全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（２）： ２４１ － ２４７ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００９
基金项目：国家现代农业（甘薯）产业技术体系（ＣＡＲＳ⁃１１⁃Ｂ⁃０８），河北省财政基本科研业务费（４９４⁃０４０１⁃ＪＢＮ⁃６４４０）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｃｈｅｎｓｈｕｌｏｎｇ６５＠ １６３． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１４ － １０ － ０３
河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原鉴定
王容燕　 高　 波　 陈书龙∗　 马　 娟　 李秀花
（河北省农林科学院植物保护研究所， 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心，
农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室， 保定 ０７１０００）
摘要： 为明确河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的症状特点和病原种类，在不同种植区采集储藏期
和育秧期病样，描述其症状特征；对病原菌进行分离纯化，采用柯赫氏法则回接验证，依据病原菌的
形态特征和基因序列确定病原菌种类。 结果表明，在储藏期甘薯发病可导致薯块表面腐烂的占总
病薯的 ５９􀆰 ０９％ ，端部腐烂的占 ４０􀆰 ９１％ ；薯块带有褐色轮纹病斑的占 ６１􀆰 ３６％ ，病斑没有轮纹或者
轮纹不明显的占 ３８􀆰 ６４％ ；发病初期薯块内部病斑浅、黑褐色的占 ２７􀆰 ２７％ ，发病后期薯块内部形成
空腔、布满白色菌丝的占 ７２􀆰 ７３％ ；病斑带有苦味的占 ５９􀆰 ０９％ ，病斑没有苦味或苦味不明显的占
４０􀆰 ９１％ ；在育秧田发病导致薯秧溃疡，表现为主茎基部呈点片发生黑色或者褐色病斑，部分有开
裂。 分离的病原菌能够同时侵染薯块和薯秧；病原菌单瓶梗产孢，大型分生孢子稍弯，两端钝圆，多
数 ３ ～ ７ 个分隔，顶细胞钝圆，基细胞足跟较明显。 其 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ基因序列与茄镰孢
菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ的同源性分别为 ９７％ 、９９％和 ９８％ 。 初步确定甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原
菌为茄镰孢菌 Ｆ． ｓｏｌａｎｉ。
关键词： 甘薯； 镰孢菌腐烂与溃疡病； 茄镰孢菌； 症状
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｃａｕｓｉｎｇ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ
ｃａｎｋｅｒ ｏｎ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
Ｗａｎｇ Ｒｏｎｇｙａｎ　 Ｇａｏ Ｂｏ　 Ｃｈｅｎ Ｓｈｕｌｏｎｇ∗ 　 Ｍａ Ｊｕａｎ　 Ｌｉ Ｘｉｕｈｕａ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ；
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ； Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｈｅｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１０００， Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ
ｃａｎｋｅｒ， ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ｉｎ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ
ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｋｏｃｈ’ｓ ｌａｗ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｏｔ （５９􀆰 ０９ ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ） ｏｒ ｅｎｄ
ｒｏｔ （４０􀆰 ９１％ ） ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｅｓ． Ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ
ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ ｒｉｎｇｓ （６１􀆰 ３６％ ） ｔｈａｔ ｗｅｒｅ ｄａｒｋｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｓｕｒｆａｃｅ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ ｒｉｎｇ
ｗａｓ ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｕｎｃｏｎｓｐｉｃｕｏｕｓ （３８􀆰 ６４％ ）． Ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｒｏｏｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｓｈａｌｌｏｗ ｗｉｔｈ ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ （２７􀆰 ２７％ ）， ｂｕｔ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｅｘｔｅｎｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆｔｅｎ
ｗｉｔｈ ｃａｖｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｗｅｒｅ ｌｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｗｈｉｔｅ ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ ｉｎ ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅ （７２􀆰 ７３％ ）．
Ｔｈｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓｍｅｌｌｅｄ ｂｉｔｔｅｒ （５９􀆰 ０９％ ） ｏｒ ｔｈｅ ｂｉｔｔｅｒ ｓｍｅｌｌ ｗａｓ ｎｏｔ ｃｏｎｓｐｉｃｕｏｕｓ （４０􀆰 ９１％ ）． Ｏｎ
ｔｈｅ ｎｕｒｓｅｒｙ， ｉｔ ｃａｕｓｅｄ ｃａｎｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ｄａｒｋ ｂｒｏｗｎ ｔｏ ｂｌａｃｋ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｕｎｄｅｒｇｒｏｕｎｄ
ｓｔｅｍｓ， ｏｃｃａｓｉｏｎａｌｌｙ ｒｕｐｔｕｒｅｄ． Ａｌｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｉｎｆｅｃｔ ｂｏｔｈ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ． Ｃｏｎｉｄｉｏｇｅｎｏｕｓ ｃｅｌｌｓ
ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ｍｏｎｏｐｈｉａｌｉｄｅｓ． Ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ ｃｕｒｖｅｄ ｓｌｉｇｈｔｌｙ， ｔｈｒｅｅ ｔｏ ｓｅｖｅｎ ｓｅｐｔａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｏｕｎｄｅｄ
ｅｎｄｓ． Ａｐｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｂｌｕｎｔ ａｎｄ ｒｏｕｎｄｅｄ． Ｂａｓａｌ ｃｅｌｌｓ ｈａｄ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｏｏｔ ｓｈａｐｅ． Ｔｈｅ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ， ＥＦ⁃１α
ａｎｄ β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｓｈａｒｅｄ ９７％ ， ９９％ ａｎｄ ９８％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｓｏｌａｎｉ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃａｎｋｅｒ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ Ｆ．
ｓｏｌａｎｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ； Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃａｎｋｅｒ； Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ； ｓｙｍｐｔｏｍ
　 　 甘薯是世界上第 ７ 大粮食作物，也是重要的工
业原料、饲料、新型能源及保健作物。 我国是世界上
最大的甘薯生产国，每年种植 ６６０ 万 ｈｍ２，年产量约
１ 亿 ｔ，占全世界产量的 ７０％ （Ｌｏｅｂｅｎｓｔｅｉｎ ＆ Ｔｈｏｔｔａｐ⁃
ｐｉｌｌｙ，２００９）。 当前，我国甘薯上的病害种类繁多，主
要包括黑痣病、黑斑病、根腐病（中国农业科学院植
物保护研究所，１９９５）以及镰孢菌腐烂与溃疡病
（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 由于甘薯连年种植，导致病害
发生严重且呈逐年加重趋势，尤其是近年新发现的
镰孢菌腐烂与溃疡病蔓延迅速，发病率约为 ５％ ～
１０％ ，在储藏后期发病严重时可达 ２０％以上（Ｗａｎｇ
ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。
茄镰孢菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ是寄主范围十分广泛
的重要植物病原真菌，可侵染瓜类、豆类、胡椒、马铃
薯和柑橘等（Ｌｅｓｌｉｅ ＆ Ｓｕｍｍｅｒｅｌｌ，２００６），造成植物茎
基部、根部和果实腐烂，严重影响作物的产量和品
质。 该菌危害甘薯后可引起镰孢菌腐烂与溃疡病，
造成 储 藏 期 薯 块 腐 烂 与 生 长 期 茎 溃 疡
（Ｌｏｅｂｅｎｓｔｅｉｎ ＆ Ｔｈｏｔｔａｐｐｉｌｌｙ，２００９）。 茄镰孢菌在甘
薯上的发生与危害在国外已有较多报道，主要集中
于病原鉴定 （ Ｃｌａｒｋ，１９７９； Ｎｉｅｌｓｅｎ ＆ Ｍｏｙｅｒ，１９７９；
Ｍｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ． ，１９８２）、传播途径（Ｃｌａｒｋ，１９８０；Ｍｏｙｅｒ ｅｔ
ａｌ． ，１９８２ ） 和抗性品种筛选 （ Ｃｌａｒｋ ａｔ ａｌ． ， １９８６；
Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９８７）等；在国内，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．
（２０１４）首次报道了在甘薯储藏期由茄镰孢菌引起
的镰孢菌腐烂与溃疡病，主要表现为大量薯块带有
浅褐色轮纹状病斑，但在 ２０１４ 年对河北省甘薯储藏
期病害进一步调查中发现，部分受害薯块带有不明
显轮纹病斑，在育秧期发现发病薯秧茎基部有黑色
或者褐色病斑，疑似甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病。 鉴
于目前我国对甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的发生与病
原尚无系统研究，因此确定甘薯上引致该病害的病
原菌对该病害的深入研究具有重要意义。
目前，柯赫氏法则是确定侵染性病原物的常规
方法（Ａｇｒｉｏｓ，２００５），而对病原物的准确鉴定主要基
于其形态特征以及相关分子信息（魏巍等，２０１３）。
镰孢菌属种类繁多，目前已确认的种类有 ８０ 余种
（Ｌｅｓｌｉｅ ＆ Ｓｕｍｍｅｒｅｌｌ，２００６），但用于区分种类的形态
特征较少，有些近缘种甚至很难利用形态特征进行
区分，因此分子水平的鉴定变得越来越重要。
ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因序列是镰孢菌种类
鉴定常用的分子序列信息（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＆ Ｃｉｇｅｌｎｉｋ，
１９９７；Ｏ’ Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ， １９９８ ）。 因此，本研究于
２０１４ 年从河北省不同种植区采集储藏期和育秧期
甘薯病样，采用柯赫氏法则回接验证，依据病原菌的
菌落形态、分生孢子和分生孢子梗的形态特征以及
ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α、β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因序列确定病原菌种
类，旨在为我国甘薯病害的准确识别与综合防控提
供重要的理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试品种：采用甘薯感病品种遗字 １３８，由河北
省农林科学院粮油作物研究所提供。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂 （ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：去皮马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、
琼脂 ２０ ｇ、水 １ ０００ ｍＬ；马铃薯葡萄糖（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘ⁃
ｔｒｏｓｅ，ＰＤ）培养液：ＰＤＡ 培养基组分中不加琼脂；康
乃馨叶片（ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｌｅａｆ⁃ｐｉｅｃｅ ａｇａｒ，ＣＬＡ）培养基：灭
菌康乃馨叶片（５ ｍｍ 段）３ ～ ４ 片放入培养皿中，倒
入 ２％水琼脂培养基；ＬＢ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）固体培养
基：蛋白胨 １０ ｇ、酵母浸出粉 ５ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ、琼脂 ２０
ｇ、水 １ ０００ ｍＬ；ＬＢ液体培养基：ＬＢ固体培养基组分
中不加琼脂； ２％ 绿豆汤培养液： ２０ ｇ 绿豆于
１ ０００ ｍＬ水中煮 ３０ ｍｉｎ。
试剂：真菌 ｇＤＮＡ 提取试剂盒，美国 Ｂｉｏｍｉｇａ 公
司；２ × Ｅｓ Ｔａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＤＭ２０００ｐｌｕｓ Ｍａｒｋｅｒ、琼脂
糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等，北京康为世
纪生物科技有限公司；ｐＭＤ１８⁃Ｔ 载体，宝生物工程
（大连）有限公司。
２４２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
仪器：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４２４ 离心机，德国
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司；Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ９６
ＰＣＲ仪，德国 Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司；Ｇ∶ ＢＯＸ 凝胶
成像系统，英国 Ｓｙｎｇｅｎｅ公司；Ｎｉｋｏｎ ８０ｉ显微照相系
统，日本 Ｎｉｋｏｎ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病调查与症状观察
在河北省保定市、易县、雄县、石家庄藁城区等
甘薯种植区，随机调查 ５ 个储藏窖，每一薯窖随机调
查 １００ 个薯块；此外在易县、雄县分别随机调查 ５ 个
苗床，每一苗床随机拔取 ２００ 株，调查甘薯镰孢菌腐
烂与溃疡病的发生情况。 取带有病斑的病薯，记录
病斑的形状位置，测量其大小，用手术刀剖开病斑表
皮，嗅其味道，纵切病斑，用尺子测量病斑深度，观察
纵切面的特征。 采集病秧，观察并记录病斑位置与
形状等。
１􀆰 ２􀆰 ２ 甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病病原菌分离
随机采集病薯 ６２ 份和带病斑薯秧 １０ 份，带回
室内进行病原菌的分离。 首先将病样清洗干净，取
其 ４ ～ ５ ｍｍ２ 病健交界处组织，用 ７５％乙醇消毒 １０
ｓ后，放入 １􀆰 ５％次氯酸钠溶液中消毒 ３０ ｓ，用灭菌
水冲洗 ３ 次，放入含有 ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 硫酸链霉素的 ＰＤＡ
平板中，２５℃培养 ３ ｄ，再转接到 ＰＤＡ斜面培养基中
进行纯化培养，７ ｄ 后于 ４℃保存备用 （Ｇａｅｔáｎ ｅｔ
ａｌ． ，２００４）。
１􀆰 ２􀆰 ３ 病原菌的回接验证
以从雄县典型甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病病薯中
分离获得的 Ｘ１４０１１ 菌株和从病秧中分离获得的
Ｘ１４５３ 菌株为供试菌株，采用柯赫氏法则进行回接
验证试验。 将遗字 １３８ 薯块清洗干净，用 ７５％乙醇
擦拭表面后，晾干。 在培养 ５ ｄ 的病原菌 ＰＤＡ 菌落
边缘打取直径 ５ ｍｍ 的菌碟，贴到消毒后的薯块表
面，２５℃保湿培养，１４ ｄ 后观察发病情况。 剪取带
有３ ～ ４个节间的茎蔓，种植在经 １２１℃湿热灭菌
　 　 　
３０ ｍｉｎ的土 ∶沙子比例为１∶ １的土壤中，缓苗 ２０ ｄ 后
备用。 将分离纯化的病原菌菌株接种于 ２％的绿豆
汤培养液中，２５℃下 １８０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ４ ｄ，将培养
液稀释至孢子含量为 ２ × １０６ＣＦＵ ／ ｍＬ，按照每株薯
秧１ ｍＬ的接种量，均匀接种于遗字 １３８ 盆栽苗的茎
基部，放置于 ２５℃、Ｌ ∶ Ｄ ＝ １６ ∶ ８的培养室，１４ ｄ后观
察并记录发病情况。
１􀆰 ２􀆰 ４ 病原菌的形态学鉴定
将分离纯化的病原菌菌株转入 ＰＤＡ 平板上，
２５℃、黑暗条件下培养 ７ ｄ 后在显微镜下进行菌落
形态的观察；再将病原菌菌株转入 ＣＬＡ 平板上，
２５℃、Ｌ ∶ Ｄ ＝ １２ ∶ １２ 条件下培养 １０ ｄ 后在显微镜下
进行分生孢子和分生孢子梗的形态观察，并参考
Ｌｅｓｌｉｅ ＆ Ｓｕｍｍｅｒｅｌｌ（２００６）关于镰孢菌的分类方法，
依据其形态学特征将分离菌株初步鉴定到种，进行
单孢纯化并保存备用。
１􀆰 ２􀆰 ５ 病原菌的分子序列分析
将病原菌 Ｘ１４０１１ 和 Ｘ１４５３ 的单孢菌落转入
ＰＤ培养液中，２５℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ３ ｄ，过滤取
菌丝 ０􀆰 １ ｇ 左右，液氮研磨后使用真菌 ｇＤＮＡ 提取
试剂盒提取菌株的基因组 ＤＮＡ。 采用 ＩＴＳ１Ｆ ／ ＩＴＳ４
（宋晓贺等，２０１１）、ＥＦ⁃Ｆ ／ ＥＦ⁃Ｒ（Ｏ’ Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ，
１９９８）、Ｂｅｔａ⁃Ｆ ／ Ｂｅｔａ⁃Ｒ（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＆ Ｃｉｇｅｌｎｉｋ，１９９７）
引物分别对病原菌的 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、ＥＦ⁃１α 和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ
基因进行 ＰＣＲ 扩增。 ＰＣＲ 反应体系为：２ × Ｅｓ Ｔａｑ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０ μＬ、１０ μｍｏｌ ／ Ｌ正反向引物各 ０􀆰 ５ μＬ、
ＤＮＡ模版 １ μＬ，加 ｄｄＨ２Ｏ 至 ２０ μＬ。 反应程序为：
９４℃预变性 ４ ｍｉｎ；９４℃变性 ３０ ｓ，各引物按相应的
退火温度退火 ３０ ｓ（表 １），７２℃延伸 １􀆰 ５ ｍｉｎ，共 ３０
个循环；最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎ。 取 ５ μＬ ＰＣＲ 产物
经 １􀆰 ０％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成
像系统上观察并拍照。 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回
收目的条带。
　 　 将回收纯化后的 ＰＣＲ 产物与 ｐＭＤ１８⁃Ｔ 载体
　 　 　表 １ 扩增甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病病原菌不同序列所用的引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃａｎｋｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ
基因
Ｇｅｎｅ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ （℃）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′—３′）
ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ ５３ 　 ＩＴＳ１Ｆ ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ
　 ＩＴＳ４ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ
ＥＦ⁃１α ５６ 　 ＥＦ⁃Ｆ ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＲＧＡＣＡＡＧＡＣ
　 ＥＦ⁃Ｒ ＧＧＡＲＧＴＡＣＣＡＧＴＳＡＴＣＡＴＧＴＴ
β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ ６０ 　 Ｂｅｔａ⁃Ｆ ＡＡＣＡＴＧＣＧＴＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＧＴ
　 Ｂｅｔａ⁃Ｒ ＴＣＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴＣＣ
３４２２ 期 王容燕等： 河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原鉴定
４℃过夜连接，连接产物用热激法转化感受态大肠杆
菌 ＤＨ５α，并于 ＬＢ平板（含氨苄青霉素 ５０ ｍｇ ／ Ｌ）上
培养 １２ ～ １４ ｈ 筛选阳性克隆。 挑取单菌落接种于
ＬＢ液体培养基中（含氨苄青霉素 ５０ ｍｇ ／ Ｌ）进行扩
大培养，将获得的菌液进行质粒提取，ＰＣＲ 验证。
将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公
司进行测序。 利用 ＤＮＡｓｔａｒ 软件包中的 ＳｅｑＭａｎ 进
行序列拼接比对。 所得序列提交 ＮＣＢＩ 数据库进行
ＢＬＡＳＴ比对分析。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的发生及症状
保定市、易县、雄县和藁城区各地储藏期甘薯的
平均发病率分别为 ２􀆰 ０％ 、５􀆰 ０％ 、５􀆰 ８％ 和 ４􀆰 ０％ 。
在对河北雄县和易县育秧田的调查中，均有甘薯镰
孢菌腐烂与溃疡病发生，雄县发病较重，平均发病率
为 ０􀆰 ７％ 。
从田间采集的发病薯块，有褐色的环状病斑
（图 １⁃ａ），颜色较薯皮深或相同，病斑有一圈轮纹，
或多圈轮纹，初期侵染时，病斑无轮纹，部分薯块端
部呈褐色腐烂。 病斑大小为 １１ ～ ７５ ｍｍ × ３６ ～ ８０
ｍｍ，平均大小为 ４９ ｍｍ × ６３ ｍｍ，平均深度 ２ ～ ２８
ｍｍ。 病斑边缘整齐，稍有凹陷，内部深褐色或黑色。
侵染较浅的薯块切面无蜂窝状空腔，仅在表皮处形
成深褐色或黑色组织坏死（图 １⁃ｂ），病斑较硬。 侵
染较深的薯块内部有蜂窝状空腔，内有白色菌丝，病
斑较软（图 １⁃ｃ）。 破开病斑有严重的苦味，有些病
斑无苦味。 薯秧感病后在主茎基部有黑色或褐色病
斑，形状不规则，呈点片发生（图 １⁃ｄ ～ ｆ），或在病斑
处出现纵向裂开（图 １⁃ｇ），在节间点发病时，须根也
有点片发黑腐烂症状，叶片变黄；后期随着病害发
展，病斑环绕植株主茎基部，发生严重时可导致整个
植株枯死。 发病较轻病秧，节间点的须根发育正常，
栽插后可以正常生长。
图 １ 甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病在储藏期甘薯薯块和薯秧茎基部的症状
Ｆｉｇ． １ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃａｎｋｅｒ
ａ： 储藏期发病薯块； ｂ： 发病初期症状； ｃ： 发病后期症状； ｄ：甘薯茎基部田间感染症状； ｅ： 茎基部黑色病斑； ｆ： 茎基
部褐色病斑； ｇ： 茎基部开裂病斑。 ａ： Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ； ｂ： ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔ ｏｆ
ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ； ｃ： ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｓｔａｇｅ； ｄ： ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｔｅｍ ｉｎ
ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ； ｅ： ｂｌａｃｋ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｎ ｓｔｅｍ； ｆ： ｂｒｏｗｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｎ ｓｔｅｍ； ｇ： ｒｕｐｔｕｒｅｄ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｎ ｓｔｅｍ．
　
２􀆰 ２ 甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病病原菌分离情况
在 ６２ 份病薯材料中分离得到疑似茄镰孢菌侵
染的薯块共计 ４４ 份，其中病斑带有轮纹的占总病薯
的 ６１􀆰 ３６％ ，病斑没有轮纹或者轮纹不明显的占
３８􀆰 ６４％ ；端部腐烂的占 ４０􀆰 ９１％ ，表面腐烂的占
５９􀆰 ０９％ ；病斑内有蜂窝状空腔的占 ７２􀆰 ７３％ ，病斑
无蜂窝状空腔的占 ２７􀆰 ２７％ ；病斑带有苦味的占
５９􀆰 ０９％ ，病斑没有苦味的占 ４０􀆰 ９１％ （表 ２）。 甘薯
秧苗病斑以黑斑和褐斑类型为主，少有开裂，从病株
中共分离得到 ７ 株茄镰孢菌。
２􀆰 ３ 病原菌的形态特征
分离的病原菌在 ＰＤＡ平板上培养 ３ ｄ 后，形成
的菌落平均直径为 ３􀆰 ０ ～ ３􀆰 ５ ｃｍ。 菌丝白色或奶油
色，绒毛状，较稀疏（图 ２⁃ａ ～ ｂ）；从菌落背面可见中
心产生浅褐色或者红褐色色素，产生或者不产生轮
纹。 分生孢子座在 ＣＬＡ平板上为白色或灰白色，小
４４２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
型分生孢子假头状聚生，单瓶梗产孢，长椭圆形，单
胞或双胞，大小为 ４􀆰 ３ ～ １７􀆰 ７ μｍ ×２􀆰 ９ ～ ５􀆰 １ μｍ；大
型分生孢子稍弯，两端钝圆，顶细胞钝圆，基细胞足
跟较明显，稍弯，分隔类型较多，多数 ５ ～ ７ 隔，少数
３ ～ ４ 隔或 ８ 隔，大小为 ２０􀆰 ７ ～ ９１􀆰 ５ μｍ × ４􀆰 ９ ～ ８􀆰 ３
μｍ（图 ２⁃ｃ）。 依据病原菌的形态特征，初步确定甘
薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原菌为茄镰孢菌 Ｆ． ｓｏ⁃
ｌａｎｉ。
表 ２ 储藏期甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病病征调查
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒ ｄａｍａｇｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｏｔ ｒｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃａｎｋｅｒ ｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ
地区
Ａｒｅａ
菌株总数
Ｔｏｔａｌ
ｉｓｏｌａｔｅｓ
轮纹
Ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ
ｒｉｎｇ
无轮纹
Ｎｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ
ｒｉｎｇ
蜂窝
Ｃａｖｉｔｙ
无蜂窝
Ｎｏ ｃａｖｉｔｙ
苦味
Ｂｉｔｔｅｒ
无苦味
Ｎｏｔ ｂｉｔｔｅｒ
表面腐烂
Ｓｕｒｆａｃｅ
ｒｏｔ
端部腐烂
Ｅｎｄ ｒｏｔ
保定市
Ｂａｏｄｉｎｇ Ｃｉｔｙ ２ ２ ０ １ １ ２ ０ ２ ０
易县
Ｙｉ Ｃｏｕｎｔｙ ５ ４ １ ３ ２ ５ ０ ４ １
雄县
Ｘｉｏｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ ２９ １７ １２ ２２ ７ １６ １３ １６ １３
藁城区
Ｇａｏｃｈｅｎｇ Ａｒｅａ ８ ４ ４ ６ ２ ３ ５ ４ ４
总数
Ｔｏｔａｌ ４４ ２７ １７ ３２ １２ ２６ １８ ２６ １８
所占百分比
Ｐｅｒｃｅｎｔ （％ ） 　 ６１􀆰 ３６ 　 ３８􀆰 ６４ ７２􀆰 ７３ ２７􀆰 ２７　 ５９􀆰 ０９　 ４０􀆰 ９１　 ５９􀆰 ０９　 ４０􀆰 ９１
图 ２ 茄镰孢菌的培养特征与菌体形态
Ｆｉｇ． ２ Ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
ａ： ＰＤＡ平板上的培养特征； ｂ： ＰＤＡ平板上的菌体形态； ｃ： ＣＬＡ平板上的大型分生孢子。 ａ： Ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
Ｆ． ｓｏｌａｎｉ ｏｎ ＰＤＡ； ｂ： ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆ． ｓｏｌａｎｉ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ＰＤＡ； ｃ： ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉｕｍ ｏｆ Ｆ． ｓｏｌａｎｉ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｎ ＣＬＡ．
　
２􀆰 ４ 病原菌的回接验证
接种 Ｘ１４０１１ 和 Ｘ１４５３ 菌株的薯块在培养 １４
ｄ后均产生褐色病斑，病斑大小为 ２０ ～ ２５ ｍｍ ×
２０ ～ ２２ ｍｍ，病斑有苦味；培养 ２１ ｄ 后薯块病斑扩
大，轮纹症状逐渐明显。 接种 Ｘ１４０１１ 和 Ｘ１４５３ 菌
株的薯秧在培养 ２１ ｄ后薯秧茎基部产生黑色或者
褐色溃疡病斑，而对照薯块、薯秧均未发病。 将病
斑表面消毒后，再进行分离培养，通过对分离病原
菌的菌落特征和孢子形态进行观察，确定均为茄
镰孢菌。 表明从病薯和病秧上分离的病原菌为同
一病原菌，即茄镰孢菌，能够同时侵染薯块和
薯秧。
２􀆰 ５ 病原菌的分子序列分析
对病原菌 Ｘ１４０１１ 和 Ｘ１４５３ 菌株的 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、
ＥＦ⁃１α和 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因进行扩增，分别获得 ５９７、
７４８、１ ３３２ ｂｐ的片段（图 ３），２ 个菌株的基因序列相
同，与茄镰孢菌 Ｆ． ｓｏｌａｎｉ 菌株的同源性分别为
９７􀆰 ０％ （ＡＦ１７８４０７）、９９􀆰 ０％ （ＡＢ５５３５８４、ＡＢ５５３５８５）
和 ９８􀆰 ０％ （ＪＸ９４５１６９、ＡＦ１７８３４４）。 进一步确定从甘
薯薯块和薯秧上分离的菌株 Ｘ１４０１１ 和 Ｘ１４５３ 均为
茄镰孢菌 Ｆ． ｓｏｌａｎｉ。
３ 讨论
植物上的茄镰孢菌存在 １０ 个专化型（ Ｓｕｇａ ｅｔ
５４２２ 期 王容燕等： 河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原鉴定
图 ３ 茄镰孢菌 Ｘ１４０１１ 和 Ｘ１４５３ 菌株的 ＰＣＲ产物
Ｆｉｇ． ３ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ Ｘ１４０１１ ａｎｄ
Ｘ１４５３ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ
　
ａｌ． ，２０００），其中甘薯专化型 Ｆ． ｓｏｌａｎｉ ｆ． ｓｐ． ｂａｔａｔａｓ
主要侵染甘薯，造成甘薯储藏期和生长期病害。 在
上世纪 ８０ 年代，美国相继报道茄镰孢菌可侵染甘薯
的薯块、芽、藤蔓和茎，造成甘薯薯块表面腐烂、薯块
端部腐烂和茎溃疡（Ｃｌａｒｋ，１９７９；１９８０；Ｍｏｙｅｒ ａｔ ａｌ． ，
１９８２），称作甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病。 本研究通
过对河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病样的采集、病
原菌的分离鉴定表明，在薯块上产生带有轮纹的褐
色病斑、有蜂窝状空腔、有苦味是此病害的典型症
状，但从不产生轮纹的病斑、薯块端部褐色腐烂病斑
以及薯秧茎基部病斑中也分离出了茄镰孢菌，这可
能与甘薯品种、病原菌致病力以及环境条件有关。
且通过回接试验证实，这些茄镰孢菌能够同时侵染
薯块和薯秧，与 Ｃｌａｒｋ（１９８０）和 Ｍｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２）
的报道相同。
在储藏期，甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的发病初
期病斑较浅，仅在薯块表皮有褐色病斑，有苦味，与
由甘薯长喙壳菌 Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ 引起的甘薯黑
斑病病斑不易区分；但在发生后期，形成轮纹，病斑
凹陷，在内部形成空腔，并产生白色菌丝，同甘薯黑
斑病差异较大。 刘泉姣等（１９８２）报道茄镰孢菌可
引起甘薯根腐病，主要症状为须根根尖变黑，逐渐向
上蔓延到根茎，形成黑褐色病斑；病斑表皮纵裂，皮
下组织变黑疏松；薯块小，表皮粗糙，布满大小不等
的黑褐色病斑，后期龟裂，皮下组织变黑，无苦味。
本研究发现由茄镰孢菌引起的甘薯镰孢菌腐烂与溃
疡病的植株症状与甘薯根腐病症状明显不同，区别
在于甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病主要发生在主茎基
部，而须根变黑腐烂症状不明显，病斑主要为黑色或
褐色；对甘薯植株生长抑制作用不明显，这可能是因
为造成这 ２ 种病害的病原菌菌株不同。
随着分子生物学的发展，基因序列分析在真菌
鉴定中的作用越来越重要。 通过对不同样本同源基
因的比较，可为物种鉴定提供最直接且最为准确的
信息。 郭成等（２０１１）通过 β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ 基因序列进一
步确认了对三线镰孢菌 Ｆ． ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ的形态鉴定结
果；孙静等（２０１４）通过形态学特征结合 ＥＦ⁃１α 基因
序列分析对河南省 １６３ 个玉米茎基部镰孢菌菌株进
行了鉴定，并认为该技术可准确鉴定镰孢菌种类；
Ｏｅｃｈｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９）采用 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ基因序列分析，
鉴定了 ５８ 个镰孢菌菌株分别属于 ４ 个已知种和 １
个未知种，并证实分子鉴定结果与形态鉴定结果的
一致性。 本研究对疑似甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的
病原菌在形态学鉴定的基础上，对其 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ、
ＥＦ⁃１α、β⁃ｔｕｂｕｌｉｎ基因序列进行了分析，保证了鉴定
结果的准确性。
本研究通过对河北省 ４ 个主要甘薯种植区甘薯
病害的调查表明，甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病已经成
为储藏期薯块和育秧期薯秧的主要病害，在薯窖的
发病率为 ２􀆰 ０％ ～ ５􀆰 ８％ ，在育秧田的发病率为 ０ ～
０􀆰 ７％ ，同一个地区的不同薯窖和苗床发病程度明显
不同。 在储藏和育秧后期，该病害发生尤为严重，已
经成为制约当地甘薯生产发展的重要因素。 但是，
目前我国对于该病害的发生和防治均未能引起足够
的重视。 在当前甘薯规模化种植和产业化储藏的生
产模式下，连作及种薯种苗的调运，加重了该病的发
生程度，扩大了发生范围，因此，需要尽快开展针对
该病害的抗病品种选育和无病种苗繁育工作，筛选
高效防治药剂，从而有效控制甘薯镰孢菌腐烂与溃
疡病的发生和蔓延。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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［魏巍， 朱杰华， 张宏磊， 杨志辉． ２０１３． 河北和内蒙古马
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（责任编辑：李美娟）
７４２２ 期 王容燕等： 河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原鉴定