全 文 ：植物营养与肥料学报 ２０１５，２１（４）：１０２２－１０３１ ｄｏｉ牶１０１１６７４／ｚｗｙｆ．２０１５０４２２
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｎｕｔｒｉｆｅｒｔ．ｏｒｇ
收稿日期：２０１４－０３－１７ 接受日期：２０１４－０５－２７ 网络出版日期：２０１５－０５－０６
基金项目：国家自然科学基金（４０８７１１２１）资助。
作者简介：王进闯（１９７６—），男，河北邯郸人，博士，主要从事微生物生态学研究。Ｅｍａｉｌ：ｊｉｎｃｈｕａｎｇｗａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ
通信作者 Ｔｅｌ：０１０－６２７３２１９８，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｊｇ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
大豆连作土壤线虫群落结构的影响
王进闯１，２，王敬国１
（１中国农业大学资源与环境学院，农业部植物营养学重点实验室，北京 １００１９３；
２中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口 ５７１１０１）
摘要：【目的】由根系活动引起的根际微生态系统的改变，特别是病原生物数量的增加是导致作物产生连作障碍的
主要因素。其中，植生性病原线虫的危害是大豆连作障碍产生的重要原因之一。由于植生性病原线虫的存在往往
受到其它营养类型线虫的影响，因而从线虫群落结构进行分析，不仅可以更好地反映不同营养类型的线虫之间的
相互关系，而且能全面了解土壤的健康状况。本文利用末端限制性片段长度多态性分析（Ｔ－ＲＦＬＰ）和实时荧光定
量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等分子生物学的方法，比较短期连作和长期连作线虫群落的差异，揭示长期连作大豆土壤线虫群落
的变化规律，理解线虫群落与植物健康的关系，阐明线虫群落的变化在大豆连作障碍中的作用。【方法】首先，基于
１６ｓｒＤＮＡ的Ｔ－ＲＦＬＰ指纹图谱，分析土壤中线虫的物种丰富度和不同大小的末端限制性片段（Ｔ－ＲＦ）的相对丰
度。然后，通过构建克隆文库和系统发育树，鉴定Ｔ－ＲＦ片段对应的线虫种类。最后，利用ｑＰＣＲ，采用绝对定量的
方法确定线虫群落的大小。【结果】线虫的物种丰富度随着连作年限的增加呈逐渐降低的趋势。第１年物种丰富
度最高，第３年的丰富度显著低于第１年，之后逐渐降低，９年之后保持不变。大豆根际土中共检测到１６个 Ｔ－
ＲＦ，且大多数Ｔ－ＲＦ能从克隆文库中鉴定。其中，食细菌线虫（Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ）是最为丰富的线虫种类。在连作２ ３
年后，植物寄生线虫相对丰度增加，而在连作后期，植物寄生线虫相对丰度减少。非度量多维尺度分析（ＮＭＤＳ）示，
第１年线虫群落与其余年限分开，而第２和第３年聚集较近，而连作９、１１和１３年后聚集较近。另外，线虫群落结
构与ｐＨ、土壤有机质（ＳＯＭ）、速效磷（ＡＰ）、细菌数量和真菌数量相关。线虫群落总丰度呈先增后降的趋势，最高
值出现在第６年。线虫的基因拷贝数与土壤ＮＨ＋４ 和染料木因浓度呈显著正相关，而与ＮＯ
－
３ 和细菌的基因拷贝数
呈显著负相关。【结论】大豆根际土壤中，线虫群落丰度在连作第２ ３年下降最为明显，到第６ ９年有一定的
恢复，但不能完全修复。大豆种植为第一，基线虫属（５５６ｂｐ）丰度最高。土壤功能正常，连作第２ ３年后，摄食性
线虫（５５５ｂｐ、５５８ｂｐ、５６０ｂｐ等）丰度增加，线虫浸染机会增加。
关键词：连作；大豆；线虫群落；Ｔ－ＲＦＬＰ；定量ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ３４４４；Ｓ４３２４＋５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－５０５Ｘ（２０１５）０４－１０２２－１０
Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｏｎｓｏｉｌｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
ＷＡＮＧＪｉｎｃｈｕａｎｇ１，２，ＷＡＮＧＪｉｎｇｇｕｏ１
（１ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＭＯＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ】ＳｏｙｂｅａｎｙｉｅｌｄｄｅｃｒｅａｓｅａｎｄｓｏｉｌｓｉｎｃｋｎｅｓｓｉｎｔｈｅｎｏｒｔｈｅａｓｔＣｈｉｎａｈａｖｅｂｅｅｎａｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｍａｙｐｒｏｖｉｄｅｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｆｏｏｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｐｌａｎｔ
ｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｓｎａｍｅｌｙｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｇｌｙｃｉｎｅｓ），ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅａｄｖａｎｔａｇｅ
ｏｆｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｉｎｇｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｓｏｖｅｒｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｆｒｅｅｌｉｖｉｎｇｆｏｒｍｓ，ｗｉｔｈｒｅｓｕｌｔｉｎｇｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓ．Ｔｈｕｓ，
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔａｓｐｅｃｔｏｆｓｏｉｌｓｉｃｋｎｅｓｓ
ｏｆｓｏｙｂｅａｎ．Ｗｅｕｓｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （Ｔ－ＲＦＬＰ）ａｎｄＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ
（ｑＰＣＲ）ａｓｓａｙｓｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｓｏｉｌｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓｔａｋｅｎｆｒｏｍ ａｌｏｎｇｔｅｒｍ ｆｉｅｌｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｉｔｈ
４期 王进闯，等：大豆连作土壤线虫群落结构的影响
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｕｐｔｏ１３ｙｅａｒｓ．Ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｄｙｎａｍｉｃ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｓｉｎｆｒｅｅｌｉｖｉｎｇｎｅｍａｔｏｄｅｓａｎｄｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｓｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｄｕｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎ
ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅａｒｅｌｉｎｋｅｄｔｏｓｏｉｌｓｉｃｋｎｅｓｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔ－ＲＦＬＰａｓｓａｙｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｓｏｉｌ
ｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｓ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＴ－ＲＦＬＰａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｒｉｃｈｎｅｓｓａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅ
ａｂｕｎｄａｎｃｅｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｓｉｚｅｓｏｆＴ－ＲＦｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏａｓｓｉｇｎｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｆｉｌｉａｔｉｏｎｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃＴ－
ＲＦ，ａｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｐＭＤ１９－ＴＶｅｃｔｏｒ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅ
ＭＥＧＡｓｏｆｔｗａｒｅｗｉｔｈｔｈｅＫｉｍｕｒａｔｗｏｐａｒａｍｅｔｅｒｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｉｓｔａｎｃｅｍａｔｒｉｘｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｔｒｅｅｄｅｓｉｇｎ．Ｆｉｎａｌｙ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏａｓｓｅｓｓｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｉｚｅｓｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ
ｓｏｉｌｓ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｒｉｃｈｎｅｓｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｒａｐｉｄｌｙｔｏｔｈｅｌｏｗｅｓｔｖａｌｕｅｉｎｔｈｅｎｉｎｔｈ
ｙｅａｒａｎｄｔｈｅｎｒｅｍａｉｎｓａｃｏｎｓｔａｎｔｆｒｏｍｔｈｅｎｉｎｔｈｙｅａｒｔｏｔｈｅｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈｙｅａｒ．ＴｈｅＴ－ＲＦＬＰａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅ
ｇｅｎｅｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｓｏｙｂｅａｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｏｆｔｈｅｎｏｒｔｈｅａｓｔＣｈｉｎａａｒｅｄｏｍｉｎａｔｅｄｂｙ
Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｓｏｆｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｙｅａｒａｎｄｔｈｉｒｄｙｅａｒｏｆｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ
ａｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｆｒｏｍｔｈｅｓｉｘｔｈｙｅａｒｔｏ１３ｔｈｙｅａｒ．Ｔｈｅｆｒｅｅｌｉｖｉｎｇｎｅｍａｔｏｄｅｓａｒｅｍｏｒｅａｂｕｎｄａｎｃｅｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔ
ｙｅａｒａｎｄｌｅｓｓａｂｕｎｄａｎｃｅｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｙｅａｒａｎｄｔｈｉｒｄｙｅａｒ，ａｎｄａｒｅｍｏｒｅａｂｕｎｄａｎｃｅｆｒｏｍｔｈｅｓｉｘｔｈｙｅａｒｏｎｗａｒｄｓ．
Ｎｏｏｍｎｉｖｏｒｅｓｐｒｅｄａｔｏｒｓａｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｎｏｎｍｅｔｒｉｃｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｃａｌｉｎｇ（ＮＭＤＳ）ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｔｈｅ
ｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｃｏｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ９ｔｈ，１１ｔｈ，ａｎｄ１３ｔｈｙｅａｒｓｃｌｏｓｅｌｙｃｌｕｓｔｅｒｔｏｇｅｔｈｅｒ，
ｏｕｔｓｉｄｅｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｔｈｒｅｅｙｅａｒｓ．Ｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ
ｐａｉｒｗｉｓｅＢｒａｙＣｕｒｔｉｓｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｈａｖｅｌｅｓｓｃｈａｎｇｅｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｔｈｒｅｅｙｅａｒｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ
ａｒｅｈｉｇｈｌｙｄｉｆｅｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｙｅａｒｓａｎｄｉｎｉｔｉａｌｙｅａｒｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｉｓａｆｅｃｔｅｄｂｙａｖａｉｌａｂｌｅＰ，ｓｏｉｌｏｒｇａｎｉｃｍａｔｅｒ（ＳＯＭ），ｐＨ，ｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｆｕｎｇａｌａｂｕｎｄａｎｃｅ．Ｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆ
ｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍｔｈｅｆｉｒｓｔｙｅａｒｔｏｓｉｘｔｈｙｅａｒ，ａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍｔｈｅｎｉｎｅｔｈｙｅａｒｔｏ１３ｔｈ
ｙｅａｒ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｅｌａｔｅｄｔｏＮＨ＋４ ａｎｄｇｅｎｉｓｔｅｎ，ａｎｄｉｓ
ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｅｌａｔｅｄｔｏＮＯ－３ ａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌａｂｕｎｄａｎｃｅ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】Ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｒｉｃｈｎｅｓｓａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅ
ｏｆｎｅｍａｔｏｄｅｉｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｎｄｔｈｅｔｈｉｒｄｙｅａｒｏｆｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄｒｅｖｉｖｅｄｆｏｒｍ
ｔｈｅ６ｔｈｔｏｔｈｅ９ｔｈｙｅａｒｔｏｓｏｍｅｅｘｔｅｎｔ，ｂｕｔｎｏｔｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ．Ｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｙｅａｒｏｆｓｏｙｂｅａｎｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆ
Ａｃｒｅｂｅｌｏｉｄｅｓｉｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ，ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｈｅａｌｔｈｙａｎｄｎｏｒｍａｌｓｏｉｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｅｆｏｌｏｗｉｎｇ２ａｎｄ３ｙｅａｒｓ，ｔｈｅ
ａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｈｉｇｈｒｉｓｋｏｆｄｉｓｅａｓｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｌｏｗｅｒｒａｔｉｏｏｆ
ｆｒｅｅｌｉｖｉｎｇｎｅｍａｔｏｄｅｓｔｏｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｙｅａｒａｎｄｔｈｉｒｄｙｅａｒｃｏｕｌｄｒｅｓｐｏｎｄｔｏｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ
ｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ牶ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ牷ｓｏｙｂｅａｎ牷ｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙ牷Ｔ－ＲＦＬＰ牷ｑＰＣＲ
土壤健康是农产品产量和品质的重要保证，而
土壤生物的群落结构决定了土壤的健康状况，土壤
生物群落结构的变化可作为土壤变化的早期预警生
态指标［１］。线虫群落包括不同营养类群：植物寄生
线虫、食细菌线虫、食真菌线虫、捕食性和杂食性线
虫，是土壤动物中数量最多、功能最丰富的一类［２］。
线虫影响着土壤有机质分解和养分循环以及病害的
发生，被认为是土壤健康状况的敏感性指示
生物［３］。
研究 认 为，植 物 寄 生 线 虫 中 孢 囊 线 虫
（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属 的 大 豆 孢 囊 线 虫 （Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ
ｇｌｙｃｉｎｅｓ）是引起大豆连作障碍的重要原因之一，与
植物根系释放的化感物质对植物寄生线虫卵的孵化
具有刺激作用有关［４－５］。短期连作（＜５ ６年）可
引起大豆胞囊线虫种群迅速增加，导致作物的发病
率升高，使大豆减产［６］。然而，土壤生态系统具有
一定的自我修复能力，长期连作的土壤中出现了抑
制孢囊线虫的因素［７］。如随着大豆连作年限的增
加（＞５ ６年），大豆胞囊线虫种群密度减少［８］。
虽然长期连作使非抑制线虫土壤转变成抑制线虫土
壤的机理仍然不清楚，但普遍认为连作过程中环境
变化可能起到驱动作用。连作在改变土壤条件的同
时，也改变了土壤线虫的生存环境，导致线虫种群和
群落结构的变化。如Ｃａｓｔｒｏ等发现钾（Ｋ＋）、铵态氮
（ＮＨ＋４）和硝态氮（ＮＯ
－
３）等无机离子能抑制南方根
接线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａ）二龄虫的生长［９］。另
３２０１
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
外，连作土壤引起的土壤微生物群落的变化也是关
键的因素。与短期连作相比，长期连作导致微生物
寄生到大豆胞囊线虫的数量更多［１０］。在一些土壤
中，食线虫菌物被毛孢（Ｈｉｒｓｕｔｅｌａｓｐｐ．）属的真菌寄
生被认为是主要原因，这些真菌更多地寄生在二龄
线虫上，抑制了土壤线虫病害的发生［１１］。也有人认
为，几种根瘤菌和未培养的变形细菌能抑制孢囊线
虫［１２］。近年的研究表明，健康土壤大豆根际微生物
具有控制胞囊线虫数量的作用［１０，１３］。目前，关于长
期连作影响线虫的研究，大多局限于对特定植物寄
生线虫种群如大豆胞囊线虫的影响，而从线虫群落
的角度去理解大豆连作的研究鲜见报道。在土壤生
态系统中，单个生物群体的存在是多种生物之间和
生物与非生物的环境因子之间相互作用的结果，因
而利用群落结构作为指标比用单个属或科更全面、
更可靠［１４］，因为这样能够更好地反映土壤生物间的
相互关系，更全面地了解土壤健康状况。
通常研究土壤线虫群落结构的方法是形态分
类，这需要具有分类经验的专业技术人员，而且在鉴
定上费时费工，很难在短期内获得结果［１５］。同时，
鉴定的结果往往是在属、科和营养类群的水平，使生
态分析往往比较模糊或表面化［１６］。形态分类的另
一个缺点是只能鉴定成虫标本，而成虫仅是全部线
虫群落的很小的一部分［１７］，不能全面反映土壤的线
虫状况。利用分子生物学方法的一个优点是不必分
离和培养线虫，仅通过设计引物就可以鉴定一个土
壤系统中的线虫群落。末端限制性片段长度多态性
分析（Ｔ－ＲＦＬＰ）已被证实是研究不同生境中线虫
群落的有效方法［１８－２１］。
本文利用Ｔ－ＲＦＬＰ和 ｑＰＣＲ技术，研究了长期
大豆连作根际土壤中线虫群落的结构和丰度的变
化，特别是比较短期连作和长期连作线虫群落的差
异。另外，通过相关性分析，确定引起土壤线虫群落
变化的主要驱动因子，有助于理解长期连作大豆土
壤线虫群落的变化规律。
１ 材料与方法
１１ 试验区概况
供试土壤样品采自于黑龙江省农科院土肥所长
期连作试验小区，该试验建于１９９６年，有１ １３年
的大豆连作小区。年平均降水５５０ｍｍ，８０％的降水
集中于６ ９月份，气温波动从 －１８℃（一月份）到
２３℃（六月份），年霜冻持续１６０天。
１２ 大豆品种
供试大豆材料为合丰２５号。选用的品种适应
性强，且茎秆坚韧、节间短小、结荚密实，因而它有适
应性强、高产和早熟等优良特性。目前，合丰２５号
是黑龙江省主要的种植品种。２００９年４月，开始种
植大豆，播种密度为每平方米３０颗种子，每个样地
包括１０行（长×宽为１５ｍ×０６７ｍ），按当地推荐
的施肥量施用底肥（Ｎ５０ｋｇ／ｈｍ２、Ｐ４５ｋｇ／ｈｍ２和Ｋ
５０ｋｇ／ｈｍ２）。
１３ 土壤样品采集与制备
在试验田采用“Ｚ”形设点，于 ２００９年 ９月 １２
日大豆成熟期取样，选取种植大豆１、２、３、６、９、１１和
１３年的试验小区，收获３０株大豆，连根拔起植株。
用抖根法采集根际土，即抖动植株至土壤不再下落，
粘在根系的即为根际土壤。土壤样品含水量为（１６
±３）％。根际土壤过２ｍｍ筛，去除植物组织和土
壤杂质。采集的样品放于冰盒中运回实验室，
－２０℃保存。
测定土壤样品中的总氮（Ｎ）、有机质（ＳＯＭ）、铵
态氮（ＮＨ＋４）、硝态氮（ＮＯ
－
３）、交换性钾（ＥＫ）、有效
磷（ＡＰ）和 ｐＨ［２２］，类黄酮总量、大豆苷元和染料木
素测定用超高效液相色谱（ＵＰＬＣ）［２３－２４］，土壤理化
性质及类黄酮总量、大豆苷元和染料木素含量见
表１。
１４ 土壤总ＤＮＡ的提取和ＰＣＲ扩增
１４１土壤总ＤＮＡ的提取 本实验的土壤 ＤＮＡ提
取采用ＦａｓｔＤＮＡＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ试剂盒（Ｂｉｏ１０１，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。提取出来的土壤基因组 ＤＮＡ
在－２０℃冰箱中保存、备用。ＤＮＡ通过１％的琼脂
糖凝胶电泳后，用ＤＮＡｇｒｅｅｎ染色，成像系统拍照。
１４２ＰＣＲ扩增和纯化 线虫扩增引物对为
ＮＥＭＦ１（５′－ＣＧＣＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴＣ－３′）和
Ｓ３（５′－ＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＧＣＣＧＣＡＧ－３′）［１８］。进
行Ｔ－ＲＦＬＰ分析时，引物 ＮＥＭＦ１５＇端用６－羧基荧
光素（ＦＡＭ）标记。
ＰＣＲ反应体系（５０μＬ）含 ＤＮＡ模板 １μＬ，
ＥａｓｙＴａｑ缓冲液 ５μＬ，ｄＮＴＰｓ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，
ＮＥＭＦ１（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０６μＬ，Ｓ３（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０６
μＬ，Ｅａｓｙｔａｑ聚合酶（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）（全氏金）０６μＬ，
双蒸水（ｄｄＨ２Ｏ）３８２μＬ。
ＰＣＲ扩增条件为９４℃预变性５ｍｉｎ，３５个循环：
９４℃变性 １ｍｉｎ，５３℃引物退火 ４５ｓ，７２℃延伸 １
ｍｉｎ。最后７２℃末端延伸 １０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物 ３μＬ
用１％琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收型试剂
４２０１
４期 王进闯，等：大豆连作土壤线虫群落结构的影响
盒（天根生化科技（北京）有限公司）对 ＰＣＲ产物纯
化，－２０℃保存。
１５ Ｔ－ＲＦＬＰ分析
在３μＬＰＣＲ产物中，加入０６μＬＴａｑⅠ限制性
内切酶（Ｔａｋａｒａ），２μＬ缓冲液，最后用 ｄｄＨ２Ｏ补足
到反应总体积１０μＬ。６５℃，遮光酶切３ｈ。酶切产
物用乙醇沉淀法纯化，纯化产物用锡箔纸包裹，在
－２０℃下保存。在１μＬ酶切纯化产物中加入８８
μＬ甲酰胺，０２μＬＲｏｘ１０００内标（ＢｉｏｖｅｎｔｕｒｅｓＩｎｔ．，
美国），共１０μＬ混合液，然后加到９６孔板，要避免
产生气泡，否则可能损坏遗传分析仪。在９５℃变性
３ｍｉｎ，然后迅速移到冰上冷却３ｍｉｎ。在 ＡＢＩ３１３０
自动测序仪上检测时，电压为２５００Ｖ，电流４０Ｍａ，
功率２７Ｗ。末端带荧光标记的片段能被自动检测
到，而其它没有带荧光标记的片断检测不到。用
ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒＳｏｆｔｗａｒｅｖ１０分析 Ｔ－ＲＦＬＰ图谱，然
后将末端限制性片段（Ｔ－ＲＦ）＞５０ｂｐ的峰高计
算不同片段的相对丰度。
表１ 大豆连作根际土壤性质、类黄酮、大豆苷元和染料木素含量
Ｔａｂｌｅ１ Ｓｏｉｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ，ｄａｉｄｚｅｉｎａｎｄｇｅｎｉｓｔｅｉｎｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌ
ｏｖｅｒｙｅａｒｓｏｆｍｏｎｏｃｒｏｐｐｉｎｇ
连作年限
Ｃｒｏｐｐｉｎｇｙｅａｒｓ
铵态氮
ＮＨ＋４Ｎ
（μｇ／ｇ）
硝态氮
ＮＯ－３Ｎ
（μｇ／ｇ）
有机质
Ｏｒｇａｎｉｃｍａｔｅｒ
（ｇ／ｋｇ）
总氮
ＴｏｔａｌＮ
（ｇ／ｋｇ）
交换性钾
ＥｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅＫ
（ｍｇ／ｋｇ）
１ ７７±３０ｃ ３９８±６６ａ ２７５±１４ｂｃ １４±００１ａ １６５３±４０ｂ
２ １０３±０５ｂｃ １４５±１６ｂ ２５０±０６ｄ １３±００２ｂ １８１７±６９ａ
３ ９１±１５ｂｃ １３０±１２ｂ ２５８±１３ｃｄ １２±００１ｃ １６７３±５９ｂ
６ １３７±１０ａｂ ６５±０５ｃ ２９２±０４ａｂ １４±００８ａ １８７７±１６８ａ
９ １７９±１０ａ １３８±１４ｂ ２８４±１２ｂ １３±００９ｂ １７３８±１８３ａｂ
１１ １４７±１１ｂｃ １４４±０３ｂ ３０３±０５ａ １４±００４ａ １５６１±４１ｃ
１３ ６７±０７ｃ １５８±１４ｂ ２９０±０７ａｂ １４±００２ａ １５９．４±５２ｂｃ
连作年限
Ｃｒｏｐｐｉｎｇｙｅａｒｓ
可利用性磷
ＡｖａｉｌａｂｌｅＰ
（ｍｇ／ｋｇ）
ｐＨ
类黄酮
Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ
（μｇ／ｇ）
大豆苷元
Ｄａｉｄｚｅｉｎ
（μｇ／ｇ）
染料木因
Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ
（μｇ／ｇ）
１ ７６５±１２２ａｂ ５２７±００６ｂｃ ２６１３±２４２ｂ ０４１±０１ｃ ０４６±０１ｄ
２ ８８７±１６２ａ ５２５±０１１ｃ １９３８±８２ｄ ０５６±０１ｂ ０４１±００ｅ
３ ７４０±１１５ａｂ ５３２±０１０ｂｃ ２００３±１９３ｃ ０２８±０１ｆ ０４４±０１ｄ
６ ５９２±６４ｂ ５４６±００８ａｂ ３３７０±４８ａ ０６９±００ａ １１８±０１ａ
９ ６２０±５０ｂ ５２９±００６ｂｃ ２７６２±３９２ｂ ０３９±０１ｄ ０６１±００ｃ
１１ ７６６±３６ａｂ ５５４±００９ａ ３３９７±１８７ａ ０４３±００ｃ ０６７±０２ｂ
１３ ５９５±３６ｂ ５５４±０１７ａ ２８１５±１７３ｂ ０３３±００ｅ ０６２±０１ｃ
注（Ｎｏｔｅ）：同列数据是平均值加标准误Ｄａｔｅａｒｅｍｅａｎｓ±ＳＤ（ｎ＝３）．不同的字母表示在 Ｐ＜００５水平上年份间存在显著差异 Ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｌｅｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｙｅａｒｓａｔＰ＜００５ｌｅｖｅｌ．数据来源于Ｇｕｏ等［２２］和Ｗａｎｇ等［２３］ＤａｔａａｒｅａｄａｐｔｅｄｆｒｏｍＧｕｏｅｔａｌ．［２２］
ａｎｄＷａｎｇｅｔａｌ．［２３］．
１６ 克隆及测序分析
用与 Ｔ－ＲＦＬＰ序列相同但不带荧光标记的引
物进行ＰＣＲ扩增，扩增条件也与 Ｔ－ＲＦＬＰ的相同。
以ＰＣＲ产物进行切胶回收纯化。纯化产物采用
ｐＭＤ１９－ＴＶｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）试剂盒连接到载体上，转
化感受态细胞（Ｔａｋａｒａ），涂布到含有氨苄青霉素
（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）、Ｘ－Ｇａｌ和 ＩＰＴＧ的 ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）
培养基上，３７℃过夜培养，约１２ｈ，形成单菌落。随
机选取１７０个白色克隆子，采用菌体直接扩增，检测
到的阳性克隆送往测序公司进行测序，测序引物为
Ｍ１３－４７。先用ＣｌｕｓｔａｌＸ软件对所得序列去除载体
序列［２５］，然后利用 ＲＤＰⅡ在线数据库（ｈｔｐ：／／
ｗｄｃｍ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ＲＤＰ／ｃｇｉｓ／ｃｈｉｍｅｒａ．ｃｇｉ？ｓｕ＝ＳＳＵ）
去除 ＰＣＲ扩增过程中产生的嵌合体。然后用
ＣｌｕｓｔａｌＸ和 Ｍｅｇａ５０软件分析比对，采用邻接法
（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统发育树。
５２０１
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
１７ 实时荧光定量ＰＣＲ
利用实时荧光定量 ＰＣＲ，采用绝对定量的方法
确定线虫群落的大小。用阳性克隆质粒绘制线虫基
因的定量ＰＣＲ标准曲线。引物为ＮＥＭＦ１／ＮＥＭ８９６ｒ
（５′－ＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＭＡＣＧ－３′）。
实验采用ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒
（ＡＢＩ），在７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）仪器上
进行。实时荧光定量 ＰＣＲ２５μＬ反应体系为：１２５
μＬＳＹＢＲＧｒｅｅｎ；引物各 １μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），５μＬ
ｄｄＨ２Ｏ，０５μＬＢＳＡ（０１％），模板ＤＮＡ５μＬ。反应
程序为：５０℃ ２ｍｉｎ，启动ｄＵＴＰ防止非特异性扩增；
９５℃ １０ｍｉｎ，激活热启动酶；然后４５个循环的 ＰＣＲ
反应：９４℃变性１ｍｉｎ，５３℃引物退火４５ｓ，７２℃延伸
１ｍｉｎ，７２℃收集荧光信号，最后做溶解曲线。根据
标准曲线，用７５００ｓｙｓｔｅｍＳＤＳＳｏｆｔｗａｒｅ（ＡＢＩ）分析定
量结果。
１８ 数据处理
利用Ｍｅｎｔａｌｔｅｓｔ确定环境因子对线虫群落的影
响。布雷柯蒂斯（ＢｒａｙＣｕｒｔｉｓ）距离用来进行非度量
多维尺度分析（ＮＭＤＳ），分析群落的变化。Ｍｅｎｔａｌ
ｔｅｓｔ和ＮＭＤＳ均在Ｒ软件 ｖｅｇａｎ软件包中进行。方
差分析和相关性分析在ＳＰＳＳ１７软件中进行。
２ 结果与分析
２１ 线虫群落结构
线虫的物种丰富度随着连作年限的增加呈逐渐
降低的趋势。第１年物种丰富度最高，为 １２，第 ３
年的丰富度显著低于第１年（Ｐ＜００５），之后逐渐
降低，连作９年后达到最小值，为５（图１）。
Ｔ－ＲＦＬＰ图谱显示，线虫群落结构在连作期间
发生了变化（图２）。大豆根际土中共检测到１６个
末端限制性片段（Ｔ－ＲＦ），包括：６２ｂｐ、７３ｂｐ、７４ｂｐ、
７５ｂｐ、４１６ｂｐ、４１８ｂｐ、５２２ｂｐ、５４９ｂｐ、５５３ｂｐ、５５５
ｂｐ、５５６ｂｐ、５５７ｂｐ、５５８ｂｐ、５５９ｂｐ、５６０ｂｐ、５６２ｂｐ。
其中７４ｂｐ、７５ｂｐ、５５５ｂｐ、５５６ｂｐ、５５７ｂｐ、５５８ｂｐ、
５５９ｂｐ、５６０ｂｐ、５６２ｂｐ为主要片断，其余片断相对
丰度均小于５％，且加和小于１１％（图２）。线虫群
落在不同连作年限中相对丰度最高的 Ｔ－ＲＦ均为
５５６ｂｐ，且随连作年限增加呈波动性变化。Ｔ－ＲＦ
５５６ｂｐ第１年的相对丰度为８６％，然后分别下降到
第２年和第 ３年的 ４９％和 ４１％，在第 ６、９、１１、１３
年，Ｔ－ＲＦ５５６相对丰度又分别增加到６１％、９０％、
７５％和７８％。Ｔ－ＲＦ５５５在第１年没有检测到，但
在第２年和第 ３年的相对丰度分别高达 １５％和
图１ 长期连作大豆根际土壤线虫群落
的物种丰富度变化
Ｆｉｇ．１ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｐｅｃｉｅｓｒｉｃｈｎｅｓｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｌｏｎｇｔｅｒｍｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ
［注（Ｎｏｔｅ）：数据是平均值加标准误 Ｄａｔｅａｒｅｍｅａｎｓ±ＳＤ（ｎ＝
３）．方柱上不同字母表示在Ｐ＜００５水平存在显著差异Ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｌｅｔｅｒｓａｂｏｖｅｂａｒｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｅｒｅｎｔａｔＰ＜００５ｌｅｖｅｌ
（ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＤｕｎｃａｎ’ｓｎｅｗｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｎｇｅｔｅｓｔｓ）．］
１９％，然后下降到第６年的７％和第９年的２％，后
两年维持在６％和５％。Ｔ－ＲＦ５５７第１年的相对
丰度为 ３％，在第 ２和第 ３年分别增加到 ７％和
１１％，之后，维持在３％ ４％。Ｔ－ＲＦ７４从第１年
的０６％分别增加到第 ２、３和 ６年的 ２％、８％和
１２％，然后分别降到第９、１１和１３年的１％、８％和
１０％。Ｔ－ＲＦ５６２和５５８只有前两年能检测到，并
且第２年的相对丰度都比第１年的高。Ｔ－ＲＦ５５９
先从第１年的２％增加到第２年的５％和第３年的
９％，然后在第６年下降到３％，之后没有检测出。Ｔ
－ＲＦ５６０从第１年的２％增加到第２年的８％，在从
第６年到第１３年期间只有第１１年检测到３％的相
对丰度（图２）。
２２ 线虫群落组成与环境的关系
Ｔ－ＲＦＬＰ分析中的大多 Ｔ－ＲＦ能从克隆文库
中鉴定（图３）。在大豆根际土中，线虫群落由茎线
虫属（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ对应４１６ｂｐ和５５６ｂｐ）、真滑刃属
（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ对应 ５５３ｂｐ）、拟丽突属（Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ
对应 ６２ｂｐ、７４ｂｐ、５５６ｂｐ和 ５５７ｂｐ）、针属
（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ对应 ４１８ｂｐ、５４９ｂｐ、５５５ｂｐ和 ５５８
ｂｐ）、盘旋属（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ对应 ５６２ｂｐ）、孢囊属
（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ对应 ５５９ｂｐ和 ５６０ｂｐ）、中小杆属
（Ｍｅｓｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ对应 ７３ｂｐ、７５ｂｐ和 ５２２ｂｐ）组成。
线虫群落主要分成植食性线虫、食细菌线虫和食真
菌线虫，没有检测到杂食性线虫（图３）。
６２０１
４期 王进闯，等：大豆连作土壤线虫群落结构的影响
图２ 长期大豆连作线虫群落的结构和组成
（基于线虫基因的Ｔ－ＲＦＬＰ分析）
Ｆｉｇ．２ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｎｅｍａｔｏｄｅ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｌｏｎｇｔｅｒｍｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎ
ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅＴ－ＲＦＬＰａｎａｌｙｓｉｓ
图３ 线虫克隆文库系统发育树
Ｆｉｇ．３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｎｅｍａｔｏｄｅｃｌｏｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＮＭＤＳ分析显示，第１年线虫群落与其余年限分开，
而第２和第３年聚集较近，后面第９、１１和１３年聚
集较近（图４）。说明短期连作导致了群落的明显变
化，随着连作年限的增加，线虫群落进一步分化，暗
示了连作时间对线虫群落结构并没有恢复。Ｍａｎｔｅｌ
ｔｅｓｔ分析显示环境与线虫群落之间存在显著的关系
（相关系数 ｒ＝０３６８，Ｐ＜０００１），暗示了环境条件
对于群落的变化起到了部分的作用。线虫群落结构
与ｐＨ、土壤有机质（ＳＯＭ）、速效磷（ＡＰ）、细菌数量
和真菌数量相关（图４）。
２３ 定量分析
随着连作年限的增加，线虫丰度逐渐增加，在第
６年达到最高值，然后又开始下降（图５）。线虫的
基因拷贝数与土壤 ＮＨ＋４ 和染料木因（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）浓
度呈显著正相关，而与ＮＯ－３ 和细菌的基因拷贝数呈
显著负相关（图６）。
３ 讨论
在长期连作情况下，会出现由致病土壤向抑病
土壤的转化。例如，许多地方的研究表明持续连作
使土壤出现自然抑制病原线虫的现象［５］。欧洲的
７２０１
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
图４ ＮＭＤＳ分析长期大豆连作的线虫群落结构
与环境的关系
Ｆｉｇ．４ Ｎｏｎｍｅｔｒｉｃｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｃａｌｉｎｇ（ＮＭＤＳ）
ｐｌｏｔｓｓｈｏｗｉｎｇｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｒｏｍｔｈｅｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍ
［注（Ｎｏｔｅ）：ＢＡ—细菌丰度；ＦＡ—真菌丰度；ＡＰ—速效磷；ＳＯＭ—
土壤有机质．］
图５ 长期大豆连作线虫的基因拷贝数变化
Ｆｉｇ．５ Ｇｅｎｅｃｏｐｉｅｓｏｆｓｏｉｌｎｅｍａｔｏｄｅｉｎｔｈｅ
ｌｏｎｇｔｅｒｍｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ
［注（Ｎｏｔｅ）：数据是平均值加标准误Ｄａｔｅａｒｅｍｅａｎｓ±ＳＤ（ｎ＝３）．
不同字母表示在 Ｐ＜００５水平年份间存在显著差异 Ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｌｅｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｙｅａｒｓａｔＰ＜００５
ｌｅｖｅｌ（ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＤｕｎｃａｎ’ｓｎｅｗｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｎｇｅｔｅｓｔｓ）．］
荞麦连作减少了胞囊线虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａａｖｅｎａｅ）种群
的密度［２６］。在我国东北地区，大豆连作前５年，胞
囊线虫数量每２５０ｇ土增加到３５１个，之后开始下
降，并在连作１４年后降到２６０个［６］。
本研究结果表明，不同连作年限大豆土壤线虫
种类数量和群落结构都发生了不同程度的变化。在
种植大豆第１年，５５６ｂｐ为优势营养类群，其对应着
自由生活线虫类群（图２和３）。说明了在大豆第１
年自由生活线虫参与的土壤功能能够正常发挥，促
进有机质分解和养分周转速率，有利于增加养分的
释放并提高植物对土壤养分的利用［２７］。在连作 ２
年后，５５６ｂｐ相对丰度减少，５５５ｂｐ、５５８ｂｐ、５５９ｂｐ、
５６０ｂｐ和５６２ｂｐ的相对丰度增加，这些Ｔ－ＲＦ片段
对 应 着 孢 囊 线 虫 （Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）、盘 旋 线 虫
（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）和针属线虫（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）等植食性
线虫（图３），说明在２年连作后，植食性线虫增加，
大豆易于受到线虫的危害。而且在大豆自毒作用等
其他因素的影响下，连作大豆会出现发育不良，致使
线虫侵染机会增加［２８］。寄生线虫对植株同化物、氮
素和其它养分的大量消耗，使植物根系受到伤害，生
长受阻［２８］。此外，大豆幼苗的生长不良更容易引起
病原微生物的侵染及植食线虫的侵染［２８］。值得注
意的是，第３年连作后，线虫的物种丰富度减少，５６０
ｂｐ和５６２ｂｐ对应的植食性线虫没有检测到，而５５５
ｂｐ和５５９ｂｐ对应的植食性线虫相对丰度增加，植食
性线虫仍然保持着高的相对丰度。可能说明线虫群
落内存在种间竞争，而且不同生物间的相互作用，使
得一些物种数量降低或者在微生物的作用下减少了
线虫的种类［２９］。大豆短期连作减少了土壤食物网
中捕食微生物线虫的数量，引起了根际土壤微生态
系统破坏的这种现象，也发生在香蕉和苹果连作
上［１，３０］。然而，随着连作年限的增加，物种的丰富度
进一步减少，５５６ｂｐ对应的捕微生物线虫、５５７ｂｐ
和７４ｂｐ对应的拟丽突属（Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ）的食细菌线
虫增加，而植食性线虫相对丰度减少（图１ 图３）。
说明在连作超过６年后，线虫以捕微生物线虫为主，
可能使病害减轻，但是群落种类数量减少，线虫群落
趋于简化。这可能主要是因为在连作６年后，有益
微生物对包括植物寄生线虫在内的病原生物产生抑
制作用，从而有利于植物根系和植株生长转好［３１］。
根系的良好发育，可能为细菌的生长创造了条件，一
些机 会 主 义 的 食 细 菌 线 虫 （Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ和
Ｍｅｓｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）数量增多，与植食性线虫竞争，减少了
植食性线虫的数量［３２］。
土壤线虫群落的变化并不是偶然的，其消长通
常受土壤理化性质和微生物的影响［３３］。本研究发
现，线虫群落结构受有机质、有效磷和 ｐＨ值的影
响，而且细菌和真菌的数量也影响着线虫结构（图
４）。土壤有机质是影响土壤线虫分布的重要因
素［３４］。土壤有机质为土壤微生物提供了能源，因此
增加了微生物的活性和生物量。一些食细菌线虫的
增加可能是由于微生物生物量增加引起［３５］。另外，
土壤ｐＨ降低通常减少了细菌生物量而有利于真菌
８２０１
４期 王进闯，等：大豆连作土壤线虫群落结构的影响
图６ 长期大豆连作土壤中线虫群落基因拷贝数和环境因子的关系
Ｆｉｇ．６ Ｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｇｅｎｅｃｏｐｉｅｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｌｏｎｇｔｅｒｍｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ
生物量，这样的变化能够反映在捕食微生物的线虫
群落变化上［３６－３７］。番茄连作过程中，ｐＨ值与垫刃
科（Ｔｙｌｅｎｃｈｉｄａｅ）线虫数量呈正相关，还有一些滑刃
线虫（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓｓｐｐ）对 ｐＨ值具有较强的忍耐
性［３２］，说明不同的线虫种类对 ｐＨ值的响应存在差
异，可能引起群落变化。土壤磷含量高能增加线虫
的丰度，特别是食细菌线虫数量，改变了食真菌和食
细菌线虫数量［３７］。王邵军等［３８］发现，柳杉根际的
速效磷与垫刃线虫（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｓｐｌａｔｙｃｅｐｈａｌｕｓ）及居尾
滑刃线虫（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）数量正相关，
而与厄萨拉斯螺旋线虫（Ｈｅｌｉｃｏｔｖｌｅｎｃｈｕｓｘａｌｕｓ）和双
宫螺旋线虫（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓｄｉｈｙｓｔｅｒａ）无关。这些结
果说明连作引起的土壤性质的改变引起了土壤线虫
群落的分化。另外，细菌和真菌是捕食微生物的食
物来源，微生物的数量对线虫群落结构的调节也十
分明显［３３］。
随着连作年限的增加，线虫群落基因拷贝数逐
渐增加，并在第６年达到最高值，然后逐渐减少（图
５）。第２ ３年线虫数量的增加可能与植食性线虫
的数量增加有关。陈宏宇发现，在连作５ ６年内
大豆胞囊线虫数量呈逐年增加的趋势［６］。我们的
研究发现在第６年，细菌和真菌的数量都很少［３９］，
但线虫群落基因拷贝数达到了最大值。这可能是由
于食微生物线虫对土壤微生物量响应的滞后性引
起。有研究发现，线虫数量往往是在土壤中细菌减
少几个月后才减少［４０］。在连作９ １３年期间，线
虫数量减少，一方面可能由于减少了植食性线虫数
量［６］，另一方面可能是细菌和真菌的数量处在一个
较低的水平，不能提供充分的食物。
线虫丰度的变化与 ＮＨ＋４、ＮＯ
－
３、根系分泌的染
料木因和细菌丰度有关（图６）。线虫丰度与 ＮＨ＋４
呈正相关。ＳａｎｃｈｅｚＭｏｒｅｎｏ等也发现，在不同的耕
作模式下，中小杆线虫属（Ｍｅｓｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）和拟丽突属
（Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ）与ＮＨ＋４ 呈正相关，可能增加了Ｎ的矿
化［３３］。细菌丰度和线虫丰度的负相关说明捕食压
力可能影响着总的细菌群落。染料木因与线虫丰度
呈正相关。陈宏宇发现，盆栽的敏感大豆品种增加
了根际大豆胞囊线虫数量。这说明根际活动刺激了
线虫的生长和繁殖［６］。因此，植物的生理状况对线
虫的数量也产生影响。线虫丰度与ＮＯ－３ 呈负相关。
已有 研 究 表 明，食 真 菌 线 虫 滑 刃 线 虫 属
（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）与 ＮＯ－３ 具有相关性，ＮＯ
－
３ 能通过
影响食真菌线虫数量影响线虫的总数量［３３］。
本研究中并没有检测到捕食／杂食线虫
（Ｏｍｎｉｖｏｒｅｓｐｒｅｄａｔｏｒｓ）。这可能是由于研究方法的
差异。本研究主要研究根际土，而且 ＤＮＡ是从
９２０１
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
０５ｇ土壤中提取，不能全面地估计线虫分布。因
此，为了更全面研究线虫群落结构，需要经典分类和
分子技术相结合［４２］或从更多质量的土壤中提取
ＤＮＡ，再用高通量的测序方法进行群落结构
鉴定［４３］。
４ 结论
总之，大豆连作改变了线虫群落的结构和数量。
在连作早期，植物寄生线虫增加，可能是导致短期连
作大豆减产的重要原因，而在连作后期，植物寄生线
虫减少，减轻了对大豆的危害，但由于种群趋向单
一，产量不稳。线虫群落结构的变化主要受到土壤
有机质、ｐＨ值、速效磷、细菌和真菌数量影响。随着
连作年限增加，线虫基因拷贝数呈先增后降的趋势，
最高值出现在第６年。线虫的丰度与 ＮＨ＋４ 和染料
木因呈正相关，与细菌的数量和ＮＯ－３ 呈负相关。本
研究有利于深入理解大豆连作障碍和长期连作后形
成植物寄生线虫的抑病土壤的机制。
参 考 文 献：
［１］ 杨树泉，沈向，毛志泉，等．环渤海湾苹果产区老果园与连作果
园土壤线虫群落特征［Ｊ］．生态学报，２０１０，３０（１６）：４４４５
－４４５１
ＹａｎｇＳＱ，ＳｈｅｎＸ，ＭａｏＺＱｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｅｍａｔｏｄｅ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｓｏｉｌｏｆｌｏｎｇｓｔａｎｄｉｎｇｖｅｒｓｕｓｒｅｐｌａｎｔｅｄａｐｐｌｅ
ｏｒｃｈａｒｄｓｓｕｒｏｕｎｄｉｎｇＢｏｈａｉＧｕｌｆ［Ｊ］．ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，
２０１０，３０（１６）：４４４５－４４５１
［２］ 邵元虎，傅声雷．试论土壤线虫多样性在生态系中的作用
［Ｊ］．生物多样性，２００７，１５（２）：１１６－１２３
ＳｈａｏＹＨ，ＦｕＳＬ．Ｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｉｌｎｅｍａｔｏｄｅｓ
［Ｊ］．ＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅ，２００７，１５（２）：１１６－１２３
［３］ ＦｒｅｃｋｍａｎＤ Ｗ．Ｂａｃｔｅｒｉｖｏｒｏｕｓｎｅｍａｔｏｄｅｓａｎｄｏｒｇａｎｉｃｍａｔｅｒ
ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，
１９９８，２４（１－３）：１９５－２１７
［４］ ＭａｒａｍｕｎｅＴ，ＡｎｅｔａｉＭ，ＴａｋａｓｕｇｉＭｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｎａｔｕｒａｌ
ｈａｔｃｈｉｎｇｓｔｉｍｕｌｕｓ，ｇｌｙｃｉｎｏｅｃｌｅｐｉｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８２，２９７：４９５－
４９６
［５］ ＨａｌｂｒｅｎｄｔＪＭ．Ａｌｅｌｏｐａｔｈｙｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃ
ｎｅｍａｔｏｄｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９６，２８（１）：８－１４
［６］ 陈宏宇．不同品种和不同茬口大豆根面及根际的微生物群落
结构分析［Ｄ］．北京：中国农业大学博士学位论文，２００５
ＣｈｅｎＨ Ｙ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ ａｎｄ
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０３０１
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ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ：ｅｆｅｃｔｓｏｆｓｏｉｌ
ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｎｓｏｉｌｆｏｏｄｗｅｂｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６，
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［３４］ ＢｒｉａｒＳＳ，ＧｒｅｗａｌＰＳ，ＳｏｍａｓｅｋｈａｒＮｅｔａｌ．Ｓｏｉｌｎｅｍａｔｏｄｅ
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ｄｙｎａｍｉｃｓｉｎｆｉｅｌｄｐｌｏｔｓｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｇｆｒｏｍｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｔｏｏｒｇａｎｉｃ
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ｇｒａｓｓｌａｎｄｓ，ａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｔｈｏｄｓ［Ｄ］．
Ｉｒｅｌａｎｄ：ＰｈＤＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｒｅｌａｎｄ －
Ｇａｌｗａｙ，２０１２
［３８］ 王邵军，蔡秋锦，阮宏华．不同生境柳杉根际线虫群落的生
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ＷａｎｇＳＪ，ＣａｉＱＪ，ＲｕａｎＨＨ．Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ
ｎｅｍａｔｏｄｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｒｈｉｚｏｐｈｅｒｅｓｏｉｌａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｈａｂｉｔａｔｓｏｆ
Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｆｏｒｔｕｎｅ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｌｏｇｙ，２００８，２７
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农业大学博士学位论文，２０１４
ＷａｎｇＪＣ．Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓｏｙｂｅａｎｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｏｎｓｏｉｌ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ［Ｄ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＰｈＤＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，
ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１４
［４０］ ＰａｐａｔｈｅｏｄｏｒｏｕＥＭ，ＡｒｇｙｒｏｐｏｕｌｏｕＭ Ｄ，ＳｔａｍｏｕＧＰ．Ｔｈｅ
ｅｆｅｃｔｓｏｆｌａｒｇｅａｎｄｓｍａｌｓｃａｌｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｓｏｉｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄ
ｍｏｉｓｔｕｒｅｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉｖｏｒｏｕｓｎｅｍａｔｏｄｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＳｏｉｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，２５：
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［４１］ ＷａｒｄｌｅＤＡ，ＷｉｌｉａｍｓｏｎＷＭ，ＹｅａｔｅｓＧＷｅｔａｌ．Ｔｒｉｃｋｌｅｄｏｗｎ
ｅｆｅｃｔｓｏｆａｂｏｖｅｇｒｏｕｎｄｔｒｏｐｈｉｃｃａｓｃａｄｅｓｏｎｔｈｅｓｏｉｌｆｏｏｄｗｅｂ［Ｊ］．
Ｏｉｋｏｓ，２００５，１１１：３４８－３５８
［４２］ ＴａｍｕｒａＫ，ＰｅｔｅｒｓｏｎＤ，ＰｅｔｅｒｓｏｎＮｅｔａｌ．ＥＧＡ５：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄｍａｘｉｍｕｍｐａｒｓｉｍｏｎｙｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１１，２８：２７３１－２７３９
［４３］ ＦｌｏｙｄＲ，ＡｂｅｂｅＥ，ＰａｐｅｒｔＡｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｒｃｏｄｅｓｆｏｒｓｏｉｌ
ｎｅｍａｔｏｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２００２，１１：８３９
－８５０
１３０１