全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４４５２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
陈春艳，马晖玲，董文科．甘肃红豆草无色花青素还原酶ＬＡＲ基因的克隆和表达分析．草业学报，２０１５，２４（６）：１７７１８７．
ＣｈｅｎＣＹ，ＭａＨＬ，ＤｏｎｇＷＫ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆａＬｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎＲｅｄｕｃｔａｓｅ（ＬＡＲ）Ｇｅｎｅｆｒｏｍ犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪ｃｖ．
Ｇａｎｓｕ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（６）：１７７１８７．
甘肃红豆草无色花青素还原酶犔犃犚
基因的克隆和表达分析
陈春艳１，２，３，４，马晖玲１，３，４，董文科１，３，４
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．河南科技大学农学院，河南 洛阳４７１００３；３．草业生态系统教育部重点实验室，
甘肃 兰州７３００７０；４．中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：以甘肃红豆草为材料，采用ＲＴ－ＰＣＲ法克隆无色花青素还原酶ＬＡＲ基因，分析该功能基因在甘肃红豆草不
同器官表达的差异性。结果表明，克隆的甘肃红豆草 ＬＡＲ 基因，与 ＧｅｎＢａｎｋ已报道 ＬＡＲ 基因（登录号：
ＨＭ１５２９８１）序列相似性达到９８．３４％，其ＯＲＦ长为１０８９ｂｐ，编码３６２个氨基酸残基；其编码的氨基酸序列与不同
属豆科物种的相似性存在较大的差异。基因序列已注册到ＧｅｎＢａｎｋ，序列登录号为ＫＰ０１３６２３。ＬＡＲ基因在甘肃
红豆草不同器官表达差异较大；其中叶中表达量最高，其次是花和果，茎中表达量最低，这与器官间缩合单宁含量
的变化规律一致。推测其表达与甘肃红豆草缩合单宁器官间的积累差异有关。这些研究结果也为探索缩合单宁
积累和表达调控的机制提供基础。
关键词：甘肃红豆草；ＲＴ－ＰＣＲ；无色花青素还原酶；克隆与表达　　
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犪犔犲狌犮狅犪狀狋犺狅犮狔犪狀犻犱犻狀犚犲犱狌犮狋犪狊犲（犔犃犚）犌犲狀犲
犳狉狅犿犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌
ＣＨＥＮＣｈｕｎＹａｎ１，２，３，４，ＭＡＨｕｉＬｉｎｇ１，３，４，ＤＯＮＧＷｅｎＫｅ１，３，４
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃犵狉狅狀狅犿狔，犎犲狀犪狀犝
狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犔狌狅狔犪狀犵４７１００３，犆犺犻狀犪；３．犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪
狋犻狅狀，犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犪犾犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；４．犛犻狀狅犝．犛．犆犲狀狋犲狉犳狅狉犌狉犪狕犻狀犵犾犪狀犱犈
犮狅狊狔狊狋犲犿犛狌狊狋犪犻狀犪犫犻犾犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＬＡＲ）ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｕｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲｆｒｏｍ犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪
（ｓａｉｎｆｏｉｎ）ｃｖ．Ｇａｎｓｕ，ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＬＡＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｏｒｇａｎｓ．ＴｈｅＬＡＲ
ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍ犗．狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪ｃｖ．Ｇａｎｓｕｓｈａｒｅｄａｈｉｇｈｌｅｖｅｌｏｆｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（９８．３４％ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ｗｉｔｈａｎ犗．
狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪ＬＡＲｇｅｎｅｉｎＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ：ＨＭ１５２９８０）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｓ
ｏｂｖｉｏｕｓｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈｏｓｅｉｎｏｔｈｅｒｇｅｎｅｒａｏｆｔｈｅＦａｂａｃｅａｅ．Ｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ１０８９
ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ３６２ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＬＡＲｇｅｎｅｆｒｏｍｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙｗａｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏ
ＧｅｎＢａｎｋｗｉｔｈｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＫＰ０１３６２３．ＬＡＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｐｌａｎｔｏｒｇａｎｓｏｆ犗．狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪
ｃｖ．Ｇａｎｓｕ．ＬＡＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｈｉｇｈｅｓｔｉｎｌｅａｖｅｓ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｆｌｏｗｅｒｓａｎｄｆｒｕｉｔ，ａｎｄｗａｓｌｏｗｅｓｔｉｎｓｔｅｍｔｉｓ
ｓｕｅｓ，ｗｈｉｃｈｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｄｔｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｄｅｎｓｅｄｔａｎｎｉｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｏｆ犗．狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪ｃｖ．Ｇａｎｓｕ．
ＩｔｉｓｉｎｆｅｒｒｅｄｔｈａｔＬＡＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｉｎｓｏｍｅｗａｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｏｎｄｅｎｓｅｄｔａｎｎｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎ犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪
第２４卷　第６期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年６月
Ｊｕｎｅ，２０１５
收稿日期：２０１４１１０３；改回日期：２０１５０１０７
基金项目：甘肃省科技厅科技支撑计划项目（１１０４ＮＫＣＡ０８７）和国家自然科学基金项目（３１２００２９９）资助。
作者简介：陈春艳（１９７７），女，甘肃兰州人，实验师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｃｙ０７１３＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｍａｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｃｖ．Ｇａｎｓｕ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａ
ｎｉｓｍｏｆｃｏｎｄｅｎｓｅｄｔａｎｎｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪ｃｖ．Ｇａｎｓｕ；ＲＴ－ＰＣＲ；ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
红豆草（犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犪犲犳狅犾犻犪）为多年生草本植物，红豆草地上部分粗蛋白质及氨基酸含量丰富，含有一定
数量的粗脂肪、多种维生素和矿物质及其他化学物质。红豆草的种子产量和产草量高，结实性能较好，营养物质
全面而丰富，适口性优良。而且它能显著增加土壤含氮量，也是一种花蜜液数量多的植物［１］。目前，红豆草作为
优良的牧草在甘肃、新疆、内蒙古、陕西、宁夏、青海等２３个省区广泛栽培［２］。甘肃红豆草（犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪
ｃｖ．Ｇａｎｓｕ）是由普通红豆草和高加索红豆草自由杂交多次混合授粉的植株中单株选择培育成的［３］。适合我国干
旱半干旱地区建立人工草地，其产草量接近或超过早熟、速生、抗病虫害、高产、耐旱的紫花苜蓿品种。
可溶性蛋白含量高是苜蓿引起家畜臌胀病的主要原因［４］。缩合单宁能够与可溶性蛋白质作用生成沉淀，避
免引起臌胀病，然而紫花苜蓿叶片不含缩合单宁，只在种皮中少量存在。红豆草在各个生长时期叶片都能生产很
高浓度的缩合单宁［５］。家畜饲用富含缩合单宁的红豆草后不会患臌胀病，普遍认为红豆草是在遗传资源创新途
径中和饲草利用方式解决紫花苜蓿引起牲畜臌胀病发生的一种理想牧草［６７］。在遗传资源创新方向，从红豆草中
鉴定和分离缩合单宁基因，进而利用基因工程技术将此基因导入到苜蓿中去，不失为一条改善苜蓿品质和适口性
的有效途径。
目前，缩合单宁合成途径已经基本清楚。主要由公共苯丙烷途径、核心类黄酮－花青素途径、缩合单宁特异
途径完成，其中缩合单宁特异途径最终决定其积累［８］。缩合单宁特异生成途径中有两个关键酶分别是无色花青
素还原酶（ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＬＡＲ）和花青素还原酶（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＡＮＲ）［９１０］。ＬＡＲ和
ＡＮＲ为单宁的生成提供了两条不同的途径和不同的前体物质，然而前者的底物无色花青素又是经花青素合成酶
合成的花青素成为后者的底物，ＬＡＲ在缩合单宁特异合成途径中尤为重要［１１］。一些研究证实ＬＡＲ基因的表达
与缩合单宁的累积呈正相关［１２］，但是也有ＬＡＲ活性与缩合单宁累积不符的报道［１３］。ＬＡＲ基因表达与缩合单宁
合成受到种内和种间差异的影响［１４］。为此，探清甘肃红豆草ＬＡＲ基因结构、功能及其表达具有重要的科学意义
和实践应用价值。
从植物组织中提取纯度高、完整性好的高质量ＲＮＡ是进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、ＲＴ－ＰＣＲ以及ｃＤＮＡ文库构建
等分子生物学研究的必要前提［１５１６］。然而红豆草的组织和器官中富含酚、原花青素、花青素等次生代谢物以及蛋
白质、多糖等生物大分子，其ＲＮＡ提取难度较大，这些物质严重影响ＲＮＡ提取的质量和效果。本研究通过改良
总ＲＮＡ提取方法，将提取获得的总ＲＮＡ粗提物纯化，提出了一种有效的红豆草总ＲＮＡ的提取方法。进而利
用ＲＴ－ＰＣＲ法克隆甘肃红豆草ＬＡＲ基因，分析其序列特征，与其他高等植物的ＬＡＲ基因进行相似性比较，并
分析ＬＡＲ基因的组织表达特征。以验证该方法所提取的总ＲＮＡ能否满足下游分子生物学实验，也为红豆草分
子生物学进一步研究提供参考和借鉴。
１　材料与方法
１．１　材料和试剂
１．１．１　材料　　红豆草品种为甘肃红豆草，由甘肃农业大学草业学院提供。
１．１．２　实验试剂和处理方法　　ＭＭｕＬＶＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购自上海生工生物工程公司，引物
由北京赛百盛生物公司合成，Ｔａｑ酶购自大连宝生物工程有限公司，ＳａｎＰｒｅｐＤＮＡ胶回收试剂盒购自上海生工
生物工程公司，其他药品、试剂为常规国产分析纯。
所用的试剂为新开封试剂，用灭菌的０．１％焦碳酸二乙酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，ＤＥＰＣ）水配制，塑料耗材
均需用０．１％ＤＥＰＣｄＨ２Ｏ处理２４ｈ，高温灭菌，烘干后备用；研钵、试剂瓶、玻璃棒、容量瓶等物品经１８０℃高温
烘烤５ｈ，避免ＲＮａｓｅ污染。
８７１ 草　业　学　报 第２４卷
１．２　ＲＮＡ提取方法
１．２．１　ＣＴＡＢ法粗提ＲＮＡ　　取红豆草幼嫩材料０．１０ｇ，在液氮中研磨成粉，将粉末迅速转移至１．５ｍＬ的离
心管中；加入６００μＬ的６５℃ ＲＮＡ提取缓冲液 ［２％β巯基乙醇（Ｗ／Ｖ）、２％ＣＴＡＢ（Ｗ／Ｖ）、４％ＰＶＰ（Ｗ／Ｖ）、１．４
ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］，然后振荡１ｍｉｎ，使材料裂解充分，
在６５℃水浴锅中温浴１０ｍｉｎ，期间振荡２～３次；然后在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心１０ｍｉｎ；吸取上清置于另
１支１．５ｍＬ离心管中，加入６００μＬ体积比为２５∶２４∶１的水饱和酚：氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀，放置
于冰上１０ｍｉｎ；在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心１０ｍｉｎ；吸取上清至另一离心管中，重复上述除蛋白步骤；吸取
上清，加入１６７μＬ１０ｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ，上下颠倒混匀，置于－２０℃冰箱３ｈ，在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心２０
ｍｉｎ；弃上清液，将沉淀溶解于５００μＬ０．１％ＤＥＰＣ水中，加入５０μＬ的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ（ｐＨ５．２），充分溶解后，
再加入１３７５μＬ－２０℃的无水乙醇，混匀，放置于－７０℃的超低温冰箱中３０ｍｉｎ，在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速
离心１０ｍｉｎ，弃去上清；用７０％乙醇洗涤２次，在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心５ｍｉｎ；弃去上清，倒扣在滤纸上
吸光残余乙醇；沉淀于超净工作台中风干，加入５０μＬ０．１％ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，此为ＲＮＡ粗提物。
１．２．２　ＲＮＡ的纯化　　取ＲＮＡ粗提物１００μＬ，加入９００μＬ０．１％ＤＥＰＣ水，使其溶解，然后加入１０００μＬ体
积比为２５∶２４∶１的水饱和酚：氯仿：异戊醇混合液，颠倒混匀，在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心２０ｍｉｎ；取上
清于另一支１．５ｍＬ离心管中，立即加入２００μＬ的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ（ｐＨ５．２）和５００μＬ预冷的无水乙醇，混匀，放
置于－７０℃的超低温冰箱中沉淀３０ｍｉｎ，在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心１０ｍｉｎ，弃去上清；用７０％乙醇洗涤
２次，在４℃和１２０００ｒ／ｍｉｎ下高速离心５ｍｉｎ；弃去上清，倒扣在滤纸上吸光残余乙醇；沉淀于超净工作台中风
干，加入５０μＬ０．１％ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，将其保存于－８０℃的超低温冰箱。
１．３　ＲＮＡ质量检测
１．３．１　纯度和浓度测定　　取纯化的ＲＮＡ１μＬ，以０．１％ ＤＥＰＣ水为空白液调零，在微量分光光度计下测定
ＯＤ２６０和ＯＤ２８０值。
１．３．２　凝胶电泳检测　　取纯化的ＲＮＡ１０μＬ，以１×ＴＢＥ为缓冲液，在１％的琼脂糖凝胶上电泳，３０ｍｉｎ后，
在凝胶成像系统中观察并照相。
１．４　基因克隆
１．４．１　ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡ合成　　使用上海生工生物工程公司反转录试剂盒进行ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡ合成反
应，合成后产物于－２０℃保存备用。
１．４．２　ＰＣＲＬＡＲ基因　　根据 ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布的红豆草无色花青素还原酶（ＬＡＲ）基因（登录号：
ＨＭ１５２９８１）序列，利用分子生物学软件ＤＮＡＭＡＮ６．０设计特异引物：
ＬＰ１：５′ＣＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＡＡＴＡＴＣ３′
ＳｍａｌⅠ　　　　　　　　　　　　　
ＬＰ２：５′ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧ３′
ＳａｃⅠ　　　　　　　　　　　　　　　
ＰＣＲ反应体系（２５μＬ）包括ｃＤＮＡ１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，引物ＬＰ１ 和ＬＰ２（１０
ｐｍｏｌ／μＬ）各１μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑ酶０．５μＬ。反应程序为，预变性：９４℃、４ｍｉｎ，变性：９４℃、１ｍｉｎ，退火：５７℃、１
ｍｉｎ，延伸：７２℃、１．５ｍｉｎ，３８个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。反应结束后取１０μＬ反应产物于１％琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物。
１．４．３　与Ｔ载体连接转化感受态细胞及测序　　按回收试剂盒说明书对ＰＣＲ产物进行回收，按照１∶４将
ｐＭＤ１８ＴＶｅｃｔｏｒ与目的片段进行连接，１６℃反应６ｈ。取连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，并进行蓝
白斑筛选。挑选阳性克隆于含１００ｍｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ培养基中振荡培养，提取质粒ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增及
ＳｍａｌⅠ和ＳａｃⅠ双酶切鉴定阳性克隆后送于上海生工生物公司测序。
１．５　ＬＡＲ基因生物信息学分析
基因开放阅读框通过ＮＣＢＩ提供的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）寻找；核
９７１第６期 陈春艳　等：甘肃红豆草无色花青素还原酶ＬＡＲ基因的克隆和表达分析
苷酸序列相似性检索通过ＮＣＢＩ的ＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＰ和ＤＮＡＭＡＮ６．０软件进行分析；用 ＭＥＧＡ６．０软件进行氨
基酸序列比对和ＬＡＲ类蛋白质序列系统进化树分析；用ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ网站进行蛋
白质理化性质分析。通过应用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ软件的 Ｈｐｈｏｂ．Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ算法对ＬＡＲ蛋白进行亲水／疏水性
分析。利用ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）进行保守功能区预测。
１．６　ＬＡＲ基因组织表达特性分析
采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对甘肃红豆草ＬＡＲ基因进行组织器官特异性表达分析。分别提取甘肃红豆草
叶、茎、花、果的总ＲＮＡ，以等量的ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ，－２０℃备用。运用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件设计引物和
内参引物如下：
ＬＡＲＰ１：５′ＡＣＧＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＡＴＡ３′
ＬＡＲＰ２：５′ＴＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＧＧ３′
ＡｃｔｉｎＰ１：５′ＧＡＧＣＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＧＡ３′
ＡｃｔｉｎＰ２：５′ＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡ３′
以等量的ｃＤＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ，反应程序为，预变性：９４℃、１ｍｉｎ，变性：９４℃、３０ｓ，退火：５５℃、３０ｓ，延伸：
７２℃、４０ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。反应结束后取１０μＬ反应产物于１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产
物。进行３次重复实验。通过目的条带的亮度来分析基因表达的差异。
１．７　缩合单宁含量的测定
分别取甘肃红豆草叶、茎、花、果各０．５ｇ，液氮研磨成粉末状，加入３ｍＬ提取液［含０．５％乙酸的７０％丙酮
（Ｖ／Ｖ）］研磨至匀浆，于５０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清液，沉淀用３ｍＬ提取液清洗２次，合并上清液，并定
容至１０ｍＬ；吸取２ｍＬ上清液加入２ｍＬ水和２ｍＬ三氯甲烷且充分摇匀后于５０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ去除
叶绿素（重复３次）；上清液即为提取液。采用正丁醇－盐酸法［１７］测定缩合单宁含量。
２　结果与分析
２．１　ＲＮＡ的提取和琼脂糖凝胶电泳检测
ＲＮＡ的纯度和完整性是分子生物学实验成功与
否的重要因素。利用改良ＣＴＡＢ法分离得到的甘肃
红豆草总ＲＮＡ，经微量分光光度计测定 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
值处于１．８～２．０之间（表１）；不同器官ＲＮＡ电泳显
示２８ｓ和１８ｓ条带较清晰，且２８ｓ条带的亮度高于１８ｓ
条带（图１），结果表明得到的总ＲＮＡ既未发生降解，
又无ＤＮＡ、蛋白质等污染，质量和纯度较高。
表１　甘肃红豆草不同器官总犚犖犃的浓度及纯度
犜犪犫犾犲１　犜犺犲犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀犪狀犱狆狌狉犻狋狔狅犳狋狅狋犪犾犚犖犃犻狀
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狅狉犵犪狀狊狅犳犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌
器官 Ｏｒｇａｎｓ 浓度Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎｇ／μＬ） ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
茎Ｓｔｅｍ ６４０．９１ １．８３
叶Ｌｅａｆ ９１７．８８ １．９０
花Ｆｌｏｗｅｒ １１５９．７３ １．９３
果Ｆｒｕｉｔ ８５７．０６ １．８９
２．２　ＬＡＲ基因的扩增及克隆
图１　甘肃红豆草不同器官的总犚犖犃
犉犻犵．１　犜狅狋犪犾犚犖犃狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狅狉犵犪狀狊犻狀
犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌
　１：茎Ｓｔｅｍ，２：叶Ｌｅａｆ，３：花Ｆｌｏｗｅｒ，４：果Ｆｒｕｉｔ．
为确定改良ＣＴＡＢ法提取的红豆草总ＲＮＡ能否
满足下游分子生物学实验。以该法提取的总ＲＮＡ反
转录的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增得到约１１００ｂｐ左右
的片段（图２）。回收 ＰＣＲ 产物，连接到ｐＭＤ１８Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒ上，经蓝白斑筛选后，挑选阳性克隆，提取质粒
进行ＰＣＲ扩增及ＳｍａｌⅠ和ＳａｃⅠ双酶切鉴定，得到的
目的片段大小约为１１００ｂｐ（图３，图４）。表明这些克
隆为阳性克隆，将其命名为：ｐＭＤＬＡＲ，送交测序公
司测序。
２．３　测序结果及序列分析
本研究克隆的甘肃红豆草ＬＡＲ基因已登记在ＧｅｎＢａｎｋ（登录号：ＫＰ０１３６２３），将核酸序列用ＤＮＡＭＡＮ６．０
０８１ 草　业　学　报 第２４卷
软件进行比对分析，它与红豆草ＬＡＲ基因（登录号：
图２　犔犃犚基因的犘犆犚扩增
犉犻犵．２　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犔犃犚犵犲狀犲
Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：ＰＣＲ扩增产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ．
图３　阳性克隆的犘犆犚
犉犻犵．３　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犮犾狅狀犲狊
Ｍ：ＤＬ１０００Ｍａｒｋｅｒ；１，２：阳性克隆ＰＣＲ产物
ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图４　阳性克隆的双酶切鉴定
犉犻犵．４　犇狅狌犫犾犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犮犾狅狀犲狊
Ｍ：ＤＬ１０００Ｍａｒｋｅｒ；１，２：阳性克隆ＳｍａｌⅠ和ＳａｃⅠ双酶切
ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙＳｍａｌⅠａｎｄＳａｃⅠ．
ＨＭ１５２９８１）具有９８．３４％的相似性。其开放阅读框架
为１０８９ｂｐ，包括３６２个氨基酸编码区和一个终止密码
子（ＴＡＧ）。与 ＮＣＢＩ数据库中登录相似性较高的几
种植物ＬＡＲ基因核酸ＢＬＡＳＴ分析发现，该序列与豆
科其他属植物百脉根、蒺藜苜蓿、大豆、豌豆和大百脉
根相似性在７６％～９３％，与杜鹃花科兔眼蓝莓、桑科
啤酒花和蔷薇科甜樱桃的相似性低于７５％（表２）。说
明同属间ＬＡＲ基因具有很强的保守性，但不同物种
间ＬＡＲ基因在进化过程中发生较大变异。
２．４　蛋白特性分析
Ｐｒｏｔｐａｒａｍ软件分析甘肃红豆草ＬＡＲ蛋白分子
式为Ｃ１７７４Ｈ２８０２Ｎ４７０Ｏ５２６Ｓ１７，分子量为３９６７５．６，编码
３６２个氨基酸，其中异亮氨酸含量最高（９．１％），色氨
酸最少（０．６％）。理论等电点为５．９５，原子数为５５８９，
带正电荷氨基酸残基数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３６，带负电荷氨
基酸残基数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为４２。脂肪系数为９２．３５。
不稳定系数为３７．８４，属于稳定蛋白。信号肽预测表
明，基因编码的蛋白无信号肽结构，为非分泌性蛋白
（ｎｏｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）。第２０位的甘氨酸（Ｇｌｙ）具
有最高的分值２．２，疏水性最强；第３３１位的赖氨酸
（Ｌｙｓ）具有最低的分值－２．８２２，亲水性最强；平均亲
水性（ｇｒａｎｄａｖｅｒａｇｅｏｆｈｙｄｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ，ＧＲＡＶＹ）值
为－０．０６４；亲水性氨基酸平均分布在整个肽链中，且
多于疏水性氨基酸（图５），为亲水蛋白。利用ＣＤＤ保
守功能区在线分析ＬＡＲ的保守区预测，发现ＬＡＲ编
码的氨基酸序列具有典型的苯（基）吡喃酮苄基醚还原
酶（ＰＣＢＥＲ，ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒａｎｂｅｎｚｙｌｉｃｅｔｈｅｒｒｅｄｕｃ
ｔａｓｅ）的特征结构域，属于短链脱氢／还原酶（ｓｈｏｒｔ
ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＳＤＲ）超家族成 员
（ｃｄ０５２５９）；此氨基酸序列含有 ＮＡＤ（Ｐ）结合位点
［ＮＡＤ（Ｐ）ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ］和赖氨酸活性位点（ａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ
ｌｙｓｉｎｅ）（图６）。
甘肃红豆草ＬＡＲ与其他物种ＬＡＲ氨基酸序列比对结果表明，其ＬＡＲ氨基酸序列与豆科植物红豆草、蒺藜
苜蓿、百脉根的相似性最高，分别达到９６．４４％，７９．０１％和７３．２８％；与蔷薇科甜樱桃、杜鹃花科兔眼蓝莓和桑科
啤酒花的相似性最低，分别为６２．５３％，６０．７６％和６０．６６％。甘肃红豆草ＬＡＲ氨基酸序列与同科植物间的相似
性为６７．６８％～９６．４４％，ＬＡＲ编码的氨基酸序列在豆科植物不同种间差异明显，这与核酸序列变化的特征基本
一致（图７）。甘肃红豆草ＬＡＲ与其他科植物比较，其相似性更低。说明在同源关系相近的植物中ＬＡＲ基因的
保守性很强。
２．５　系统进化分析
对ＮＣＢＩ下载的９个物种的ＬＡＲ氨基酸序列进行系统进化树分析，发现甘肃红豆草ＬＡＲ蛋白与豆科植物
１８１第６期 陈春艳　等：甘肃红豆草无色花青素还原酶ＬＡＲ基因的克隆和表达分析
红豆草亲缘关系最近；它与豆科植物蒺藜苜蓿和豌豆的亲缘关系也较近，其次为豆科植物大豆、百脉根和大百脉
根。ＬＡＲ蛋白与杜鹃花科兔眼蓝莓、桑科啤酒花和蔷薇科甜樱桃的亲缘关系相对最远（图８）。豆科不同物种明
显聚类成一组，而其他科植物聚类为另一组。说明不同物种的ＬＡＲ蛋白具有明显的种属特性，ＬＡＲ蛋白在种间
的变化也反映了植物学分类特征。
表２　甘肃红豆草犔犃犚基因与其他植物犔犃犚基因犮犇犖犃序列相似性比较
犜犪犫犾犲２　犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犔犃犚犵犲狀犲狅犳犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌狑犻狋犺狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
ＬＡＲ基因的来源ｃＤＮＡ
ｓｏｕｒｃｅｓｏｆＬＡＲｇｅｎｅ
所属科属
Ｆａｍｉｌｙｇｅｎｅ
ＧｅｎＢａｎｋ登记号
ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｉｎＧｅｎＢａｎｋ
相似性
Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（％）
红豆草犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪 豆科红豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ犗狉犿狅狊犻犪 ＨＭ１５２９８１ ９８
百脉根犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊 豆科百脉根属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ犔狅狋狌狊 ＤＱ３４９１０７ ９３
蒺藜苜蓿 犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪 豆科苜蓿属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ犕犲犱犻犮犪犵狅 ＸＭ＿００３５９１７８２ ８３
大豆犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓 豆科大豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ犌犾狔犮犻狀犲 ＪＦ４３３９１６ ８１
豌豆犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿 豆科豌豆属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ犘犻狊狌犿 ＫＦ５１６４８５ ８１
大百脉根犔狅狋狌狊狌犾犻犵犻狀狅狊狌狊 豆科百脉根属Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ犔狅狋狌狊 ＡＶ７３０６１７ ７６
啤酒花 犎狌犿狌犾狌狊犾狌狆狌犾狌狊 桑科草属 Ｍｏｒａｃｅａｅ犎狌犿狌犾狌狊 ＨＱ７３４７２２ ７５
甜樱桃犘狉狌狀狌狊犪狏犻狌犿 蔷薇科李属 Ｒｏｓａｃｅａｅ犘狉狌狀狌狊 ＧＵ９３８６８６ ７１
兔眼蓝莓犞犪犮犮犻狀犻狌犿犪狊犺犲犻 杜鹃花科越橘属Ｅｒｉｃａｃｅａｅ犞犪犮犮犻狀犻狌犿 ＡＢ６１０７６８ ７１
图５　犔犃犚氨基酸序列疏水性分析
犉犻犵．５　犜犺犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犺狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔狅犳犔犃犚狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲
　
图６　预测的犔犃犚蛋白保守结构域
犉犻犵．６　犘狌狋犪狋犻狏犲犮狅狀狏犲狉狊犲犱犱狅犿犪犻狀狊狅犳犔犃犚狆狉狅狋犲犻狀
２８１ 草　业　学　报 第２４卷
图７　不同种犔犃犚氨基酸序列比较
犉犻犵．７　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犔犃犚犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狆犲犮犻犲狊
　犗．狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪ｃｖ．ＧＳ：甘肃红豆草（未公布）；犗．狏犻犮犻犻犳狅犾犻犪：红豆草（ＡＥＦ１４４２２）；犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪：蒺藜苜蓿（ＸＰ００３５９１８３０）；犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊：百脉根
（ＡＢＣ７１３３１）；犘．狊犪狋犻狏狌犿：豌豆（ＡＩＩ２６０２４）；犌．犿犪狓：大豆（ＡＭＥ２３９３３）；犔．狌犾犻犵犻狀狅狊狌狊：大百脉根（ＡＡＵ４５３９２）；犘．犪狏犻狌犿：甜樱桃（ＡＤＹ１５３１０）；犞．
犪狊犺犲犻：兔眼蓝莓（ＡＢ６１０７６８）；犎．犾狌狆狌犾狌狊：啤酒花（ＡＥＶ８９９６４１）；Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ：表示一致性序列，并在序列下用小写字母列出；根据保守程度高低依次
使用黑色、红色和蓝色阴影表示。括号中的编号为ＧｅｎＢａｎｋ登录号。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｓａｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄａｒｅｌｉｓｔｅｄｂｅｌｏｗｉｎｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓ．
Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｂｌａｃｋ，ｂｌｕｅａｎｄｒｅｄａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ．ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｓｉｎｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓｉｎｄｉｃａｔｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆＧｅｎＢａｎｋ．
２．６　不同器官ＬＡＲ基因表达和缩合单宁含量
采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ的方法分析ＬＡＲ基因在茎、叶、花、果中的表达情况，结果见图９。半定量结果表明
ＬＡＲ在甘肃红豆草的各个器官中均表达，在叶中表达量最高，其次是花和果，在茎中表达量最低。缩合单宁含量
在器官间的高低变化特征与ＬＡＲ基因表达特征一致（图１０）。
３８１第６期 陈春艳　等：甘肃红豆草无色花青素还原酶ＬＡＲ基因的克隆和表达分析
图８　犔犃犚蛋白与其他物种犔犃犚类蛋白构建的系统进化树
犉犻犵．８　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犔犃犚狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌犪狀犱狅狋犺犲狉狊狆犲犮犻犲狊
　ＧｅｎＢａｎｋ登录号与图７同。ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆＧｅｎＢａｎｋｉｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．７．
３　讨论
图９　甘肃红豆草不同器官犔犃犚表达的半定量犚犜－犘犆犚
犉犻犵．９　犛犲犿犻狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犚犜－犘犆犚狅犳犔犃犚犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狅狉犵犪狀狊狅犳犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌
　
图１０　甘肃红豆草不同器官缩合单宁含量
犉犻犵．１０　犆狅狀犱犲狀狊犲犱狋犪狀狀犻狀狊犮狅狀狋犲狀狋狊犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋
狅狉犵犪狀狊狅犳犗．狏犻犮犻犳狅犾犻犪犮狏．犌犪狀狊狌
　
３．１　甘肃红豆草总ＲＮＡ提取法的改良及其效果评价
目前，对不同物种植物和组织器官提取ＲＮＡ的
方法进行了广泛的研究，已获得一些科学高效的方
法［１８２０］。但是仍然不能满足实际实验过程的需要，表
现出不同种类的植物提取方法和效果差异较大，同一
种植物不同的组织其ＲＮＡ提取方法也需要调整；即
使同一种植物同一组织，因植株基因型不同，ＲＮＡ提
取方法也可能不相同［１８２１］。因此，根据植物组织的特
点，摸索出适合不同植物针对性强的高质量ＲＮＡ提
取方法十分必要。
红豆草在生长过程中积累了诸如缩合单宁、多糖
等大量的次生代谢物。与同科植物紫花苜蓿比较，红
豆草叶片积累更多的缩合单宁［５］。其组织中 ＲＮａｓｅ
的活性也较高，这些因素导致红豆草ＲＮＡ的提取难
度更大。因此，获得高质量的ＲＮＡ成为进行红豆草
分子生物学研究首要需解决的问题。本研究起初尝试
多种商业试剂盒提取红豆草ＲＮＡ，但在提取效果和稳
定性方面都难以满足基因克隆和后续的实验。为此，
对传统的ＣＴＡＢ法进行改良。实验过程中在最初的提取缓冲液中加入４％ＰＶＰ以防止次生代谢物与ＲＮＡ结
合；加入２％β巯基乙醇以减少多酚物质的干扰；利用水饱和酚∶氯仿∶异戊醇抽提以去除ＤＮＡ、蛋白质及叶绿
素、花青素等色素类物质对ＲＮＡ的干扰。通过使用ＬｉＣｌ选择性沉淀ＲＮＡ，使ＲＮＡ与多糖有效分离。将２管
粗提ＲＮＡ合并为１管进行纯化，这样既消除了多酚、次生代谢物及色素的影响，还能弥补纯化过程中ＲＮＡ的损
失，保证了ＲＮＡ的含量，提高其纯度。应用该方法提取的红豆草ＲＮＡ，２８ｓ和１８ｓ条带较清晰，无ＤＮＡ污染，同
时在下游反转录实验中得到成功的应用。改良的ＲＮＡ提取方法简单、有效，所使用药品为普通生化试剂。在提
取的ＲＮＡ效果、质量和价格方面与一般的商业试剂盒相比具有明显的优势，是一种实用的方法。另外，提取纯
化后获得的ＲＮＡ具有稳定性强的特点，可适用于红豆草不同器官ＲＮＡ的提取和下游分子生物学实验。
４８１ 草　业　学　报 第２４卷
３．２　甘肃红豆草ＬＡＲ基因序列和表达分析
植物次生代谢物合成与积累量取决于其合成途径中的限速酶，限速酶在植物次生代谢物生物合成途径中往
往位于代谢支路分叉口或途径的下游。植物缩合单宁合成代谢途径末端酶的无色花青素还原酶（ＬＡＲ）基因克
隆与分析，有助于解析植物次生代谢缩合单宁合成和积累的机制。本研究对ＲＴ－ＰＣＲ克隆的甘肃红豆草ＬＡＲ
基因ｃＤＮＡ片段利用相关软件进行了生物信息学分析，发现其ＬＡＲ基因具备一个完整的开放阅读框架，大小为
１０８９ｂｐ；它属于ＳＤＲ超家族成员，含有ＮＡＤ（Ｐ）结合位点和赖氨酸活性位点（图６）。这与依赖于无色花青素还
原酶催化生成缩合单宁需要ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ参与的研究结果一致［２２］。研究也发现豆科山蚂蝗属植物银叶藤［２２］和蓼
科植物金荞麦［２３］ＬＡＲ蛋白同样含有ＮＡＤ（Ｐ）结合位点和赖氨酸活性位。由此推断该蛋白具有花青素还原酶的
典型的结构特征和生物特性，超量表达可以提高缩合单宁的含量。
甘肃红豆草ＬＡＲ基因全长序列与同属植物已知序列［２４］的相似性高达９８％，与不同属的几种豆科植物的相
似性在７６％～９３％，而与其他科植物的相似性在７５％以下（表２，图７，８），聚类分析表明豆科与非豆科几种植物
明显聚为两类。说明在同源关系相近的植物中ＬＡＲ基因的保守性强，这与其他学者对其他基因在不同物种同
源性分析时的结论一致，即属内同源性高，属间或种间相对低［２５２７］。可见，ＬＡＲ序列在不同种植物间的差异基本
符合植物学分类，在一定程度上反映不同物种的亲缘关系远近。甘肃红豆草ＬＡＲ与其他几种不同属豆科植物
和其他科植物在核酸序列的相似性都存在较大的差异（表２）。可见，ＬＡＲ蛋白在进化上多样性，即它们是由不
同祖先蛋白趋同进化的结果［２６］。
缩合单宁含量高低影响牧草饲用品质和营养价值，同时缩合单宁对于植物具有抗紫外线、抗病、抗虫、清除自
由基等功能。适量地增加牧草中缩合单宁的含量可以减缓反刍动物瘤胃中大量蛋白的快速分解，进而避免形成
过多气体而造成胃和肠道肿大导致的臌胀病。大量研究表明ＬＡＲ基因的表达与缩合单宁的累积有关［１０，１２，２８］。
本研究证实，ＬＡＲ基因在甘肃红豆草的不同器官中均有表达且具有很强的组织特异性，其中在叶中表达量最高，
其次是花和果，在茎中只有微量表达。研究也发现缩合单宁含量在不同器官的变化顺序依次为叶＞花＞果＞茎。
可推断甘肃红豆草ＬＡＲ表达和缩合单宁的合成密切相关。毛白杨ＬＡＲ表达在不同器官差异显示，ＰｔｒＬＡＲ１和
ＰｔｒＬＡＲ３在根中含量最高，其次是茎、成熟叶片，在幼叶和叶柄中含量较低，这也与毛白杨器官间缩合单宁含量
的差异顺序一致［７］。研究也证实葡萄编码无色花色素还原酶的ＶｖＬＡＲ基因通过其组织及时空表达的特异性调
控葡萄果实发育过程中原花色素的种类和积累［１０］。进一步说明编码无色花色素还原酶的ＬＡＲ基因在器官间的
表达量差异较大，具有很强的组织和时空表达的特异性，而且与缩合单宁积累密切相关，也可能影响牧草的产量
和品质［２９］。可见，ＬＡＲ基因在不同器官间表达差异的分子机制的研究也十分必要，这将为调控缩合单宁的积累
提供必要的借鉴。
４　结论
以甘肃红豆草为材料，采用常规ＣＴＡＢ法提取总ＲＮＡ后，增加总ＲＮＡ粗提物的纯化步骤，得到高质量的
总ＲＮＡ。以获得的总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆无色花青素还原酶ＬＡＲ基因。获得的ＬＡＲ基因与已
发表的ＬＡＲ基因具有９８．３４％的相似性，其开放阅读框长为１０８９ｂｐ，编码３６２个氨基酸残基；预测编码的蛋白
质具有典型的苯（基）吡喃酮苄基醚还原酶的特征结构域，含有ＮＡＤ（Ｐ）结合位点和赖氨酸活性位点。注册该基
因到ＧｅｎＢａｎｋ中，注册号为ＫＰ０１３６２３。表达分析发现，ＬＡＲ基因在甘肃红豆草叶中表达量最高，其次是花和
果，茎中表达量最低，这与器官间缩合单宁含量的变化规律一致，推测ＬＡＲ表达与缩合单宁器官间的积累差异
有关。这些成果的取得为红豆草种质资源改良提供理论支持和技术保障，也为利用转基因技术提高紫花苜蓿叶
片缩合单宁的含量，以改善紫花苜蓿品质、培育抗臌胀病苜蓿新品质提供理论依据。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＣｈｅｎＢＳ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｙｉｅｌｄａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎｉｎｓａｉｎｆｏｉｎ．ＧｒａｓｓｌａｎｄｏｆＣｈｉｎａ，１９８３，（２）：３６３８．
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