%9,/$/30 B/.#*"F[)g# &%I ?,,"%*4&.*C/3 B/.)/- "F[[gI#! -%I-,&*-%M&G*$"%M GH+,-(-,-*S=YB+G+%G-*-V-*S"(*B-GL+*B"I @&G0// ,"H-+G;"P! @B-,B @&G0// *-L+GB-MB+$*B&% *B+
,"%V+%*-"%&ZYK)TZ=YB+,"+(-,-+%*G"(V&$-&*-"% A+*@++% *B+-%*$&K&%I -%*+$K&GG&S@+$+A"*B @-*B-%
/932e=YB-GL+*B"I ,"#I A+#G+I *"I+*+,*FTP[g$&H-IS-% H$&,*-,&G&LH+G@-*B G*$"%MGH+,-(-,-*S! B-MB G+%G-*-V-*S&%I$+-&A+$+H$"I#,-A--*S=
3"4 5.%(#$?,,"%42").)$/4"%&<*,)$B/.#*"FTP[g# Y&ha&% H$"A+ $+&K*-L+ZYK)TZ OO苹果褪绿叶斑病毒"?,,"%42").)$/4"%&<*,)$B/7 .#*!FTP[g#属线形病毒科纤毛病毒属"T&$G*+%G!
./0/#!寄主范围广!可侵染苹果(梨(桃(李(杏(樱
桃等多种果树!在世界各地均有发生!对果树的生
长(果 品 的 产 量 和 质 量 均 造 成 严 重 的 影 响
"6+GV-,%+G` W"S€!0D33刘福昌和王焕玉!0D3D
T-+G-%G>&+*&=!0DD1#) FTP[g在苹果上的感染率
高达 3/e 0^//e!且症状不明显!多为潜伏态!可
致减产 2/e左右!是危害苹果生产的主要潜隐性病
毒之一"吴雅琴等!0DD3#)
目前检测FTP[g的方法主要有酶联免疫吸附
试验 "+%?SL+K-%>+I -LL#%"G"$A+%*&GG&S!JP8[F# "吴雅琴等!0DD3马书尚等!.///#(分子杂交"牛建 新等!.//1#和常规 ZYK)TZ技术"陈红霞等!./0. 姬盼等!./0:乔雪华等!./0:#) 但 JP8[F的灵敏 度较低!而分子杂交法的前提是要制备探针!较为复 杂!且检测步骤繁琐) 常规 ZYK)TZ技术虽然灵敏 度较高!但需进行)TZ后处理!易发生交叉污染!造 成假阳性现象) 实时荧光定量 ZYK)TZ是近年来发 展起来的一种检测技术!它利用荧光信号实时监测 体外6bF分子)TZ复制过程中每个循环的扩增产 物!实现对 6bF模板进行定量和定性分析!具有敏 感性和特异性高(重复性和稳定性好(耗时短(无污 染的特点) 目前!实时荧光定量 ZYK)TZ技术已被 用于多种植物病毒的检测"\+$-"+*&=!./00赵晓
丽等!./0:胡加谊等!./02#!但国内尚未见利用实
时荧光定量ZYK)TZ检测FTP[g的报道)
鉴于FTP[g对我国苹果产业的严重影响!急需
建立一种更加灵敏准确的检测方法) 为此!本研究
根据FTP[g的4,基因保守序列设计特异性引物和
Y&ha&%探针!通过制备 FTP[gK4,重组质粒建立标
准曲线!并建立FTP[g的 Y&ha&% 探针实时荧光定
量ZYK)TZ检测体系!旨在为进一步研究 FTP[g的
侵染(增殖(时序变化等规律提供有效的技术手段!
并为苹果病毒的多重实时荧光定量 ZYK)TZ检测体
系的研发奠定基础)
6 材料与方法
686 材料
供试材料$感染 FTP[g的田间苹果叶片于 ./0. 年 E 月采自河北省清苑县温仁村!01 份用于验 证检测体系的苹果叶片于 ./0: 年 3 月采自河北省 卢龙县狮子庄村经检测确认分别携带苹果茎沟病 毒"?,,"%*$%90.))B/30 B/.#*!F[Rg#(苹果茎痘病毒
"?,,"%*$%9,/$/30 B/.#*!F[)g#(苹果锈果类病毒
"?,,"%*4&.*C/3 B/.)/-!F[[gI#的苹果组培苗及脱毒
组培苗由河北农业大学生物技术实验室提供)
主要试剂$ZbF-G")#G(ZbF-G"KL&*+("$)&%*
Y-GG#+和JF[c6-#*-"% ("$Z+&Y-L+)TZ购自宝生 物工程"大连#有限公司Y$&%G[*&$*)$"A+h)TZ[#K
H+$a-C(Y$&%G[,$-H*7%+K[*+H M6bFZ+L"V&&%I ,6K bF[S%*B+G-G[#H+$a-C及,U?+TKY: T"%-%Mf-*购自
北京全式金生物技术有限公司6bF凝胶回收试剂
盒和质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程"上
海#股份有限公司)
仪器$W-"KZ&I -dYa1 荧光定量 )TZ仪!美国 W-"KZ&I公司b&%"6$"H ./// 微量紫外分光度计!美
国YB+$L"[,-+%*-(-,公司) 687 方法 68786 引物及探针的设计与合成 根据R+%W&%>中登录的 FTP[g外壳蛋白","&* H$"*+-%!,H#基因的核苷酸序列"登录号 602DDE90#!
利用)$-L+$)$+L-+$19/ 设计扩增 4,基因全序列的
引物 FTP[gK4,K$RFFRFYTRTFRFFRRRRFYFYYT
和 FTP[gK4,KZ$RYTYFTFRRTYFYYYFYYFYFFR!用 于阳性质粒标准品序列的克隆) 利用T#G*&Q0930 对克隆得到的 FTP[g4,基因序列及 R+%W&%> 中已 发表的 FTP[g4,基因序列 "登录号$602DDE90(
!b323DD0(Xd:D3.1.(bT//02/D(!b32D//5(RU:.3//290#
进行多重比对!选择相对稳定的保守区域作为检测
靶标序列!利用)$-L+$)$+L-+$19/ 和)$-L+$JCH$+GG :9/ 设计特异性扩增引物和 Y&ha&% 探针!引物为 FTP[gK)$"A+K$TFRFRFFFFRFYRFTTTFFKFYTFYR
和 FTP[gK)$"A+KZ$FFTFRTTYRRFYRRTFFTF!探针
1m端标记荧光基团\Fa!:m端标记淬灭基团WXd0!即
FTP[gK)$"A+$\FaKYYRFRFTTYYTFFYRYRTTYRTTFK
YRYKWXd0!所有引物均由宝生物工程"大连#有限公
司合成)
68787 总ZbF的提取及,6bF的合成
称取 /90 M供试苹果样品叶片!利用 ZbF-G"
)#G及 ZbF-G"KL&*+("$)&%*Y-GG#+试剂盒按照说 明书提取总 ZbF!再以 7-M"" IY# 03 为引物利用 Y$&%G[,$-H*7%+K[*+H M6bFZ+L"V&&%I ,6bF[S%K *B+G-G[#H+$a-C试剂盒进行反转录获得,6bF)
68789 重组质粒标准品制备及标准曲线绘制
以田间感染FTP[g苹果叶片的,6bF为模板!
利用引物 FTP[gK4,K\;Z进行 FTP[g的 4,基因的
)TZ扩增) .1 "P扩增体系为$. uJ[ H&Ma&G*+$K
.11 植O物O保O护O学O报 2. 卷
a-C0.91 "P(0/ HL";"P上下游引物各 0 "P(,6bF
模板 0 "P(双蒸水 D91 "P)TZ反应条件为$D2p . L-%D2p :/ G!11p :/ G!5.p 0 L-%!2/ 个循环 5.p 延伸 1 L-%) 扩增产物经 091e琼脂糖凝胶电 泳后!采用6bF凝胶回收试剂盒对符合目标片段大 小"0 532 AH#的特异条带进行切胶回收!纯化后连 接至,U?+TKY: 载体!并转化至U*42%./42/& 4)"/6X1! 感受态细胞!挑取阳性克隆进行增菌培养!用质粒小 量提取试剂盒提取后酶切和测序鉴定) 经鉴定正确 的阳性重组质粒作为标准品!命名为 FTP[gK4,!置 于45/p保存备用) 用b&%"6$"H ./// 测定提取质粒的 76.E/ %L和
76.3/ %L值及其浓度!76.E/ ;76.3/比值在 093 .^9/ 之
间的质粒方可用于制作标准曲线) 再将质粒浓度换
算成拷贝数浓度!拷贝数浓度 v质粒浓度 u0/ 4D u
E9/. u0/.: ;"6bF碱基数 uEE/#用 J&GS6-#*-"%
将质粒按 0/ 倍梯度依次稀释成 09/ u0/5 0^9/ u
0/: 拷贝;"P共 1 个浓度) 以此为模板参照试剂盒
说明书建立 ./ "P实时荧光定量 )TZ扩增体系$Y$&%G[*&$*)$"A+h)TZ[#H+$a-C0/ "P(0/ HL";"P 上下游引物各 /92 "P(0/ HL";"PY&ha&%探针 /92 "P(模板 09/ "P(双蒸水 593 "P) 在荧光定量 )TZ 仪上进行扩增$D2p预变性 :/ GD2p变性 1 G!11p
退火 01 G!5.p延伸 01 G!共 2/ 个循环) 反应结束
后!利用自带分析软件生成标准曲线)
6878; 实时荧光定量 ZYK)TZ检测性试验
提取分别携带 FTP[g(F[Rg(F[)g和 F[[gI
的苹果组培苗的总 ZbF!反转录获得 ,6bF模板进
行实时荧光定量)TZ扩增!检测引物和探针的特异
性) 以 0/ 倍梯度稀释成 09/ u0/3 0^9/ u0/0 拷
贝;"P的 3 个浓度FTP[gK4,质粒为模板!分别进行
FTP[g的实时荧光定量 )TZ和常规 )TZ检测!对
比 . 种方法的灵敏度) 常规 )TZ检测参考陈红霞
等"./0.#方法进行) 常规 )TZ检测体系$. uJ[ H&Ma&G*+$a-C0.91 "P(0/ HL";"P上下游引物各 0
"P(,6bF模板 0 "P(双蒸水 D91 "P反应条件为$D2p . L-%D2p :/ G!11p :/ G!5.p :/ G!2/ 个循 环5.p延伸 1 L-%) 以稀释成终浓度为09/ u0/5(09/ u0/1 和09/ u0/: 拷贝;"P的 FTP[gK4,质粒为模板进行实时荧光定 量)TZ反应) 同一次反应每个稀释度重复 : 孔!连 续 : I 进行 : 次试验!根据获得的 T*值利用 6)[ 59/1 软件计算平均 T*值(标准差"+L#和变异系数 "1S#) 通过同一试验内和不同试验间对同一样品 检测的T*值的变异系数!评估该方法的重复性) 6878< 实际样品检测 分别提取 01 份供试苹果叶片和 0 份苹果脱毒 组培苗叶片的总ZbF并反转录获得,6bF后!利用 建立的实时荧光定量 ZYK)TZ方法进行检测!以明 确该方法是否可用于FTP[g的快速准确检测) 7 结果与分析 786 重组质粒标准品的鉴定及标准曲线的绘制 重组质粒双酶切产物经 091e琼脂糖凝胶电泳 后!得到一条大小约为 0 532 AH的特异性条带!与目 的片段大小相符 "图 0 #) 测序结果在 bTW8经 WPF[Y分析显示!与参考序列"登录号 602DDE90# 的同源性为 DDe!由此确定成功构建了 FTP[gK4, 重组质粒) 将FTP[gK4,重组质粒进行实时荧光定 量 )TZ反应并生成标准曲线!标准品起始模板浓度 与T*值均呈现出良好的线性关系!相关系数 G. 达 /9DDD!扩 增 效 率 为 0/:95e! 直 线 方 程 式 为 (v4:9.2"M"# l2:9:5) 图 6 1@RNOH-)重组质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳图 \-M=0 FM&$"G+M+++,*$"HB"$+G-G"(*B+$+,"LA-%&%* H&GL-I I-M+G*+I @-*B$+G*$-,*-"% +%?SL+ a$ Y$&%G.f)#G6bFL&$>+$0$ FTP[gK4,重组质
粒 .$重组质粒双酶切产物) a$ Y$&%G.f)#G6bF L&$>+$0$ *B+$+,"LA-%&%*H&GL-I "(FTP[gK4,M+%+ .$ *B+I"#A++%?SL&*-,I-M+G*-"% H$"I#,*"(FTP[gK4,= O 787 实时荧光定量 !MHD@!方法的特异性 特异性检测中!只有FTP[g反应管中检测到特 异扩增信号!而 F[Rg(F[)g(F[[gI 反应管中均无 荧光信号积累!表明所建立的实时荧光定量 ZYK :112 期 秦子禹等$ 一种高效的苹果褪绿叶斑病毒Y&ha&%探针实时荧光定量ZYK)TZ检测方法
)TZ方法具有良好的特异性"图 .#)
图 7 实时荧光定量!MHD@!特异性试验结果
\-M=. [H+,-(-,-*S"(*B+Y&ha&% $+&K*-L+ ZYK)TZ("$FTP[g
0$FTP[g .$F[)g :$F[Rg 2$F[[gI 1$IIX.7= O 图 9 实时荧光定量!MHD@!检测1@RNOH-)质粒的灵敏度 \-M=: YB+G+%G-A--*S"(*B+Y&ha&%$+&K*-L+ZYK)TZ("$I+*+,*-%MFTP[gK4,H&GL-IG 0 3^$ 0/ 倍梯度稀释的浓度依次为 0/3 0^/0 拷贝;"P的 FTP[gK4,质粒 D$阴性对照) 0 43$ FTP[gK4,H&GL-IG"(
0/3 40/0 ,"H-+G;"P D$%+M&*-V+,"%*$"=
O
图 ; 常规!MHD@!检测1@RNOH-)质粒的灵敏度
\-M=2 YB+G+%G-A--*S"(,"%V+%*-"%&ZYK)TZ("$I+*+,*-%MFTP[gK4,H&GL-IG a$ 6bFL&$>+$8 0 3^$0/ 倍梯度稀释的浓度依次为 0/3 0^/0 拷贝;"P的 FTP[gK4,质粒 D$ 阴性对照) a$6bF L&$>+$8 0 43$ FTP[gK4,H&GL-IG"(0/3 40/0 ,"H-+G;"P D$%+M&*-V+,"%*$"=O
789 实时荧光定量!MHD@!方法的灵敏度
实时荧光定量 ZYK)TZ能检测到 0/. 拷贝;"P
的FTP[gK4,"图 :#!而常规ZYK)TZ只能检测到 0/2
拷贝;"P的FTP[gK4,"图 2#!表明实时荧光定量ZYK
)TZ检测的灵敏度比常规ZYK)TZ高 0//倍)
78; 实时荧光定量!MHD@!方法的重复性
对不同浓度质粒在同一次试验和不同试验间得
到的T*值进行统计学分析发现!组内重复的变异系
数最大为 /915!表明实时荧光定量 ZYK)TZ方法具
有较好的组内重复性组间重复的最大变异系数为
/932"表 0#!表明该方法具有较好的组间重复性!可
同时或分批对样品进行稳定准确的检测)
78< 实际样品检测结果
利用建立的实时荧光定量 ZYK)TZ方法对 01
份田间苹果叶片和 0 份苹果脱毒组培苗叶片进行
FTP[g检测发现!除 1 号(0/ 号样品及脱毒组培苗
的检测结果为阴性外!其余 0: 份田间样品的检测结
果均为阳性!检出率达 3E95e"表 .#!其中 T*值最
小为 .E923!最大为 :19/1!表明该方法可用于田间
苹果样品中FTP[g的检测)
211 植O物O保O护O学O报 2. 卷
表 6 实时荧光定量!MHD@!检测1@RNOH-)质粒的重复性试验结果
Y&A+0 Z+H$"I#,-A--*S&GG&S"(*B+Y&ha&%$+&K*-L+ZYK)TZ("$FTP[gK4, 浓度 T"%,+%*$&*-"%
"拷贝;#P#
组内重复
8%*$&K&GG&S$+H$"I#,-A--*S 组间重复 8%*+$K&GG&S$+H$"I#,-A--*S
T*平均值x标准差
a+&% x[6
变异系数
Tg"e#
T*平均值x标准差
a+&% x[6
变异系数
Tg"e#
0 u0/5 ./9E/ x/9/D /922 ./9E0 x/90/ /923
0 u0/1 .592: x/902 /910 .592: x/9.: /932
0 u0/: ::9.. x/90D /915 ::92/ x/9.. /9EE
表 7 实时荧光定量!MHD@!方法对田间样品1@RNO的检测结果
Y&A+. 6+*+,*-"% "(FTP[g($"L(-+I G&LH+GASY&ha&%$+&K*-L+ZYK)TZ
样品编号
[&LH+b"=
T*
检测结果
Z+G#*
样品编号
[&LH+b"=
T*
检测结果
Z+G#*
0 .E923 l 0/ /9// 4
. :29:0 l 00 :19/1 l
: :09/. l 0. :/950 l
2 :/9EE l 0: :292D l
1 /9// 4 02 .3950 l
E :/9.D l 01 ::910 l
5 ::9D0 l 脱毒组培苗 /9// 4
3 :29/3 l g-$#GK($++H&%*+*
D .D933 l 对照Tf /9// 4
OOl$阳性4$ 阴性) l$)"G-*-V+4$ %+M&*-V+=
9 讨论
苹果病毒病已成为影响我国苹果产业发展的一
个重要因素!国内各苹果主产区已鉴定明确的苹果
病毒有 05 种!其中以 FTP[g(F[)g(F[Rg和 F[[K
gI分布最广!危害最大!且田间多表现为复合侵染
"王亚南等!./0/#) 因此本研究选择分别携带 F[K
)g(F[Rg和F[[gI的苹果组培苗为阴性对照验证
引物和探针的特异性!结果显示建立的实时荧光定
量ZYK)TZ体系可特异性地检测出 FTP[g!而不与
其它 : 种病毒发生假阳性反应!表现出较高的特
异性)
实时荧光定量 ZYK)TZ技术与常规 ZYK)TZ技
术相比!灵敏度更高!已被广泛应用于植物病毒学研
究中) 本研究中该方法可在 ./ "P反应体系中检测
到 0// 拷贝;"P的FTP[gK4,重组质粒!灵敏度是常
规ZYK)TZ的 0// 倍) \+$-"+*&="./00#应用实 时荧光定量ZYK)TZ对蚕豆萎蔫病毒K0"5.)&- A%&3 @/"$B/.#*0!WW]gK0#和蚕豆萎蔫病毒K."WW]gK.#
进行了检测!其灵敏度为 0// 拷贝;"P赵晓丽等
"./0:#利用实时荧光定量ZYK)TZ检测啤酒花矮化
类病毒"N),*$#3$B/.)/-!X[gI#时发现其灵敏度比
常规ZYK)TZ高 0/ 倍胡加谊等"./02#检测菠萝凋
萎相关病毒K."!/3%&,,"%9%&"(A#0 @/"$&*)4/&$%- B/7
.#*7.!)a]&gK.#时发现实时荧光定量ZYK)TZ比常
规ZYK)TZ的灵敏度高 0// 倍!均与本研究所得结
论一致)
本研究应用FTP[gK4,重组质粒为标准品构建
标准曲线!从而建立起 FTP[g实时荧光定量 ZYK
)TZ检测方法!这在国内尚属首次报道!也是国内
首次关于 FTP[g实时荧光定量 ZYK)TZ检测方法
的报道) 整个 )TZ检测过程只需在 W-"KZ&I -dYa1
荧光定量)TZ仪上进行 0 B 左右!检测结果直接由
电脑软件得出!无需对)TZ扩增产物进行琼脂糖凝
胶电泳检测和分析!简化了检测步骤!提高了检测效
率!同时有效地防止了检测过程中的污染和假阳性)
同以往检测方法相比!该方法具有简便(快速(准确(
特异(灵敏等优点!适用于实际样品中 FTP[g的快
速准确检测!具有较好的应用前景) 该检测体系的
建立为进一步研究 FTP[g在寄主体内的运动复制
规律及研发苹果病毒多重实时荧光定量ZYK)TZ检
测体系奠定了基础)
参 考 文 献 "Z+(+$+%,+G# T&$G*+%GJW=./0/=Z&*-(-,&*-"% V"*+"% *&C"%"L-,H$"H"G&G*"*B+ 8%*+$%&*-"%&T"LL-*++"% Y&C"%"LS"(g-$#G+G".//D#=F$K
,B-V+G"(g-$""MS! 011"0#$ 0:: 402E
1112 期 秦子禹等$一种高效的苹果褪绿叶斑病毒Y&ha&%探针实时荧光定量ZYK)TZ检测方法 TB+% XQ! [B&"!_! [#% ![! T&"Q\! d-&"QX=./0.=d#-,> &GG&S I+*+,*-"% "(&HH+&*+%*V-$#G+GAS*@"KG*+H L#*-H+CZYK)TZ=
!"#$%&"(\$#-*[,-+%,+! .D"2#$ ED1 45/0 "-% TB-%+G+# +陈
红霞! 邵建柱! 孙建设! 曹晓凤! 乔雪华=./0.=两步多重
ZYK)TZ快速检测苹果潜隐性病毒=果树学报! .D
"2#$ED1 45/0, T-+G-%G>&a! a&-%"@G>-Y! _&@&I?>&W!=0DD1=[*#I-+G"% G+V+$K
&G*$&-%G"(?,,"%42").)$/4"%&<*,)$B/.#*"FTP[g# -G"&*+I ($"LI-(+$+%*($#-**$++GH+,-+G=F,*&X"$*-,#*#$&+! :3E$ E: 4
50
6+GV-,%+G!T!W"S€Z=0D33=6-(+$+%*I-G+&G+G,&#G+I AS*B+12")7 .)$/4"%&<*,)$B/.#*"% *B+($#-**$++G=F,*&X"$*-,#*#$&+! .:1$
:0 4:3
\+$-"8! Z#-?KZ#-?[! Z#A-"P=./00=6+*+,*-"% &%I &AG"#*+ h#&%*-*&*-"% "(5.)&- A%&3 @/"$B/.#*0 "WW]gK0# &%I WW]gK.
AS$+&*-L+ZYK)TZ=!"#$%&"(g-$""M-,&a+*B"IG! 055".#$
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E11 植O物O保O护O学O报 2. 卷