全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$青藏高原甘肃甘南社区生态畜牧业关键技术集成与模式示范"
!"#!"%"#"
#&甘肃牧区优质饲草生产技术研究与示范
"
!"#""%"!%
#&牧草种质资源保护与利用"
23!#%"#%*
#&国家牧草产业技术体系专项"
4567)%*
#
作者简介$李玉珠"
#(,(
#!女!博士!讲师!主要从事牧草和草坪草种质资源保护与育种的研究
8)9:/;
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0:?+@A?+B1
"
通信作者$师尚礼!博士!教授!主要从事牧草和草坪草育种与栽培的研究
8)9:/;
$
0C/0C;
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0:?+@A?+B1
杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选
李玉珠!师尚礼"
"甘肃农业大学 草业学院!草业生态系统教育部重点实验室!甘肃省草业工程实验室!中美草地畜牧业可持续发展研究中心!兰
州
,%"","
#
摘
!
要$以杂花苜蓿(甘农
#
号)和紫花苜蓿(甘农
$
号)*(阿尔冈金)及(清水)
$
个适宜西北内陆黄土高原地区栽培
的苜蓿愈伤组织为材料!研究酶解时间*酶液组合*酶液渗透压*愈伤组织继代培养时间*预处理措施及不同培养方
法等对原生质体分离和培养效果的影响!并对培养条件进行优化结果表明$"
#
#适宜
$
个苜蓿品种愈伤组织酶解
的最佳预处理措施为
"+**9D;
%
E
蔗糖或
4FG
溶液中预质壁分离
#C
!最佳继代时间均为
#!A
"
!
#(甘农
#
号)*
(甘农
$
号)和(清水)的最佳酶液组合均为
!H
纤维素酶
I"+*H
果胶酶
I"+%H
崩溃酶&(阿尔冈金)的最佳酶液组
合为
!H
纤维素酶
I"+*H
果胶酶
I"+%H
半纤维素酶
I"+%H
离析酶
I"+%H
崩溃酶&(甘农
#
号)和(阿尔冈金)的
最佳酶解时间为
#!C
!(甘农
$
号)和(清水)分别为
#$C
和
#"C
"
%
#适宜
$
个品种酶解的甘露醇浓度分别为(甘农
#
号)
"+,*9D;
%
E
!(甘农
$
号)
"+-*9D;
%
E
!(阿尔冈金)
"+-9D;
%
E
!(清水)
"+**
"
"+-9D;
%
E
"
$
#经液体浅层培养
和固液培养方式均可获得
$
个苜蓿品种的再生愈伤组织!且固液培养法较液体浅层培养法更有利于苜蓿原生质体
早期的培养和再生
关键词$苜蓿&原生质体&酶解&培养
中图分类号$
J&#%+#
文献标志码$
5
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-
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B?;P?O@
!!
苜蓿是世界上栽培最早*种植最广*利用最多的
饲草苜蓿是美国第四大栽培作物!仅次于玉米*小
麦与大豆!种植面积超过
#"""
万
C9
!
+
#
,
中国栽
培苜蓿已有
!"""
多年的历史!现种植面积达
#%%
万
C9
!
+
!
,
作为当今农业生产的重要组成部分!苜
蓿不仅是中国发展有机畜牧业的一大经济作物!而
且也是生态环境治理的先锋草种+%,对其遗传性状
的改良除了常规育种和基因工程的手段外!在细胞
水平上进行的种内及远缘种间的体细胞杂交技术发
挥着独特而重要的作用分离和培养高质量的原生
质体是进行体细胞杂交的先决条件!因此开展有关
苜蓿原生质体酶解培养条件的研究对苜蓿体细胞杂
交的成败具有重要意义
#(-"
年!
4DB\/1
>
用酶法制备高等植物原生质
体首获成功+$,
#(,#
年!
W:\@U@
首次从离体烟草
原生质体培养中获得再生植株+*,
*"
多年来!已有
近
*"
科的植物原生质体培养获得了再生植株+-,
豆科牧草中!苜蓿原生质体培养是最早也是最多的
至今已有紫花苜蓿"
!"#$%&

(+&,$)&E+
#
+
,)#%
,
*木本
苜蓿"
!"#$%&

(&*-(*"&E+
#
+
#$
,
*南苜蓿"
!"#$%&

(
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#
+
#*
,
*野 生 黄 花 苜 蓿 "
!"#$%&

(
0
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#
+
#-
,
*天蓝苜蓿"
!"#$%&

(12
/
21$3&
E+
#
+
#,
,
*杂花苜蓿"
!"#$%&

()&*$& V:OP
<
1+
#
+
#&
,等
材料进行过原生质体培养的研究而有关适宜西北
内陆地区栽种的耐寒型苜蓿品种的报道偏少此
外!分离苜蓿原生质体的材料以下胚轴+#*!#(,*子
叶+,!#&,*叶片+()#"!#!)#%!#-!",及幼根+,)&!#$,等居多!鲜见
以愈伤组织为分离材料的本实验拟选用
$
个适宜
西北内陆黄土高原地区栽种的紫花和杂花苜蓿品
种!通过对影响其原生质体分离和培养效果的主要
因素进行探讨!建立这
$
个抗寒型苜蓿愈伤组织原
生质体的分离和培养体系!为苜蓿品种间及远缘种
间的体细胞杂交技术奠定基础!为实现苜蓿的品质
改良与种质创新提供理论依据
#
!
材料和方法
8+8
!
试验材料
$
个苜蓿种质分别为抗寒性强*在寒冷地区产
草量高的杂花苜蓿(甘农
#
号)"
!"#$%&

()&*$&
V:OP/1+BS+
(
Q:11D1
>
#
)#&适宜西北内陆灌区栽培
的紫花苜蓿(甘农
$
号)"
!4+&,$)&E+BS+
(
Q:11D1
>
$
)#&在中国东北*华北和西北已广泛种植!抗逆性
强*产草量高的紫花苜蓿(阿尔冈金)"
!4+&,$)&E+
BS+
(
5;
>
D1
Z
?/1
)#&适宜中国甘肃海拔
##""
"
!-""
9
半湿润*半干旱区种植!可作为刈割草地或水土保
持利用的紫花苜蓿野生栽培品种(清水)"
!4+&,$)&
E+BS+
(
J/1
>
0C?/
)#种子均由甘肃农业大学提供
8+9
!
胚性愈伤组织的获得
分别将各品种无菌苗下胚轴"约
"+*B9
长#及
子叶"约
"+*99
宽#接种于相应的愈伤诱导培养基
上!通过
!
"
%
月的继代!将愈伤组织质量调整为质
地疏松*结构致密的淡黄色或淡绿色的稳定状态!用
于原生质体的酶解
8+:
!
原生质体的分离和纯化
将
#
>
左右胚性愈伤组织放入装有约
#"9E
混
合酶液的三角瓶"
*"9E
#中!在"
!*]#
#
^
黑暗条件
下!
%"
"
*"O
%
9/1
的摇床上震荡经过一定时间的
酶解!取酶解材料分别经
#""
*
$""
目无菌尼龙网筛
过滤!除去未酶解完全的组织和细胞团!滤液经
#""
_
>
离心
#"
"
#!9/1
收集原生质体收集到的原
生质体用
4FG)#"
酶溶剂悬浮!再离心!重复
#
"
!
次最后用原生质体培养液洗涤
#
次!得到纯化的
原生质体
酶溶剂
4FG
"
B@;:1A
X
ODPD
X
;:0PY:0C/1
>
0D;?)
P/D1
#包括
!,+!9
>
%
ETM
!
F`
$
*
#"#+"9
>
%
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%
*
#$&"+"9
>
%
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!
-
!M
!
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*
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>
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$
-
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*
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*
"+"!*9
>
%
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$
-
*M
!
`
*
*+"99D;
%
EV87
+
!
!"
2)9D
X
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#
@PC:1@0?;ND1/B
:B/A
,*
"+**9D;
%
E
甘露醇!
X
M*+&
!经
"+$*
#
9
微孔
滤膜过滤灭菌
8+;
!
酶解时间!酶液组合!渗透压稳定剂浓度!预处
理条件及继代培养天数的确定
选择继代培养后第
#!
天*状态一致*未经预处
理的苜蓿愈伤组织!在渗透压稳定剂为
"+**9D;
%
E
的
#
号酶液组合下"酶液组合见表
#
#!分别酶解
$
*
-
*
&
*
#"
*
#!
*
#$
和
#-C
!测定原生质体的产量和活
力!确定最佳酶解时间
选择继代后培养第
#!
天*状态一致*未经预处
理的愈伤组织!在渗透压稳定剂为
"+**9D;
%
E
的
*
种酶液组合下!采用上述确定的最佳酶解时间酶解!
*&#
#
期
!!!!!!!!!!!!
李玉珠!等$杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选
测定原生质体的产量和活力!确定最佳酶液组合
以甘露醇作为渗透压调节稳定剂!将继代后培
养第
#!
天*状态一致*未经预处理的愈伤组织!分别
放入甘露醇质量浓度为
"+$"
*
"+$*
*
"+*"
*
"+**
*
"+-"
*
"+-*
*
"+,"
*
"+,*
和
"+&"9D;
%
E
最佳酶液组
合中!采用确定的最佳酶解时间酶解!测定原生质体
的产量和活力!确定最佳的渗透压浓度
将继代后培养第
#!
天*状态一致的愈伤组织在
酶解前分别采取
$
种预处理措施"表
!
#!以培养条
件相同的愈伤组织为对照"
4T
#在已确定的最佳
酶解条件下酶解!测定原生质体的产量和活力!确定
最佳的预处理措施选择状态一致的愈伤组织更换
到新的继代培养基!分别培养
$
*
-
*
&
*
#"
*
#!
*
#$
和
#-A
后!在已确定的最佳酶解条件下酶解!测定原
生质体的产量和活力!确定最佳的继代培养时间
8+<
!
原生质体的培养
将经洗涤的原生质体重新悬浮于液体培养基
中!调整密度为每升
"+*_#"
*
"
!+"_#"
* 个吸取
!
"
%9E
悬浮液于直径为
-"99
的培养皿中!在
"
!*]#
#
^
黑暗条件下分别进行液体浅层静置培养
和固液双层培养第
,
和
#$
天时更换甘露醇浓度
依次减半的新鲜培养基!定期观察原生质体的分裂
情况!记录培养结果待形成肉眼可见的小愈伤组
织!将培养物转入
V7
固体培养基中!置于
#!C
光
照*
#!C
黑暗条件下培养原生质体液体培养基采
用
TV
&
F
"
T:D:1AV/BC:
<
;?#培养基!附加相应的
激素组合*
#""9
>
%
E
水解酪蛋白*
#""9
>
%
E
水解乳
蛋白*
#H
蔗糖*
"+$9D;
%
E
甘露醇!
X
M*+&
!经
"+!!
#
9
微孔滤膜过滤灭菌固液培养时先在培养皿底
部浅铺
#
层含相同激素浓度的
V7
固体培养基!再
将悬浮于液体培养基中的原生质体滴于其上即可
8+=
!
原生质体产量和活力的测定及统计分析
利用血球计数板在倒置显微镜下观察计数!酶
解一定时间后!统计原生质体的产量!重复
$
"
*
次
同时采用荧光素双醋酸酯"
N;?DO@0B@/1A/:B@P:P@
!
ab5
#法在荧光显微镜下对原生质体存活率"活力#
进行染色鉴定!随机选取
*
"
-
个视野统计原生质体
的数量计算公式如下+!#,$
#9E
悬浮液中的原生质体数
c#
个大方格悬
浮液"
+#99
%
!即
"+#
#
E
#中的细胞数
_#"_#"""
原生质体产量"个%
>
#
c
原生质体密度"个%
9E
#
_
原生质体悬浮液总体积"
9E
#%材料总质量"
>
#
原生质体活力
c
"有活力的原生质体数%原生质
体总数#
_#""H
用
7F77#-+"
统计软件对结果进行方差分析和
b?1B:1
多重比较
!
!
结果与分析
9+8
!
酶解时间对杂花和紫花苜蓿原生质体分离效
果的影响
确定适宜的酶解时间是分离高质量原生质体的
前提由图
#
和图
!
可知!
$
个苜蓿品种酶解
$
"
#-
C
后!(甘农
#
号)和(阿尔冈金)在酶解
#!C
时原生
质体的产量和活力均达最高值!分别为
#+*-_#"
-
表
8
!
酶液处理组合
W:U;@#
!
4D9U/1:P/D1DN@1=
<
9@0D;?P/D1
酶液处理编号
4DA@DN@1=
<
9@0D;?P/D1
纤维素酶
4@;?;:0@D1D=?\:6)#"
%
H
果胶酶
F@BP/1:0@L)!%
%
H
半纤维素酶
M@9/B@;?;D0@
%
H
离析酶
V:B@OD=
<
9@
%
H
崩溃酶
bO/0@;:0@
%
H
# ! "+*
! ! "+* "+%
% ! "+* "+%
$ ! "+* "+%
* ! "+* "+% "+% "+%
表
9
!
预处理措施
W:U;@!
!
b/NN@O@1P
X
O@PO@:P9@1P0
处理
WO@:P9@1P
处理条件
WO@:P9@1PBD1A/P/D10
4T
对照
4D1POD;
$
预低温处理"
$^
!生长
#A
#
FO@PO@:P9@1PDN;DYP@9
X
@O:P?O@
"
B?;P?O@DN$^NDO#A
#
%
预质壁分离"
+**9D;
%
E
!蔗糖溶液中处理
#C
#
FO@
X
;:09D;
<
0/0
"
0D;?P/D1Y/PC"+**9D;
%
E0?
>
:ONDO#C
#
&
预质壁分离"
+**9D;
%
E4FG
溶液中处理
#C
#
FO@
X
;:09D;
<
0/0
"
0D;?P/D1Y/PC"+**9D;
%
E4FGNDO#C
#

预暗培养"黑暗下培养
#A
#
FO@)B?;P?O@/1A:O\1@00NDO#A
-&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
不同酶解时间处理下
$
个苜蓿品种原生质体的产量
图中不同小写字母表示每个品种内各处理间的差异显著性"
5
#
"+"*
#&下同
a/
>
+#
!
WC@
<
/@;ADN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P@1=
<
9D;
<
0/0P/9@0
3:O0Y/PCA/NN@O@1P;@PP@O0:O@0/
>
1/N/B:1P;
<
A/NN@O@1P:PPC@"+"*;@S@;?1A@OA/NN@O@1PBD1POD;0NDO$S:O/@P/@0
&
WC@0:9@:0U@;DY
图
!
!
不同酶解时间处理下
$
个苜蓿品种原生质体的活力
a/
>
+!
!
WC@S/:U/;/P
<
DN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0
DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P@1=
<
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<
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个%
>
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,,+-H
&
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- 个%
>
和
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(甘农
$
号)酶解
#$C
时产量和活力均达峰值!为
#+,$_#"
-
个%
>
和
&,+,H
(清水)原生质体在酶解
#"C
产量
和活力最高!为
"+(&_#"
- 个%
>
和
("+!H
!酶解时
间大于
#"C
!产量和活力逐渐下降
因此!(甘农
#
号)*(甘农
$
号)*(阿尔冈金)和
(清水)原生质体的最佳酶解时间分别是
#!C
*
#$C
*
#!C
和
#"C

9+9
!
酶液组合对杂花和紫花苜蓿原生质体分离效
果的影响
采用适宜的酶种类及浓度组合是获得高质量原
生质体的保障由图
%
和图
$
可知!(甘农
#
号)原
生质体产量在
*
号酶液处理下最高!为
#+($_#"
-
个%
>
!最高活力出现在
$
号酶液处理!为
,$+&H
!考
虑到酶制剂的成本!
$
号处理更为经济(甘农
$
号)和(清水)最高产量均出现在
$
号酶液处理!分别
为
!+$&_#"
-个%
>
和
#+&(_#"
-个%
>
!与其他处理
图
%
!
不同酶液组合处理下
$
个苜蓿品种原生质体的产量
a/
>
+%
!
WC@
<
/@;ADN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0DN
:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P@1=
<
9@BD9U/1:P/D10
图
$
!
不同酶液组合处理下
$
个苜蓿品种原生质体的活力
a/
>
+$
!
WC@S/:U/;/P
<
DN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0
DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P@1=
<
9@BD9U/1:P/D10
差异显著"
5
#
"+"*
#!活力达到
,,+"H
和
,&+&H

(阿尔冈金)原生质体的最高产量和活力均出现在
*
号酶液处理"
!+"(_#"
- 个%
>
!
,!+-H
#!说明
"+%H
,&#
#
期
!!!!!!!!!!!!
李玉珠!等$杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选
水平的半纤维素酶和离析酶的添加有助于其原生质
体的游离
因此!适宜
$
个品种原生质体分离的最佳酶液
组合分别是(甘农
#
号)*(甘农
$
号)和(清水)为
$
号酶液!(阿尔冈金)为
*
号酶液
9+:
!
渗透压稳定剂浓度对杂花和紫花苜蓿原生质
体分离效果的影响
分离原生质体时!添加适宜浓度的渗透压稳定
剂对原生质体的产出和稳定具有重要意义+!",如
图
*
和图
-
所示!随着甘露醇浓度的增加!
$
个品种
原生质体产量均呈先增加后降低的趋势甘露醇浓
度为
"+,*
*
"+-*
和
"+-9D;
%
E
时!(甘农
#
号)*(甘
农
$
号)和(阿尔冈金)原生质体的产量和活力分别
达最高值甘露醇浓度为
"+**9D;
%
E
时!(清水)的
产量最高!为
#+-#_#"
- 个%
>
&
"+-9D;
%
E
时!活力
最大!达
(%+#H
因此!适于
$
个品种原生质体分
离的最佳甘露醇浓度分别为(甘农
#
号)
"+,*9D;
%
E
!(甘农
$
号)
"+-*9D;
%
E
!(阿尔冈金)
"+-9D;
%
E
!
(清水)
"+**
"
"+-9D;
%
E

9+;
!
预处理条件对杂花和紫花苜蓿苜蓿原生质体
分离效果的影响
酶解前对材料进行预处理!可改变细胞和细胞
壁的生理状态!减少原生质体损失+!!,本研究中!
不同的预处理措施对苜蓿酶解效果的影响见表
%

图
-
!
不同甘露醇浓度处理下
$
个苜蓿品种原生质体的活力
a/
>
+-
!
WC@S/:U/;/P
<
DN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0
DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P9:11/PD;BD1B@1PO:P/D10
图
*
!
不同甘露醇浓度处理下
$
个苜蓿品种原生质体的产量
a/
>
+*
!
WC@
<
/@;ADN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P9:11/PD;BD1B@1PO:P/D10
表
:
!
不同预处理条件下
;
个苜蓿品种原生质体产量及活力
W:U;@%
!
WC@
<
/@;A:1AS/:U/;/P
<
DN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0DN:;N:;N:Y/PCS:O/D?0
X
O@PO@:P9@1PBD1A/P/D10
预处理
FO@)
PO@:P9@1P
原生质体产量
L/@;ADN
X
ODPD
X
;:0P
"
_#"
-
#
甘农
#
号
Q:11D1
>
#
甘农
$
号
Q:11D1
>
$
阿尔冈金
5;
>
D1
Z
?/1
清水
J/1
>
0C?/
原生质体活力
d/:U/;/P
<
DN
X
ODPD
X
;:0P0
%
H
甘农
#
号
Q:11D1
>
#
甘农
$
号
Q:11D1
>
$
阿尔冈金
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清水
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注$表中不同大写字母表示每个品种内各处理间的差异显著性"
5
#
"+"#
#
2DP@
$
3:O0Y/PCA/NN@O@1P;@PP@O0:O@0/
>
1/N/B:1P;
<
A/NN@O@1P:PPC@"+"#;@S@;?1A@OA/NN@O@1PBD1POD;0DN$S:O/@P/@0+
&&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
,
!
不同愈伤组织继代时间处理下
$
个苜蓿品种原生质的产量
a/
>
+,
!
WC@
<
/@;ADN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P0?UB?;P?O@P/9@0
!!
如表
%
所示!
$
*
%
和
&
号预处理措施均可增加
$
个品种原生质体的产量和活力(甘农
#
号)在
%
号处理下产量最高!
&
号处理下活力最大!说明
!
种
预质壁分离措施均有利于其原生质体的产出(甘
农
$
号)原生质体产量在
$
号处理下最高!
%
号处理
下活力最大(阿尔冈金)和(清水)的产量和活力在
&
号处理下均最大!说明二者原生质体在酶解前置
于
"+**9D;
%
E4FG
溶液中处理
#C
可显著增强它
们的分离效果
综合考虑!适宜
$
个不同品种酶解的最佳预处
理措施分别为!(甘农
#
号)
"+**9D;
%
E
蔗糖或
4FG
溶液中处理
#C
!(甘农
$
号)预低温处理
#C
或
"+**9D;
%
E
蔗糖溶液中处理
#C
!(阿尔冈金)和
(清水)均为
"+**9D;
%
E4FG
溶液中处理
#C

9+<
!
继代培养天数对杂花和紫花苜蓿愈伤组织原
生质体分离的影响
外植体状态的优劣是决定原生质体培养和再生
能否成功的关键本研究中!如图
,
和图
&
所示!随
着继代天数的增加!
$
个品种原生质体的产量均呈
先增大后降低的趋势(甘农
#
号)愈伤组织继代第
#!
天酶解时!原生质体产量达最大值"
#+,"_#"
-
个%
>
#!此时活力值也较高!为
&&+,H
继代第
#!
天!(甘农
$
号)和(清水)原生质体产量和活力均达
最大值!分别为
#+(*_#"
- 个%
>
*
&*+!H
和
#+(*_
#"
- 个%
>
*
&(+,H
继代第
#!
天!(阿尔冈金)原生
质体的活力达最大值"
&$+!H
#!此时的产量也较大!
为
#+*!_#"
- 个%
>
因此!适宜
$
个苜蓿品种原生
质体酶解的愈伤组织最佳继代时间均是
#!A

9+=
!
不同培养方法对杂花和紫花苜蓿愈伤组织原
生质体培养效果的影响
利用
$
个苜蓿品种原生质体的最佳分离条件!
可获得产量高*活力强的原生质体"图版
$
!
5
*
3
#!
在此基础上进行原生质体的培养再生结果表明!
图
&
!
不同愈伤组织继代时间下
$
个苜蓿品种原生质的活力
a/
>
+&
!
WC@S/:U/;/P
<
DN
X
ODPD
X
;:0P0NOD9$S:O/@P/@0
DN:;N:;N:Y/PCA/NN@O@1P0?UB?;P?O@P/9@0
不同培养方法对原生质体培养效果的影响不同采
用固液双层培养时!原生质体大量形成细胞团的平
均时间为
$A
!液体培养基中平均为
*A
!通过更换甘
露醇浓度依次减半的新鲜培养基!均可见再生细胞
的持续分裂培养
!
"
%A
!在倒置显微镜下可观察
到
$
个苜蓿品种原生质体再生细胞的第
#
次*第
!
次和多次分裂"图版
$
!
4
"
8
#
$
"
,A
!可观察到
几十个至上百个再生的细胞团"图版
$
!
a
#培养
,
"
#$A
!原生质体持续分裂可形成肉眼可见的乳白
色小愈伤芽"图版
$
!
Q
#!将其转入含适宜激素浓度
的固体培养基培养
#*
"
%"A
!再生小愈伤组织由白
色逐渐变为淡黄绿色"图版
$
!
M
#经过
%
"
*
次继
代!最终可获得
$
个苜蓿品种原生质体再生的愈伤
组织"图版
$
!
K
"
E
#
%
!
讨
!
论
:+8
!
酶液组合和酶解时间对苜蓿原生质体分离效
果的影响
酶成分是原生质体游离的关键所在!不同植物
材料因其细胞壁成分和结构不同!所用酶的种类*浓
(&#
#
期
!!!!!!!!!!!!
李玉珠!等$杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选
度和 处 理 时 间 均 有 差 异+#-,参 照 前 人 的 研
究+#"!%)!*,!本实验共设计了
*
种酶液组合用于豆科
牧草细胞壁溶解的酶液组合结果表明!添加
"+%H
水平的崩溃酶对杂花和紫花苜蓿产量的提高效果比
同浓度的半纤维素酶和离析酶好这可能是因为崩
溃酶同时具有纤维素酶*果胶酶*地衣多糖酶和木聚
糖酶等多种酶的活性!对于培养细胞中分离原生质
体特别有用的缘故+!-,而离析酶的添加对苜蓿原
生质体的活力具有一定程度的抑制作用!不宜采用
就酶解时间而言!愈伤组织和悬浮细胞系较子
叶和叶片等幼嫩植物组织所需的时间长!前者一般
超过
#"C
!后者通常在
#"C
内本研究证明
$
个苜
蓿品种愈伤组织酶解
#"
"
#$C
!可分别获得最佳的
原生质体分离效果酶解时间小于
-C
时!产量偏
低!镜检时仍可见许多未酶解充分的大细胞团&酶解
时间超过
#$C
!原生质体的产量和活力明显下降!
破裂原生质体增多
:+9
!
渗透压稳定剂和预处理措施对苜蓿原生质体
分离效果的影响
豆科牧草最常用的渗透压稳定剂是甘露醇!浓
度为
"+%*
"
"+&9D;
%
E
+
!#
,

;`S@/O:
等+!,,的研究认
为
"+**
"
"+-9D;
%
E
的甘露醇浓度适宜于原生质体
分离和保存本研究发现适宜
$
个苜蓿品种原生质
体分离的最佳甘露醇浓度为
"+**
"
"+,*9D;
%
E
!此
时原生质体呈圆球形或椭圆形!边缘清晰!碎片少!
用
ab5
检测时发出明亮绿色荧光
为调整材料的状态!在原生质体游离之前!对供
体进行预处理!有利于原生质体的游离李贤等发
现在
#*^
"
!*^
室温和自然光照下培养的甘蓝无
菌苗下胚轴游离原生质体!原生质体产量为
#_#"
-
个%
>
!而经
$^
低温处理无菌苗后!原生质体的产量
可增加
#
倍+!&,沙打旺原生质体培养时发现!适当
时间的
$^
低温处理可显著促进原生质体的克隆和
胚胎发生+!(,本研究表明
$
种苜蓿愈伤组织在
"+**9D;
%
E
的
4FG
或蔗糖溶液中预处理
#C
最有
利于原生质的产出和稳定这可能是因为预质壁分
离措施可使细胞壁内的原生质部分收缩!细胞膜结
构改变!从而避免酶解时所造成的损伤!促进酶解时
细胞壁在小面积破损条件下释放原生质体!从而增
加原生质体的产量
:+:
!
愈伤组织状态对苜蓿原生质体分离和培养效
果的影响
供体的生理状态对原生质体分离和培养成功很
重要取材时间不同!原生质体分离和培养效果存
在差异就愈伤组织而言!继代时间和继代次数会
影响其生理状态!从而影响原生质体的质量王海
波等+!%,以
e2)#
型紫花苜蓿愈伤组织为材料!发现
第
!
次继代的愈伤为最好的游离材料!获得的原生
质体最高产率达
%+&-_#"
- 个%
>
赵小强等+%",将
(橄榄球
!
号)草地早熟禾继代
&
"
#!A
的胚性愈伤
组织进行酶解!可获得产量和活力较高的原生质体
本试验中
$
个苜蓿品种的愈伤组织经
!
"
%
月的继
代后!可达到质地疏松*结构稳定的状态!将之更换
到新鲜培养基上
#!A
时进行酶解!可获得产量高*
活力强的原生质体!后期培养时原生质体分裂速度
快!
,
"
#$A
即形成直径
!99
左右的微愈伤组织!
在固体培养基上增殖继代
%
"
*
次后可获得生长旺
盛*质地疏松的原生质体再生愈伤组织
:+;
!
不同苜蓿基因型材料对原生质体分离和培养
效果的影响
原生质体的分离质量和再生能力均受酶解起始
材料的基因型影响本研究发现(甘农
$
号)紫花苜
蓿在酶解时间*酶液组成*甘露醇浓度及继代时间等
$
个分离条件下的平均产量均高于其他品种"最大
值为
!+$&_#"
- 个#!(清水)紫花苜蓿原生质体在
*
个酶解条件下的平均活力均高于其他品种"最高值
可达
(%+#H
#后期培养时!(甘农
$
号)原生质体
在固液培养基上很快发生细胞壁的再生!第
!A
即
观察到再生细胞持续不断的分裂!
#
周左右可形成
直径
#
"
!99
的白色细胞团!
%"A
左右长成固体状
的小愈伤颗粒!是
$
个苜蓿品种中再生速度最快的
基因型材料而(清水)紫花苜蓿原生质体再生愈伤
组织则表现出较强的胚状体形成能力!继代培养中
发现!其黄绿色的愈伤组织由疏松逐渐变成致密的
颗粒状!形成绿色胚状体的数量最多!说明该品种具
有较好的再生特性
:+<
!
不同培养方法对苜蓿原生质体培养效果的
影响
采用适宜的培养方法是建立原生质体再生体系
的重要保障液体浅层培养因对原生质体的损伤小!
且易于添加新鲜培养基+!#,而在苜蓿+#"!#-)#,!$)!*,*红豆
草+#(,*百脉根+%#,等豆科牧草中得到了广泛的应用
本研究表明固液双层培养法较液体浅层培养法更有
利于杂花和紫花苜蓿原生质体前期的分裂和再生
固液双层培养时!固体培养基中的营养物质可缓慢
而持续地释放到液体培养基中!有利于原生质体的
生长!再生小细胞团的时间比液体培养基中平均早
#A
!且污染率低而进行液体浅层培养时!由于
"(#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
TV
&
F
培养基富含各种养分!原生质体密度偏高时
极易出现褐化现象!当获得再生小细胞团后!漂浮于
液体中的物质不易移出!增加了操作难度!提高了污
染的几率
参考文献"
+
#
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王
!
!陈默君
+
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