全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*$"!
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#
"&*#!(*"
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$
#"+,-"-
%
.
+/001+#"""*$"!+!"#$+"&+#!(
收稿日期$
!"#$*"%*#&
&修改稿收到日期$
!"#$*"-*#%
基金项目$国家自然科学基金"
%#%-"#(%
#&中央级公益性科研院所业务费专项资金"
2344##"!"#
#&海南省重大科技项目子课题热带生物
种质与基因资源研究"
5657!"#%"!%*#
#
作者简介$朱家红"
#(&!)
#!男!助理研究员!主要从事植物分子遗传学研究
8*9:/;
$
<
.
=<>#"#"
!
#-%+?@9
"
通信作者$张治礼!研究员!主要从事植物分子遗传学研究
8*9:/;
$
==;
(
?:A:0
!
<@A9:/;+?@9
巴西橡胶树
12134$
基因的克隆和表达分析
朱家红#!徐
!
靖!!畅文军#!张治礼!"
"
#
中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所!农业部热带生物技术重点开放实验室!海口
,##"#
&
!
海南省农业科学院!海
口
,##""
#
摘
!
要$根据
8B3
序列信息!通过
C3*DEC
获得了一个编码橡胶素前体的基因!命名为
!"!#$%

!"!#$%
编码
区
?6FG
长度为
-%"H
I
!编码
!"(
个氨基酸预测的
JHJ8K%
蛋白包含
#
个信号肽!
#
个具有几丁质结合特性的
JLML/1
结构域和
#
个
4:NO/11
结构域!
JHJ8K%
与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性分离获得
了
!"!#$%
起始密码子上游
#""H
I
的启动子序列!该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件实时荧光定量
DEC
分析结果表明!
!"!#$%
在所检测的组织中均有表达!其中在胶乳中的表达量最高!乙烯诱导能显著上调胶
乳中
!"!#$%
的表达研究表明!
!"!#$%
可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应!并在橡胶凝集过程中具有
重要功能
关键词$巴西橡胶树&橡胶素&基因表达&乙烯利
中图分类号$
P,&
&
P,&-
文献标志码$
G
%&"#
(
)!*+
,
-.//#"0)&
1
/#/"212134$3..2-"41)5)$2($6-*-)/6-6
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S
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S
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SW
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210A/A>AL@Y3N@
I
/?:;4/@0?/L1?L0:1[4/@AL?<1@;@
SW
!
E1L0LG?:[L9
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@Y3N@
I
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S
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W
@YG
S
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J:/\@>
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E#
05/6-)76
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SI
N@]
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W
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S
AI
!
L1?@[/1
S
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I
N@I
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!
<:[AWI
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I
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L
I
A/[L
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S
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W
L;L9L1A0NL;:AL[A@<@N9@1L:1[0ANL00NL*
0
I
@10L0OLNLY@>1[/1
I
N@9@ALNNL
S
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I
NL00L[/1:;
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!
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S
:10
!
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!"!#$%O:0:;0@/1[>?L[0/
S
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W
H
W
LAI
<@1+3;A00<@OL[A<:A!"!#$%9:
W
HL/1M@;ML[
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W
;L1L*9L[/:AL[[LYL10LNL0
I
@10L0:1[9:
WI
;:
W
:1/9
I
@NA:1AN@;L/1AI
N@?L00@Y;:AL` :
SS
NL
S
:A/@1+
8.
1
9"-!/
$
!%&%"()*+*%,)*)
&
&
S
L1LL`
I
NL00/@1
&
LAI
<@1
!!
植物凝集素是一类在植物界普遍存在的能够与
单糖或寡糖特异性可逆结合的蛋白质)#*许多证据
表明!植物凝集素在防御反应中扮演着重要的角色!
它们在植物的生长发育阶段以不同的方式参植物对
病原菌和捕食者侵害的免疫反应)!*$*根据植物凝
集素的氨基酸序列的同源性及其进化关系!凝集素
可分为豆科凝集素+单子叶植物甘露糖结合凝集素+
包含橡胶素"
#结构域的壳多糖结合蛋白+
!
型
核糖体失活蛋白+葫芦科韧皮部凝集素+木菠罗素
家族和苋科凝集素等
,
个蛋白质家族)*
巴西橡胶树靠分布于树体内的乳管系统产胶!
当割胶切断乳管时!胶乳随之流出胶乳中含有橡
胶粒子+黄色体和
_*U
复合体等特化的细胞器)-*
橡胶粒子凝固导致乳管堵塞是影响橡胶产量的重要
因子),*橡胶素是从橡胶树的胶乳中分离到的富含
半胱氨酸"
E
W
0
#和甘氨酸"
T;
W
#的小分子量单链蛋
白质)&*橡胶素是胶乳中黄色体内的主要蛋白质之
一!是引起橡胶粒子凝集的主要因子!同时橡胶素也
是一种凝集素!具有较强的抗菌活性)&*(*先前的研
究通过筛选乙烯利诱导的胶乳
BBJ
文库获得
#
条
编码
JLML/1
的
8B3
序列!本研究在此基础上对该
基因进行克隆!对其表达和调控特征进行分析!为深
入研究其在橡胶树中的生物学功能奠定基础
#
!
材料和方法
:+:
!
材
!
料
试验所用巴西橡胶树"
!%&%"()*+*%,)*)
#,热
研
,*%%*(,
-来自中国热带农业科学院试验场选取
-
年生的未开割树!用
#a
乙烯利进行诱导!处理方
法参考
J:@
等)#"*的方法进行!采集处理后
"
+
%
+
-
+
#!
+
!$
+
$&<
的胶乳迅速置于液氮中冷冻!
),"b
保
存!同时采集橡胶树树皮+树叶和花等不同组织于液
氮中迅速碾磨成粉末!
),"b
保存备用
:+;
!
方
!
法
:<;<:
!
核酸提取和
7=>0
合成
!
橡胶树胶乳总
CFG
提取参考张治礼等)##*的方法&其他组织
CFG
提取参照
V/LYLN
等)#!*的方法&叶片
6FG
提取参考
安泽伟等)#%*的方法&
?6FG
第一条链合成采用北京
全式金公司反转录试剂盒!具体步骤详见说明书
:<;<;
!
12134$
基因的克隆
!
用已获得的编码
JLML/1
的
8B3
序列在
FE42
数据库中搜索!将搜
索结果进行拼接!根据拼接结果设计特异引物
JH*
J8K%_
"
c*3TE3TGTEGG3T3TT3GTTEGG*
%c
#和
JHJ8K%C
"
c*EEEGG3T33G33GG33G*
G33GG3*%c
#对
!"!#$%
全长
?6FG
序列进行扩
增
DEC
扩增反应$
($b
预变性
%9/1
&
($b
变性
%"0
!
b
退火
%"0
!
,!b
延伸
%"0
!共
%
个循环&
最后
,!b
延伸
9/1

DEC
产物经回收和纯化后!
与
3
载体连接将连接产物转至
6J:
感受态细
胞!通过
DEC
检测确定阳性克隆!送北京诺赛基因
组研究中心有限公司测序
:<;<$
!
12134$
启动子区的克隆
!
用
TL1@9L
U:;\LN
试剂盒"
E;@1AL?<
#!根据
!"!#$%
的
c
端
序列设计特异引物
TBD#
"
c*EGEEGEEEG3GE3*
TTE3GEGGEG3GT*%c
#和
TBD!
"
c*TEEGEE3*
TE33TEE3GEEGEG3*%c
#!分别和人工接头引物
GD#
和
GD!
配对!以构建好的
TL1@9LU:;\LN
文
库为模板!对
!"!#$%
启动子区进行
!
轮
DEC
扩
增!具体参见试剂盒说明书目的条带经回收和纯
化后与
3
载体连!进行测序鉴定
:+;+?
!
生物信息学分析
!
用
C^_Y/1[LN
分析
?6*
FG
序列的开放阅读框!蛋白质序列分析在
I
$%%
OOO+L`
I
:0
W
+@N
S
网站用相关软件完成!用
6FG*
ZGF
软件进行多重序列比对!利用
DXGE8
在线软
件对
!"!#$%
启动子序列进行分析
:<;<@
!
12134$
表达分析
!
提取不同样品的
CFG
!进行反转录!以
#&B(-./
作为内参!采用康
为世纪公司的
Bd4CTNLL1C3*DEC 1^LBAL
I
V/A
及
Z` %""DDEC
仪进行基因表达水平检测用于
定量
DEC
的
!"!#$%
引物为
PJ8K%_
"
c*TTG*
EGEGTG3TTTGGGTTG3G3T*%c
#和
PJ8K%C
"
c*3TTGTGG3GTGTTT33TGGTTG*%c
#$内参
引物为
P#&B_
"
c*TE3ETGGTGETG3EGTG3*
GEE*%c
#和
P#&BC
"
c*33EGTEE33TETGEEG3*
GE*%c
#具体反应体系为$模板
"+
"
X
!上下游引
物混合物
#
"
X
!
eBd4CDNL9/` #"
"
X
!用水补足
!"
"
X
&
DEC
程序为
(b
预变性
%"0
!
(b
变性
#"
0
!
-"b
退火
%"0
!
,!b
延伸
%"0
!
$"
个循环
!
!
结果与分析
;<:
!
12134$
的克隆和序列分析
将已获得编码
JLML/1
的
8B3
序列!作为种子
序列在巴西橡胶树
8B3
数据库中进行
4;:0A
搜索!
将获得的同源序列和已有的
8B3
序列进行拼接!获
得
#
条
(!$H
I
的
?6FG
的序列!利用
FE42
的
C^_
_/1[LN
分析该序列包含
#
个完整的
C^_
根据拼
接结果设计特异引物对基因的编码区进行扩增!测
序结果和拼接结果完全一致将获得基因命名为
!"!#$%
!该基因编码区
?6FG
长度为
-%"H
I
!编
码蛋白由
!"(
个氨基酸组成
预测的
JHJ8K%
蛋白分子量
!!+%&\6
!理论
等电点
&+#!

JHJ8K%
具有典型的植物
JLML/1
"%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
蛋白结构特征!包含
#
个
!#
个氨基酸组成的信号
肽!
#
个具有几丁质结合特性的
JLML/1
结构域和
#
个
4:NO/11
结构域"图
#
#
JHJ8K%
与橡胶树中
已有的
JLML/1
蛋白
J8K#
+
J8K#+#
+
J8K#+!
+
J8K!+#
和
J8K!+!
的相似性分别为
&!a
+
&$a
+
&(a
+
&%a
和
&a
&
JHJ8K%
的
F
末端比橡胶树中
已有的
JLML/1
蛋白多出
$
个氨基酸残基!经进一步
分析发现橡胶树中已有的

个
JL;M/1
基因
G3T
前
#!H
I
处均含有
G3T
起始密码子!且
G3T
之后的序
列具有连续的阅读框!所以现有的橡胶树中的

个
JLML/1
蛋白序列并不完整!
F
末端缺失了
$
个氨基酸
残基"图
#
!
G
#
JHJ8K%
与蓖麻"
-*0*,1)023314
,*)
#+毛果杨"
52
6
1+1)7(*0820(
6

#+桑树"
92(1),274
"*+*)
#和鹰嘴豆"
:*0%((*%7*,13
#中相应蛋白的相似性
分别为
&-a
+
&#a
+
,,a
和
,#a
"图
#
!
4
#
;<;
!
12134$
启动子的克隆和序列分析
利用
TL1@9LU:;\/1
S
方法!通过
!
轮
DEC
获
得
!"!#$%
起始密码子上游
#""H
I
的启动子序
列利用
D;:1AEGC8
在线软件对启动子序列进行
分析!发现该序列具有真核生物典型启动子结构特
征"图
!
#!除了含有多个
3G3G*H@`
和
EGG3*H@`
等基本元件外!还含有众多应答激素和胁迫信号元
件!如赤霉素响应元件
TGC8
+生长素响应元件
G>`CC*?@NL
和
3TG*L;L9L1A
+脱落酸响应元件
G4C8
+水杨酸应答元件
3EG*L;L9L1A
+乙烯响应元
件
TEE*H@`
+真菌响应元件
4@`*U#
+厌氧应答元件
GC8
+低温应答元件+防御和胁迫应答元件
3E*N/?<
NL
I
L:A0
等!这表明
!"!#$%
可能参与多种激素和
胁迫响应过程
;<$
!
12134$
的表达分析
利用荧光定量
DEC
检测了
!"!#$%
在不同
组织中表达情况!结果"图
%
#显示
!"!#$%
在胶乳
中的表达量最高!在叶片和树皮总的表达量相对较
低!在花中几乎检测不到!这说明其在胶乳中可能具
有某种重要的功能乙烯利刺激后!胶乳中
!"4
!#$%
的表达量
-<
内无明显变化!处理
#!<
后表
达量显著上调并达到最大!随后逐渐降低
%
!
讨
!
论
排胶是影响天然橡胶产量的重要因素!胶乳的
停排是由于乳管割口处胶乳絮凝堵塞而引起的目
前就乳管堵塞的机制提出了一些假说!其中凝集素
假说是当前较被广泛接受的一种假说),!#$*该假说
认为橡胶素在乳管堵塞中起到核心作用!并证实橡
胶素是一种典型的凝集素!它能够与橡胶粒子膜上
的糖蛋白结合!促进橡胶粒子凝集橡胶素是以前
体形式表达!
4N@L\:LNA
等在胶乳中克隆了编码橡胶
素前体的
?6FG
!该橡胶素前体蛋白的
F
端区域包
含
#
个信号肽和
#
个几丁质结合结构域)#*前体
蛋白在向黄色体转移的过程中其信号肽被切除!余
下的多肽最终被加工成成熟
JLML/1
和未知功能的
多肽)#-*
D>
.
:[L*CL1:>[
等)#,*在橡胶树中报道了
另外
$
个编码橡胶素前体的基因和启动子序列!这
$
个基因的编码区同源性较高!更大的差异体现在
启动子区!并认为
JLML/1
基因上游调节功能的进化
比下游蛋白产物功能的进化要快很多
图
#
!
JHJ8K%
与橡胶树"
G
#及其他植物"
4
#中
JLML/1
蛋白的序列比对
_/
S
+#
!
BL
]
>L1?L:;/
S
19L1AHLAOLL1JHJ8K%:1[JLML/1
I
N@AL/10YN@9N>HHLNANLL
"
G
#
:1[@AI
;:1A0
"
4
#
#%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
朱家红!等$巴西橡胶树
!"!#$%
基因的克隆和表达分析
图
!
!
!"!#$%
启动子序列及主要顺式作用元件
_/
S
+!
!
3I
N@9@ALN0L
]
>L1?L@Y!"!#$%:1[9:
.
@N0*)*:?A/1
S
L;L9L1A0
图
%
!
!"!#$%
的表达
G+!"!#$%
在橡胶树叶"
X8
#+皮"
4G
#+花"
_X
#和胶乳"
XG
#中的表达&
4+!"!#$%
在乙烯利刺激条件下的表达
_/
S
+%
!
8`
I
NL00/@1@Y!"!#$%
G+8`
I
NL00/@1@Y!"!#$%/1;L:Y
"
X8
#!
H:N"
4G
#!
Y;@OLN
"
_X
#
:1[;:AL`
"
XG
#&
4+8`
I
NL00/@1@Y!"!#$%O/AI
<@1ANL:A9L1A
!!
本研究在橡胶树中分离了
#
个新的
JLML/1
基
因
!"!#$%
!
JHJ8K%
蛋白序列和橡胶树中已有
的

个
JLML/1
蛋白具有类似的结构特征!序列同源
性都在
&"a
以上!说明他们可能具有类似的功能
橡胶素已证实除了在橡胶粒子凝集过程中具有作用
外!还具有抗真菌的性质),*&*
!"!#$%
的启动子
区存在
!
个真菌响应元件
4@`*U#
和
#
个防御和胁
迫应答元件
3E*N/?I
L:A0
!这进一步说明
!"4
!#$%
可能参与了真菌响应过程此外!在
!"4
!#$%
的启动子区发现
#
个乙烯响应元件
TEE*
H@`
!表达分析也证实
!"!#$%
受乙烯利诱导表
达!表明
!"!#$%
参与了橡胶树对乙烯的响应
乙烯是植物防御反应的报警信号!并参与防御反应&
乙烯能够诱导许多病程相关蛋白和抗菌肽的表达和
积累)#&*#(*这说明
!"!#$%
可能参与了橡胶树乙
烯介导的防御反应乙烯利是目前最有效的橡胶树
胶乳增产刺激剂!其增产效应主要通过延长排胶时
间来实现)!"*橡胶树胶乳中除了含有橡胶素凝集
因子外!还含有几丁质酶等抗凝集因子!乙烯利刺激
同样能诱导抗凝集因子几丁质酶基因都超量表
达),!(!#*这说明在乙烯利刺激延长排胶延长时间
的情况下!抗凝集因子的效果可能更显著!但乙烯利
在延长排胶时间阻止凝集的同时为何诱导凝集因子
的表达!是否存在反馈调控还有待进一步研究本
!%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
研究对
!"!#$%
进行了克隆!并对其表达和调控
特征进行了分析!研究结果不仅丰富了
JLML/1
蛋白
家族的基因信息!同时为进一步研究其在橡胶树中
的功能奠定了基础
参考文献!
)
#
*
!
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