全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 495-499(2013)
收稿日期: 2012-09-14; 修回日期: 2013-06-28
基金项目: 现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-26-13); NSFC-河南人才培养联合基金项目(U1204319)
通讯作者: 王振跃,副教授,研究方向为植物病害监测与防控; E-mail: wzy. 01@163. com
孙 虎,副研究员,主要从事植物病理学研究; E-mail: clearshu167@163. com
第一作者: 施 艳,女,江苏太仓人,讲师,从事植物病毒学研究; E-mail: shiyan00925@126. com。
瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌
中的表达及抗血清的制备
施 艳1, 袁 媛1, 孙 虎2*, 古勤生3, 刘珊珊3, 王振跃1*
( 1河南农业大学植物保护学院, 郑州 450002; 2河南省农业科学院植物保护所, 郑州 450002;
3 中国农业科学院郑州果树所, 郑州 450009)
摘要:根据已报道的瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列设计引
物,利用 RT-PCR方法从感病甜瓜中扩增得到长度为 753 bp的 CP 基因,将其克隆到原核表达载体 pGEX-4T-3 上,获得重
组载体 pGexCP,在大肠杆菌 BL21 菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经 IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌 BL21 中得到
了高效表达。 以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了 CCYV外壳蛋白的特异性抗血清。 ACP-ELISA检测结果表明,当 CP
蛋白浓度为 2. 5 μg / mL时,血清效价高达 5. 12 ×105。 Western blot分析表明制备的抗体检测 CCYV侵染的甜瓜叶片得到
特异性的条带,表明该抗体的特异性较好。 ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甜瓜病样的检测。 本试验
为 CCYV的快速检测提供了重要的研究材料。
关键词:瓜类褪绿黄化病毒; 外壳蛋白基因; 原核表达; 抗血清
Expression of coat protein gene of Cucurbit chlorotic yellows virus in E. coli and
preparation of antiserum　 SHI Yan1, YUAN Yuan1, SUN Hu2, GU Qin-sheng3, LIU Shan-shan3,
WANG Zhen-yue1 　 ( 1 College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Plant Pro-
tection Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 3 Zhengzhou Fruit Research Institute,
Chinese Academy of Agriculture Sciences, Zhengzhou 450009, China)
Abstract: Primers were designed according to the published nucleotide sequence for amplifying the CP gene by
RT-PCR. CP gene was cloned into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 and the recombinant plasmid,
named as pGexCP, was transformed into Escherichia coli BL21. SDS-PAGE analyses showed that specific fu-
sion protein was efficiently expressed by IPTG induction. The expressed protein was purified as antigen and the
antiserum against the protein was raised in rabbit. The titer of antiserum was 5. 12 × 105 estimated by ACP-
ELISA. Western blot confirmed the detection specificity by polyclonal antiserum with diseased leaf. The results
suggested that the antiserum could be applied for detection of field samples. This experiment laid the foundation
for field detection of CCYV.
Keywords: Cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV); coat protein gene; prokaryotic expression; antiserum
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)05-0495-05
　 　 瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows
virus, CCYV)属于长线性病毒科(Closteroviridae)
毛形病毒属(Crinivirus)。 病毒颗粒为长线形,基
因组是由 RNA1(8 607 nt)和 RNA2(8 041 nt)组
　
植物病理学报 43 卷
成。 该病毒所致典型的症状为叶片出现褪绿,开始
呈现黄化后,仍能观察到保持绿色的组织,直至全
叶黄化;叶脉不黄化,仍为绿色;通常中下部叶片先
感染,向上发展,新叶常无症状。 CCYV 在黄瓜
(Cucumis sativus)和甜瓜(Cucumis melon)叶片上
引起典型的褪绿黄化症状。 此外,它还能系统侵染
西瓜、丝瓜、南瓜等瓜类植物以及甜菜、昆诺藜、曼
陀罗和本生烟等非瓜类植物,靠烟粉虱(Bemisia
tabaci)以半持久方式传播[1]。
日本最先报道 CCYV 的发生[2],随后在中国
台湾的甜瓜、黄瓜和西瓜等瓜类作物上也发现了该
病 [3],并且通过分子生物学和生物学鉴定,明确毒
原为 CCYV的不同分离物。 2008 年在我国上海地
区的瓜类大棚里首次观察到系统褪绿黄化症状,
2009 年 10 月底在上海、浙江宁波和山东寿光开始
大面积出现这种症状,病害发生率在 50% ~
100% ,危害严重,通过实地采样检测分析发现与日
本报道的 CCYV的序列同源性在 99. 7% ~ 100% ,
确定该病害毒原为 CCYV[4]。 2011 年在河南郑州
温室大棚中也发现该病害大面积发生。 国际上黎
巴嫩和苏丹地区也发现该病害的为害,与日本分离
物 CP基因的同源性在 99% ~ 100% [5, 6],说明该
病毒不同地区分离物的 CP基因相对保守。
作为一种新发现的病毒,有必要探索对该病毒
有效的检测技术,为该病毒的防控和功能研究奠定
基础。 本试验利用 RT-PCR 方法克隆了 CCYV 河
南分离物的 CP基因序列,构建原核表达载体,在大
肠杆菌中高效表达该病毒的 CP 并制备特异性抗
体,可用于该病毒的血清学检测,以利于快速检测该
病害的发生和分布,为病害的防治提供重要依据。
1　 材料与方法
1. 1　 菌株、质粒和病原材料
大肠杆菌菌株 DH5ɑ、BL21 和原核表达载体
pGEX-4T-3 由本实验室保存。 病原材料采自河南
农业大学科教园区甜瓜试验地,甜瓜叶片表现
CCYV侵染的典型症状,下部叶片黄化,上部叶片
褪绿的症状。 三亚和宁波的甜瓜样品由古勤生研
究员实验室提供。
1. 2　 酶及试剂
IPTG、氨苄青霉素(Amp)、丙烯酰胺、三羟甲
基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨
酸等均购自上海生工生物工程有限公司。 限制性
内切酶、 T4 DNA 连接酶、反转录试剂盒购自
TaKaRa公司。 辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG
为 Sigma产品。 其他常用试剂为国产分析纯。
1. 3　 引物设计
根据 NCBI 登录的 CCYV CP 基因序列
(HM581658),利用软件 Primer Premier 5. 0 设计扩
增全 长 基 因 的 引 物 ( CCYV-CP-BamH Ⅰ-F:
5′-GAC GGATCCATGGAGAAGACTGACAAT-3′;
CCYV-CP-Sal Ⅰ-R: 5′-GTCGTCGACTTATTTAC-
TACAACCTCC-3′),下划线表示相应酶切位点,引
物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1. 4　 CP基因原核表达载体的构建
采集田间发病的甜瓜叶片,根据 Trizol ( In-
vitrogen)说明书提取感病叶片的总 RNA,利用
Takara 公司的反转录试剂盒进行反转录,PCR 扩
增 CP基因,PCR反应体系为:94℃ 3 min; 94℃ 30
s,56℃ 30 s, 72℃ 40 s,35 个循环;72℃ 10 min。
将获得的 PCR 产物通过 PCR 回收试剂盒回收纯
化,经 BamH I和 Sal I双酶切,再与经同样酶切处
理的载体 pGEX-4T-3 连接,转化大肠杆菌 DH5α,
碱裂解法提取质粒,通过菌液 PCR鉴定阳性克隆。
1. 5　 CP基因的诱导表达和 SDS-PAGE分析
将含有重组原核表达载体的 BL21 于 37℃过
夜培养,按 1: 100 稀释到 100 mL LB培养基中(含
Amp 60 μg / mL),振荡培养至对数生长中期,加入
IPTG至终浓度为 1 mmol / L,过夜培养,离心收集
菌体,每 50 mL 菌液加入 5 mLddH2O 和 1 mL 样
品缓冲液 [40 mmol / L Tris-HC1(pH 6. 8)、10%甘
油、5% SDS、5%巯基乙醇、0. 1%溴酚蓝],煮沸 10
min,离心后取上清,用 12% 的分离胶进行 SDS-
PAGE分析。
1. 6　 抗血清制备及其效价测定
参照 Hager等[7]的方法回收表达产物,表达产
物经 12%的 SDS-PAGE 电泳后,将凝胶用预冷的
0. 25 mmol / L KC1, l mmol / L DTT 溶液浸泡 5
min,重蒸水冲洗,切下含目的条带的凝胶,按 1∶ 1
比例(w / v)加入 PBS 缓冲液(0. 14 mol / L NaC1、
694
　
　 5 期 　 　 施 艳,等:瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备
2. 7 mmol / L KC1、 1. 5 mmol / L KH2PO4、 8. 1
mmol / L Na2HPO4),于冰浴中研磨。 用 PBS 缓冲
液适当稀释后,加入等体积的福氏不完全佐剂
(1． 5 g羊毛脂 +8 mL 石蜡油)进行乳化。 采用肌
肉注射的方法免疫家兔,共免疫 5 次,每次免疫
0． 5 mg,免疫家兔的工作由郑州博赛生物技术公
司协助完成。
以纯化的蛋白 (2. 5 μg / mL)作为抗原包被
ELISA 板,将抗血清进行一系列倍比稀释后作为
一抗,辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗,用
ACP-ELISA测定抗血清的效价[8]。
1. 7　 蛋白免疫印迹(Western blotting)分析
提取感病和健康甜瓜叶片蛋白,测定样品蛋白
浓度为 500 μg / mL,取 20 μL上样于 5%的浓缩胶
和 12%的分离胶进行 SDS-PAGE 电泳,电泳结束
后转移到 PVDF膜上,加 500 倍稀释的兔抗血清杂
交,随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG
(1: 5000 稀释) [9],在增强型 HRP-DAB 底物显色
试剂盒中显色至条带清晰。
1. 8　 多克隆抗体的初步应用
利用制备的 CCYV CP 抗血清,对采自郑州、
宁波和三亚的甜瓜病样进行检测。 取甜瓜叶片用
PBST缓冲液按 1: 10(w / v)用量研磨,离心后取上
清进行 ACP-ELISA检测。 用健康甜瓜幼苗的汁液
作为阴性对照。 抗血清工作浓度为 1 ∶ 500。 扣除
空白值后按列示计算: P, 样品平均吸光值;N, 阴
性对照平均吸光值。 P / N >2 为阳性。
2　 结果
2. 1　 CCYV CP基因原核表达载体的构建
以感病的甜瓜叶片的总 RNA 为模板,经反转
录和 PCR扩增,得到一特异性片段,长度为 753 bp
(图 1)。 将扩增出的特异性片段克隆到 pGEX-4T-
3 载体,菌液 PCR 验证,将阳性克隆送去测序,获
得重组质粒 pGexCP,CP 基因的长度为 753 nt,编
码 250 个氨基酸残基组成的 27 kDa蛋白。
2. 2　 表达产物的 SDS-PAGE分析和蛋白纯化
将 pGexCP 转入大肠杆菌 BL21 中,经 IPTG
诱导后,样品经 SDS-PAGE 分离,可产生约 54 kDa
的特异蛋白质条带(图 2),与预期的大小相符,未
经诱导的菌株和空载体则没有相应的条带,说明
CCYV CP 基因得到了诱导表达,切胶回收蛋白,研
磨纯化,回收的蛋白纯度高,没有其他杂带(图 3)。
Fig. 1 　 RT-PCR amplification of CCYV CP
gene
Lane 1: DNA marker DL2 000; Lane 2: PCR products.
Fig. 2 　 SDS-PAGE analysis of expression
products of pGexCP
Lane 1: pGexCP induced with IPTG; Lane 2: pGexCP with-
out induction; Lane 3: pGEX-4T-3 induced with IPTG; Lane
4: pGEX-4T-3 without induction; Lane 5: Protein marker.
794
　
植物病理学报 43 卷
Table 1　 Titer detection of pGexCP antiserum by ACP-ELISA
Dilution of
antiserum( 103)
1∶ 1 1∶ 2 1∶ 4 1∶ 8 1∶ 16 1∶ 32 1∶ 64 1∶ 128 1∶ 256 1∶ 512
Negative
control
OD405 value 1. 898 1. 815 1. 787 1. 702 1. 682 1. 519 1. 100 0. 691 0. 405 0. 269 0. 089
Detection result + + + + + + + + + + 一
Fig. 3　 SDS-PAGE analysis of purified protein
Lane 1: Protein marker; Lane 2: Purified protein.
2. 4　 抗血清制备及效价测定
利用回收的特异性表达的 54 kDa 蛋白免疫家
兔, 5 次免疫后 10 d 取血获得 CCYV CP 的抗血
请。 以纯化的蛋白为抗原,进行 ACP-ELISA检测,
结果表明抗血清稀释 5. 12 × 105 倍后仍能明显检
测出(表 1)。
2. 5　 Western Blot分析
以制备的 CP兔抗血清为一抗,辣根过氧化酶
标记的羊抗兔 IgG为二抗进行 Western 印迹分析。
结果表明,制备的抗体能与发病叶片总蛋白发生特
异性反应,显影后在 27 kDa 处有一明显条带(图
4),证明所制备的抗体特异性很强。
Fig. 4　 Western blot analysis of the specifici-
ty of anti-CP serum
Lane 1: Diseased leaves; Lane 2: Healthy leaves.
2. 6　 抗血清的初步应用
利用制备的抗血清,对采自宁波和郑州的甜瓜
样品进行 ACP-ELISA检测。 以健康甜瓜叶片为阴
性对照。 结果表明制备的抗血清 1∶ 500 稀释后与
采自宁波和郑州的样品呈阳性反应,说明制备的抗
血清可以应用到 CCYV的田间检测。
3　 讨论
CCYV作为一种新发现的病毒,寄主范围较
广,能够引起瓜类作物严重损失,研究其编码蛋白
的功能将有助于利用基因工程手段来防止该病毒
对寄主植物的侵害,减少经济损失[10]。 同时寻求
一种快速便捷的鉴定方法对于病毒的防控具有重
要的指导意义。 CCYV 的病毒粒子主要存在于维
管束中[11],病毒含量低,因此,很难通过提纯病毒
粒子的方法来获得足够免疫动物的病毒粒子。 已
有报道通过细菌原核表达成功获得毛型病毒属南
瓜黄色矮化失调病毒(Cucurbit yellow stunting dis-
order virus, CYSDV)的 CP的抗血清[12 ~ 14]。 鉴于
此,本研究通过原核表达制备 CCYV CP 的抗血
清。
自 Okuda等 2010 年首次从日本瓜类作物上发
现 CCYV[2],我国的宁波、上海和河南等地区的甜
瓜样品上也先后检测到该病毒的存在,说明 CCYV
在我国分布范围逐渐扩大,这可能是由于 CCYV
的传播介体烟粉虱的扩散造成的,CCYV目前的研
究发现只能通过烟粉虱进行半持久性传播。 目前
对于该病的防治措施是控制传毒介体,建立高效、
简便的病毒检测技术是重要环节。 本研究在大肠
杆菌中高效表达了 CCYV 的外壳蛋白,以表达产
物作为抗原,大量制备抗血清,为感病植物和带毒
介体的检测奠定了基础。
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责任编辑:张宗英
994