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Studies on Anti-Browning During Tissue Culture of Musella lasiocarpa

地涌金莲组织培养中的褐化抑制



全 文 :林业科学研究!"#"""
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地涌金莲组织培养中的褐化抑制
侯健华! 李正红!! 马!宏! 刘秀贤! 万友名
"中国林业科学研究院资源昆虫研究所!云南 昆明!:%#"" #
收稿日期"#(#("" 基金项目 国家自然科学基金项目"V##%%)#+中央级公益性科研院所基本科研业务费专项"G?ElMM"#tM#%#
作者简介")&) W#!男!湖南郴州人!硕士研究生!主要研究方向.!!)!!%V 06/JW时有利于愈伤组织的诱导!能显著降低褐化指数+ 添加柠檬酸 抗`坏血酸"nG#混合液%表面添加nG均对地涌金莲褐化未起到明显抑制作用!姜汁和阿魏酸对抑制 愈伤组织褐化有较好的效果!&.% 06/JW的阿魏酸能显著降低愈伤组织的褐化!使愈伤组织分化率达 .)=!".)=%=)
关键词!地涌金莲+组织培养+愈伤组织+褐化+抗褐化剂
中图分类号!>*"".V 文献标识码!?
62I.#&*)!)2J50*))(&4%( %(&*"-(/#(
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j.f.J,#系芭蕉科"e:("EB.#G.l.f< @Xj.f.J,#植物!包括原变种
地涌金莲"AE:(%4")(#P("EB.#G.l.f< @Xj.f.
J,N1B.:(%4")(#P(#和变种红苞地涌金莲"AE:(%4")(#2
P(R(#E#9S#4S#()&(&( m4@564756J,qj.e1#) 其具有 浓郁的南亚风情和宗教特色!有较高的观赏价值,- )
地涌金莲原变种花苞片为黄色!"#年 e1$&(:E在 四川省境内发现了花苞片呈橘红色至红色的红苞地 涌金莲新变种,"- !成为花色单一的地涌金莲培育新 林!业!科!学!研!究 第 "& 卷 优品种的重要种质资源) 随后!中国林业科学研究 院资源昆虫研究所选育出了6佛喜金莲4%6佛乐金 莲4%6佛悦金莲4等具有自主知识产权和广阔市场 前景的系列红苞新品种,V W%- ) 褐化是植物组织培养中的一个难题!是很多植 物组培能否成功的关键因素) 影响褐化的因素较 多!外植体的取材%植物生长调节剂%培养基%添加 剂%培养条件及培养方式都会影响愈伤组织的褐化 程度,:- ) 地涌金莲组织培养研究中多以吸芽为外植 体!在愈伤组织诱导%增殖%分化阶段均会发生严重 的褐化现象!导致分化率低,* W$#- ) 前人对地涌金莲 组织培养褐化抑制的研究较少!且未见对红苞地涌 金莲组织培养的报道) 红苞地涌金莲及6佛喜金 莲4等新品种在组培过程中褐化现象比原变种地涌 金莲更为严重!本课题前期研究的愈伤组织分化率 仅为 V=左右!严重制约了红苞品种培育及产业化 进程) 针对导致褐化因素!本试验研究了外植体的 消毒方式%植物生长调节剂的种类和浓度及抗褐化 剂对地涌金莲愈伤组织诱导和褐化的影响!旨在为 抑制地涌金莲组织培养的褐化提供理论依据!为红 色系地涌金莲新品种的进一步选育及规模化生产提 供技术支持) $!材料与方法 =.=>试验材料 供试材料采自栽种于中国林业科学研究院资源 昆虫研究所滇中高原试验站的原变种地涌金莲和红 苞地涌金莲成年母株) 为排除个体差异!所有试验 均用三株混合的未成熟雄花作为外植体) 原变种地涌金莲的外植体用于外植体消毒试验 和 :(M?和 "!(P浓度试验+红苞地涌金莲外植体用 于不同浓度抗褐化剂试验) =.?>基础培养基 以前期研究选出的效果较好的培养基作为基础 培养基$ 基础愈伤组织诱导培养基$改良e> :`(M?".# 06/J W$ `"!(PV.# 06/J W$ `蔗糖 V# 6/JW$ ` 琼脂 %.% 6/JW$ 椰`子汁 $#="N_N# `?G$ 6/ J W$ `精胺 .% 06/JW$+Uj值为 %.&) 接种后在 温度""% v"#d下暗培养) 基础分化培养基$改良e> :`(M?".# 06/JW$ `蔗糖 V# 6/JW$ `琼脂 %.% 6/JW$ 椰`子汁 $#= "N_N# `?G$.# 6/J W$ `精胺 .% 06/JW$+Uj值 为 %.&) 置于""% v"#d下培养!转瓶周期为 V# H) =.A>外植体消毒方式对愈伤组织诱导及褐化的 影响 !!在无菌条件下将原变种地涌金莲花苞层层剥 离!取出长度为 #.: $." ;0的未成熟雄花作为外 植体!分为二组!第一组不经消毒直接接种至诱导培 养基中) 第二组"对照#外植体用 V=戊二醛表面消 毒 V 0,5!无菌水清洗  次!再用 #.$=的升汞表面消 毒 V 0,5!无菌水清洗  次!接种至愈伤组织诱导培 养基中) 对照和处理各接种 % 瓶!每瓶 % 个外植体! 重复 V 次) V# H后统计愈伤组织诱导率%褐化率%褐 化指数) =KB>OJ5!和 ?&BJ%浓度组合对愈伤组织诱导及褐 化的影响 !!在基础愈伤组织诱导培养基的基础上!采用 " 因素区组试验设计!设置 :(M?浓度为 #.%%$%"%V 06/J W$ !"!(P浓度为 $%"%V% 06/JW$组合成 $: 种配方!将原变种地涌金莲外植体在无菌条件下不 经消毒接种在愈伤组织诱导培养基上!每个处理接 种 " 瓶!每瓶接种 % 个外植体!重复 V 次) V# H 后统 计愈伤组织诱导率%颜色和质地%褐化率%褐化指数) =.@>不同抗褐化剂种类及其浓度的褐化抑制效应 以红苞地涌金莲长度为 #.: $." ;0的未成 熟雄花作为外植体!将其在无菌条件下不经消毒接 种在添加了不同种类不同浓度抗褐化剂的愈伤组织 诱导培养基中!表面添加 $ 02nG液!nG浓度设置 为 %#%$##%"## 06/JW$+nG`柠檬酸浓度设置为 $##$%#%$####%##
+阿魏酸浓度设
置为 &.%%)*%)06/JW+姜汁液浓度设置为 #.
%%.
!其中 nG以及 nG 柠`檬酸的混
合液采用过滤灭菌法灭菌!阿魏酸和姜汁液采用湿
热灭菌法灭菌) 以不添加任何抗褐化剂的培养基作
为对照!每个处理接种 V 瓶!每瓶接种 % 个外植体!
重复 V 次) V# H 后统计愈伤组织诱导率!褐化率和
褐化指数!并转接至添加了与愈伤组织诱导相同抗
褐化剂的基础愈伤组织分化培养基中) 此后!V# H
继代一次!直至愈伤组织分化出芽!每次继代前统计
褐化率%褐化指数!&# H后统计生长量及分化率) =.O>统计分析方法 污染率Y染菌外植体数_接种外植体数Z##=
愈伤组织诱导率 Y产生愈伤组织外植体数_接
种外植体数Z##= 愈伤组织分化率 Y分化出苗的愈伤组织_愈伤 &"
第 " 期 侯健华等Z##=
褐化率 Y达 Z##=
褐变指数Y
"
"褐化级的愈伤组织块数 Z该
褐化级别#_"愈伤组织总数 Z最高的褐化级别#
Z##= 用褐变指数表示外植体褐变程度!参照顾之 中,!# 级""
化部分在 %#= *%=+V 级全部褐化或接近于全部褐化)
试验数据采用 /X;@2和 >U>> &.# 进行统计 分析) "!结果与分析 ?.=>外植体消毒方式对原变种地涌金莲愈伤组织 诱导及褐化的影响 !!接种前对外植体分别进行消毒和不消毒处理! 接种 V# H后!未消毒外植体的污染率同消毒后外植 体的污染率一致!均为 #=+经过消毒的外植体褐化 率为".=.%=%
#.V=+消毒外植体培养出来的愈伤组织质地较疏
松%表现出水渍状!呈黄褐色!而不消毒外植体培养
出来的愈伤组织质地较致密%无明显的水渍状!呈黄
绿色"表 #) 表 =>外植体消毒处理对原变种地涌金莲愈伤组织 诱导的影响 处理 编号 消毒 方式 诱导率 _= 污染率 _= 褐化率 _= 褐化指数 _= 愈伤组织质地 不消毒 )"1 #1 .1 #1 ".K V.)K 较疏松!黄褐色
!!注表中数字后不同的字母表示 #.#% 水平差异显著"Pr#.#%#! 下同) ?K?>OJ5!?&BJ%浓度对原变种地涌金莲愈伤组织
诱导及褐化的影响
!!将地涌金莲外植体接种在添加不同浓度的 :(
M?%"!(P的基础愈伤组织诱导培养基中!经过 V# H
的愈伤组织诱导!结果表明浓度不同的植物生长调 节剂对地涌金莲愈伤组织诱导的影响较大!当 :(M? 的浓度在 #.% V 06/JW范围内时!低浓度 :(M?
对外植体的诱导率低!诱导出的愈伤组织褐化率高!
出愈量小+高浓度 :(M?对外植体的诱导率高!诱导
出的愈伤组织褐化率较低!出愈量大+:(M?浓度为 "
06/J
W时愈伤组织的诱导效果最好)
当 "!(P浓度为 06/JW时!"!(P的浓度对
愈伤组织诱导的影响不大"表 "#) 在一定范围内 :(
M?浓度同愈伤组织的出愈率呈显著正相关"#Y
#h&%#!Pr#E##!同愈伤组织褐化率呈显著负相关 "#YW#E&V!Pr#E##!同愈伤组织出愈量呈显著
正相关"#Y#E&)%!Pr#.##+"!(P浓度同愈伤组 织的出愈率%褐化率%出愈量相关性均不显著) 表 ?>OJ5!?&BJ%浓度对地涌金莲愈伤组织的诱导效果
处理
编号
植物生长调节剂的浓度
:(M?
_"06/J
W# "!(P _"06/J W
#
诱导率
_=
褐化率
_=
出愈量
?#.% ::.*;H &.); ` ?" #.% " *#.&KH V.1K ` ?V #.% V %&.VH@ V.V1 ` ? #.%  %#.#@.1M &V.VK "#.%; `
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PV V V ##.#1 ."H ``` P V  )%.&1 &.);H ``` !!注 表`示出愈量小+` 表`示出愈量中+`` 表`示出愈量大)
?.A>不同抗褐化剂种类及其浓度对红苞地涌金莲
的褐化抑制效应
!!添加了不同种类%不同浓度抗褐化剂的愈伤组
织诱导培养基都能诱导出愈伤组织!但添加 )06/JW阿魏酸时愈伤组织的诱导率较低!为 :V.=)!+%# H 后!添加
&.% 06/J
W!:".V=+)06/JW阿魏酸%#.% 6/JWh% 6/J
W=%**.%=%*.:=!也均显著低于对照+当阿魏
酸浓度为 )06/JW%姜汁浓度为 .% 6/JW时不 利于褐化的有抑制!其愈伤组织褐化指数分别为 )V.&=%)".=!均显著高于对照) 愈伤组织生长量在外植体接种 V# H 后表现出 差异性!接种"# H 时差异最为明显!统计 "# H 时 的生长量结果表明添加阿魏酸和姜汁会减少愈伤
组织的生长量!且阿魏酸和姜汁的浓度越高其生长
)" 林!业!科!学!研!究 第 "& 卷 量越低!当阿魏酸浓度为) 06/JW时愈伤组织的生长量最低!均为 (`)
接种 &# H后开始有愈伤组织分化出苗!接种 V## H 后愈伤组织或分化出苗或已经褐化坏死!统计愈伤 组织的分化率!结果表明添加 &.% 06/JW的阿魏酸和添加 #.% 6/JW.% 6/JW的姜 汁其愈伤组织的分化率均显著高于对照!其中添加 &.% 06/J W阿魏酸的愈伤组织分化率最高!为
h)=+####
06/J
WnG 02nG时其愈伤组织的分化率均同对照差异不
显著!为 V=左右"表 V#)
表 A>不同种类不同浓度抗褐化剂对红苞地涌金莲愈伤组织的影响
处理 水平 浓度 诱导率_=
褐化指数_=
V# H :# H "# H&# H
"# H生长量 分化率_= 对照 )#.%1 V."H V%.&@- *".&;H &*.";H ``` ".)@- 表面添加 02nG_" 06/JW# %# )#.&1 .@VV.:".## &).&1K .;H@ &:."H ``` V.*@-
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姜汁液_" 6/JW# #.% &*.&1K V.);H #.#;H *#.:H@ **.%@ `` *.:H
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!!注++)V!!!!!使," WV- ) 本试验外植体为被 花苞紧被的未成熟雄花!与外界处于隔离状态!表面 所带的细菌和真菌极少!且未成熟雄花细胞处于活 跃的分生阶段!内源菌较少) 试验中发现!外植体不 经消毒在无菌条件下接种!其污染率为 #!且褐化 率%褐化指数均低于消毒处理的对照组!愈伤组织的 质地也好于对照) 因此!不对外植体消毒!既可避免 原变种地涌金莲组织培养中外植体的污染!也解决 了消毒对外植体造成损害进而引发的褐化问题!使 组织培养在接种之初就减轻了褐化的程度) 在地涌 金莲组织培养中!采用未经开放的内藏未成熟雄花 作为外植体最好) 对于不同植物!有效诱导其愈伤组织的植物生 长调节剂的种类也有所不同) 影响芦荟 "-:"
AQQ.#%火鹤"-0&*9#49C(0Q#((09CJ.#叶片愈伤组 织诱导率的主导因子均为 :(M?!"!(P为次要因 子, W$%- !而 "!(P则是影响诱导香蕉"A9%( 0(0(
J7说明!在原变种地涌金莲的愈伤组织诱导中 :(M?起
主导作用!其浓度对愈伤组织的褐化率%褐化指数%
出愈量有较大的影响!"!(P的浓度对愈伤组织的
诱导作用不显著!其浓度对愈伤组织的出愈率%褐化
率%出愈量影响不显著)
nG为多羟基还原物质!作为一种有效的抗褐化
剂被应用于多种植物组织培养中+其作用原理一方
面是可以使多酚氧化酶失活!阻止酚类物质氧化!另
一方面nG在酶的催化下能消耗溶解氧!使酚类物
质因缺氧而无法氧化!从而达到抑制褐化的效
果,)I7&(:E相同的办法,&- !即在 培养基表面添加一定量的 nG液!处理在愈伤组织 诱导的早期获得了较好效果!但继代后期褐化严重! 同对照无显著性差异!这可能与红苞地涌金莲愈伤 组织褐化程度较高有关) 有研究表明!柠檬酸与nG 的结合使用可对愈伤组织褐化抑制起到协同作用! 使多酚氧化酶"UUk#酶活性受抑制更为明显!这可 能由于添加一定量的柠檬酸可增强 nG的稳定性! 降低nG的损失而提高其抑制效果,)- ) 但本试验
中!nG 柠`檬酸组合处理对愈伤组织褐化抑制没有
很好的效果) 添加适宜浓度的姜汁有利于抑制红苞
#""
第 " 期 侯健华等!.% 6/JW!#.V=!褐化指数为 *.:=)
e7B-@,5@在小果野蕉"A9%( ()9C40(&G721#组织培 养中首次采用姜汁抑制褐化!采用# 6/JW的姜汁 处理外植体!接种 V 周后培养基和外植体的褐化强 度分别为无(和低(!对褐化的抑制达到了很好的 效果,"#- !本试验的结果与其一致) j<156&(:E在紫竹 "F*7:"%&()*7%041#( "J7HH.
@XJ,5H2.#e<5B7#组织培养的抗褐化研究中对培养
基中添加阿魏酸%nG%曲酸%半胱氨酸%硫脲等 % 种
UUk抑制剂!发现当阿魏酸浓度为 )06/JW
培养基的褐化比率为 #!平均褐化的芽数为 #."% 个
左右!抑制褐化的效果最好,"- ) 作为一种多酚!阿 魏酸具有很强的抗氧化功效!同时也是一种化感物 质!这可能与多酚*蛋白质具有可逆的结合反应有 关!同时多酚这一重要的化学性质也导致了阿魏酸 对酶具有抑制作用!进一步抑制了植物的生 长,"" W"V- ) 本试验中!高浓度的阿魏酸会降低愈伤组 织诱导率!明显抑制愈伤组织的生长) 在愈伤组织 继代 :# H以后!低浓度的阿魏酸可以显著降低愈伤 组织的褐化指数!并随着愈伤组织继代的时间延长 效果越明显!这可能与阿魏酸具有强的还原性%抗氧 化能力以及对UUk有抑制作用有关) 当浓度为 &. % 06/J W阿魏酸对愈伤组织的生长量抑制不明显!
却能显著的降低愈伤组织的褐化指数!使愈伤组织
的分化率达到 .)=!".)=- 冯国楣! 李雅茹.云南植物志第 " 卷 ,e-.北京.)*)"&(:EA9%:(:(2
(&( "e,;4<15! G4,51,i-.c7N75!
"#! "$"V#$ V) WV%V. ,V- 万友名! 李正红! 马!宏! 等.地涌金莲新品种佛喜金莲( ,i-.园艺学报! "#$V! # "#$ & W&". ,- 马!宏! 李正红! 万友名!等.地涌金莲新品种佛乐金莲( ,i-.园艺学报! "#V! #"&#:"% W:":.,V! #":#")W""#.
,:- 高国训.植物组织培养中的褐变问题 ,i-.植物生理学通讯!
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,&- 王云波! 凌!青! 李玉香! 等.地涌金莲组培快繁技术研究
,i-.现代农业科技! "#":#$ " W"V. ,)- 刘秀贤! 潘庆杰! 李正红! 等.地涌金莲的离体培养与快速繁殖 技术研究 ,i-.安徽农业科学! "## "##)#"W.,#- 曾宋君! 吴坤林! 陈之林! 等.珍稀药用和观赏植物地涌金莲
的组织培养和快速繁殖 ,i-.热带亚热带植物学报! "##*! #!!!.,i.西!))"! "V# "#: W"$$.
,$"- M7561ie! P版社! )&& "*V W"*).
,V.,i.!))!&":#""W"V.,- 肖!波! 廖尔华! 胡开治! 等.植物生长物质诱导芦荟叶片愈
伤组织效果的研究 ,i-.中国农学通报! "##:!"" "#:VW:%.
,"""#V W&. ,:- 朱祝英! 郑锦玲! 杨玉梅! 等.植物生长调节剂对离体香蕉叶
片愈伤组织诱导的影响,i-.广东农业科学! "#V"#")
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,*- 陈惠娟.植物组织培养中褐变的产生机理及克服措施,i-.植 物保护! "##%! V""#*) W&". ,&- I7fj! >< GG! G4@5 GJ! $&(:.G75DB727-2@D412KB7R5,567-
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