全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４３１２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
杨晓丹，原现军，郭刚，崔棹茗，李君风，白晰，巴桑，邵涛．西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选．草业学报，２０１５，２４（６）：９９１０７．
ＹａｎｇＸＤ，ＹｕａｎＸＪ，ＧｕｏＧ，ＣｕｉＺＭ，ＬｉＪＦ，ＢａｉＸ，ＢａＳ，ＳｈａｏＴ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏｌｅｒａｎｔｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍ
ｌｅｇｕｍｅｓｉｌａｇｅｓｉｎＴｉｂｅｔ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（６）：９９１０７．
西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选
杨晓丹１，原现军１，郭刚１，２，崔棹茗１，李君风１，白晰１，巴桑３，邵涛１
（１．南京农业大学，饲草调制加工与贮藏研究所，江苏 南京２１００９５；２．山西农业大学动物科学技术学院，山西 太谷０３０８０１；
３．西藏日喀则地区草原工作站，西藏 日喀则８５７０００）
摘要：本研究对西藏地区豆科牧草青贮饲料中的乳酸菌进行分离、鉴定，以期得到优良的乳酸菌菌株。以苜蓿和箭
薚豌豆青贮饲料为试验材料，共分离得到６株同型发酵乳酸菌，经传统微生物培养和１６ＳｒＲＮＡ序列分析，３株
（ＬＣＧ９，ＣＧ３５和ＡＧ１１）为戊糖片球菌，２株（ＬＣＧ３和ＬＡＧ１）为植物乳杆菌，１株（ＬＡ３）为弯曲乳杆菌；除ＡＧ１１和
ＬＡＧ１在５℃，ＬＣＧ９和ＡＧ１１在ｐＨ３．０和８．０生长微弱外，其余乳酸菌菌株均在５～２０℃，ｐＨ３．０～８．０及３．０％
和６．５％ ＮａＣｌ培养液中生长良好。从耐低温特性、产酸能力和发酵速率３个指标考虑，植物乳杆菌ＬＣＧ３最适宜
用于西藏青贮饲料生产的乳酸菌菌种。
关键词：豆科牧草；青贮饲料；乳酸菌；分离；鉴定　　
犐狊狅犾犪狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狋狅犾犲狉犪狀狋犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪犳狉狅犿
犾犲犵狌犿犲狊犻犾犪犵犲狊犻狀犜犻犫犲狋
ＹＡＮＧＸｉａｏＤａｎ１，ＹＵＡＮＸｉａｎＪｕｎ１，ＧＵＯＧａｎｇ１，２，ＣＵＩＺｈａｏＭｉｎｇ１，ＬＩＪｕｎＦｅｎｇ１，ＢＡＩＸｉ１，ＢＡＳａｎｇ３，
ＳＨＡＯＴａｏ１
１．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犈狀狊犻犾犻狀犵犪狀犱犘狉狅犮犲狊狊犻狀犵狅犳犌狉犪狊狊，犖犪狀犼犻狀犵犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犖犪狀犼犻狀犵２１００９５，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻
犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲，犛犺犪狀狓犻犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犜犪犻犵狌０３０８０１，犆犺犻狀犪；３．犜犺犲犘狉犪犻狉犻犲犠狅狉犽狊狋犪狋犻狅狀狅犳犛犺犻
犵犪狋狊犲，犜犻犫犲狋，犚犻犽狕犲８５７０００，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｄｅｓｉｒａｂｌｅａｔｔｒｉｂｕｔｅｓｂｙｉｓｏｌａｔｉｎｇ
ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ（ＬＡＢ）ｆｒｏｍｌｅｇｕｍｅｓｉｌａｇｅｓｉｎＴｉｂｅｔａｎＰｌａｔｅａｕ．Ａｔｏｔａｌｏｆ６ｈｏｍｏｆｅｒｍｅｎｔｉａ
ｔｉｖｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）ａｎｄｃｏｍｍｏｎｖｅｔｃｈ（犞犻犮犻犪狊犪狋犻狏犪）ｓｉｌａｇｅ．
ＳｔｒａｉｎｓＬＣＧ９，ＣＧ３５ａｎｄＡＧ１１ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犘犲犱犻狅犮狅犮犮狌狊狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊，ｓｔｒａｉｎｓＬＣＧ３ａｎｄＬＡＧ１ａｓ犔犪犮狋狅
犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犪狀狋犪狉狌犿ａｎｄｓｔｒａｉｎＬＡ３ａｓ犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犮狌狉狏犪狋狌．Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ
１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｇｒｏｗｎｉｎａ
ｒａｎｇｅｏｆｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５－２０℃，ｐＨ３．０－８．０ａｎｄＮａＣｌ３．０％ａｎｄ６．５％．ＬＣＧ９ａｎｄＡＧ１１ｇｒｅｗ
ｗｅａｋｌｙａｔ５℃ ｗｈｉｌｅＬＣＧ９ａｎｄＡＧ１１ｗｅｒｅｉｎａｃｔｉｖｅａｔｐＨ３．０ａｎｄｐＨ８．０．ＬＣＧ３ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｔｈｅｂｅｓｔ
ｓｔｒａｉｎｔｏｕｓｅａｓａｓｉｌａｇｅａｄｄｉｔｉｖｅｉｎＴｉｂｅｔｄｕｅｔｏｉｔｓｕｎｉｑｕｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｈｉｇｈｌａｃｔｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎａｎｄｒａｐｉｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｒａｔｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｌｅｇｕｍｅｇｒａｓｓ；ｓｉｌａｇｅ；ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
第２４卷　第６期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年６月
Ｊｕｎｅ，２０１５
收稿日期：２０１４０７１４；改回日期：２０１４１０２１
基金项目：中国科学院科技服务网络计划（ＳＴＳ计划）（ＫＦＪＥＷＳＴＳ０７１），国家星火计划项目课题（２０１３ＧＡ８４０００３），“十二五”国家科技支撑计
划（２０１１ＢＡＣ０９Ｂ０３）和农业部成果转化项目（２０１３ＧＢ２Ｆ４００４６）资助。
作者简介：杨晓丹（１９９０），女，河南洛阳人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｙｘｄ６９５１１４９５７＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｔａｏｓｈａｏｌａｎ＠１６３．ｃｏｍ
西藏自治区是我国五大牧区之一，畜牧业是西藏农业经济的主导产业。但是青藏高原平均海拔高达４０００
ｍ，自然气候条件恶劣，寒冷季节长达７～９个月，导致牧草生长期短，季节性饲草不平衡，畜牧业生产陷入“夏肥、
秋壮、冬瘦、春死”的恶性循环。为了满足牧区反刍家畜冬春季节对饲草料的需求，将农区富余的牧草及农作物秸
秆调制成优质青贮饲料是解决牧区畜牧业发展困境的有效途径之一［１３］。
青贮原料中乳酸菌的种类、数量及活性是影响青贮饲料发酵品质的重要因素，早期的研究［４］发现在西藏青贮
饲料生产中，添加商品乳酸菌制剂未能有效地改善青贮饲料的发酵品质，可能是由于商品乳酸菌制剂适宜生长温
度在３０℃左右，难以适应西藏高海拔、低温和缺氧的极端气候条件，其性能发挥受到了限制。因此发掘和利用青
藏高原特有的本土乳酸菌种质资源，发挥其适应性强的特性，对于该地区优质青贮饲料的生产，促进畜牧业的发
展具有重要意义。
近年来，国内外有关牧草中附着乳酸菌或青贮饲料中乳酸菌的收集、分离、鉴定及其在青贮饲料生产中的应
用备受关注。大部分研究结果表明［５１０］，青贮饲料中分离得到的优良乳酸菌均能明显改善青贮发酵品质；部分异
型乳酸菌还能抑制青贮饲料有氧暴露期间的腐败变质，提高其有氧稳定性。有关研究报道［２］，在我国高海拔、低
温和缺氧的极端环境中进行牧草青贮时能够得到优质青贮饲料，几乎没有有氧腐败现象发生，由此可以推测在我
国青藏高原地区存在着适应于极端环境的特殊乳酸菌种质资源。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）和箭薚豌豆（犞犻犮犻犪狊犪狋犻狏犪）是西藏主要的栽培豆科牧草，具有适应性强、适口性
好、蛋白质含量及营养价值高等特点，经常与禾本科牧草以混合青贮方式生产青贮饲料。本研究旨在从西藏豆科
牧草青贮饲料中分离生物学特性优良的乳酸菌菌株，从而为西藏青贮饲料添加剂的研发和应用奠定基础。
１　材料与方法
１．１　样品采集
紫花苜蓿和箭薚豌豆种植于西藏日喀则地区草原工作站试验田（平均海拔３８３６ｍ，北纬２９°１６′，东经
８８°５１′）；该地区属于高山亚寒带半干旱季风气候，年均降雨量为４２２．４ｍｍ，气温６．３℃，日照时数３２３３ｈ。紫花
苜蓿和箭薚豌豆均处于结荚期，于２０１３年９月２８日刈割，刈割后在田间用铡刀切成２ｃｍ左右，装填至实验室青
贮窖中压实密封，置于室温条件下保存，分别在青贮第５天，４５ｄ时开窖取样，对青贮饲料中乳酸菌进行分离鉴
定。紫花苜蓿和箭薚豌豆青贮５和４５ｄ各５个重复，共计２０个青贮窖；实验室青贮窖，为容积２Ｌ的圆柱状塑料
容器，有内外两层盖，便于密封保存。
１．２　培养基，试剂及主要仪器设备
葡萄糖酵母蛋白胨（ＧＹＰ）培养基和 ＭＲＳ培养基参考Ｃａｉ等［６］的方法配制，营养琼脂培养基，虎红琼脂培养
基购自南京寿德试验器材有限公司。
ＡＰＩＣＨＬ培养基和ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条购自法国ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ公司，ＤＮＡ提取试剂盒购自北京天根生物科
技有限公司，ＰＣＲ合成引物由上海英潍捷基生物科技有限公司合成。
主要仪器设备：恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜（ＯＬＭＰＵＳ）、立式压力蒸汽灭菌器、ＰＣＲ仪、超低温冰
箱、凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计（日立，Ｕ２９１０）、ｐＨ计（ＨＡＮＮＡｐＨ２１１型）。
１．３　原材料的微生物成分分析
采用平板培养方法进行微生物计数，在超净工作台中采用四分法取原材料样品１０ｇ，放入９０ｍＬ的无菌生
理盐水密封，置于常温摇床上摇动２ｈ。用无菌生理盐水适当稀释，取３个适宜梯度涂板，每个梯度２个平行。乳
酸菌选用 ＭＲＳ培养基，好氧菌选用营养琼脂培养基，霉菌和酵母菌选用虎红琼脂培养基，置于３５℃恒温培养箱
中培养２～３ｄ计数。
１．４　乳酸菌的分离与纯化
分别取青贮５和４５ｄ后的青贮饲料同上述步骤进行稀释，选用ＧＹＰ培养基进行乳酸菌的分离培养，挑选具
有黄色透明环的菌株分离，在 ＭＲＳ固体培养基上划线培养，３５℃２～３ｄ，重复划线分离培养３次，得到纯化的单
菌株。然后根据菌落的颜色、大小、光泽、形状等选取典型菌株进行革兰氏染色，油镜镜检，过氧化氢酶试验；凡是
００１ 草　业　学　报 第２４卷
革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌菌株［２］，在 ＭＲＳ液体培养基中富集（３５℃２４ｈ）后加
入等体积４０％的甘油，分装，－２０℃保存，备用。
１．５　乳酸菌的生理生化特性检测
１．５．１　不同温度水平生长试验　　将配制好的 ＭＲＳ培养液以每试管５ｍＬ的量分装好，在１２１℃高压条件下
灭菌１５ｍｉｎ，将待测菌株培养液，以相同的接种量（０．１ｍＬ）接入培养液中摇匀，塞子封口，分别置于５，１０，１５和
２０℃恒温培养箱中培养，其中５和１０℃培养５～７ｄ，其余培养３～５ｄ，观察菌株的生长情况。
１．５．２　不同ｐＨ和盐浓度水平生长试验　　用盐酸或氢氧化钠将ＭＲＳ培养液ｐＨ调至３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，
７．５和８．０等７个水平，用分析纯ＮａＣｌ将 ＭＲＳ培养液的盐浓度调至３．０％和６．５％两个水平，同上述步骤，将待
测菌株培养液以相同的接种量（０．１ｍＬ）接入已灭菌培养液中，置于３５℃恒温培养箱培养２ｄ后，观察试验菌株
的耐酸碱能力。
１．５．３　糖发酵试验　　使用包含４９种不同碳水化合物和一个对照的ＡＰＩ５０ＣＨＬ进行不同糖，醇发酵鉴定，在
３５℃条件下培养４８ｈ后测定发酵结果。具体方法按照试剂盒的说明进行。
１．６　乳酸菌菌株的１６ＳｒＲＮＡ序列测定
取３０℃条件下培养１２ｈ的培养液各１ｍＬ，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀物用于ＤＮＡ提取，具体的操作方
法严格按照试剂盒说明进行。ＰＣＲ选用细菌１６ＳｒＲＮＡＶ３区通用引物：２７ｆ（５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴ
ＣＡＧ３′）和１４９２ｒ（５′ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴ３′）。ＰＣＲ反应体系包括：２×ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ，引物各２
μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２０μＬ。ＰＣＲ反应程序为：预变性，９４℃，５ｍｉｎ；变性，９４℃，３０ｓ；退火，５５℃，３０ｓ；延
伸，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循环。ＰＣＲ纯化产物送样测序（上海英潍捷基生物科技有限公司）。
用ＢＬＡＳＴ将所测定菌株的１６ＳｒＲＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ数据库中已知细菌的１６ＳｒＲＮＡ序
列进行比对，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，分析相似性。然后用 ＭＥＧＡ６．０中的
ＣｌｕｓｔａｌＷ 对最近类群的序列进行多重比较分析，并通过该软件的邻近法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统发育树，分
支聚类的稳定性用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ方法进行２０００次随机重复取样评价［２］。
１．７　优良乳酸菌菌株的筛选与确定
将分离并鉴定的菌株以３％的接种量接入已灭菌的 ＭＲＳ液体培养基中，于３５℃恒温培养箱中培养４８ｈ；每
隔４ｈ取１次样品，测定培养液的ｐＨ值，以培养时间为横坐标，ｐＨ 值为纵坐标，绘制生长曲线；用培养液做空
白，在波长６００ｎｍ下测定样品的吸光度值（ＯＤ值），以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。
２　结果与分析
２．１　微生物计数
试验用紫花苜蓿和箭薚豌豆原材料中微生物成分
如表１所示。乳酸菌的数量较少，均为１０３ｃｆｕ／ｇＦＷ，
霉菌数量为１０４ｃｆｕ／ｇＦＷ；箭薚豌豆中好氧菌的数量
多于紫花苜蓿，达到３．２×１０７ｃｆｕ／ｇＦＷ，但酵母数量
低于紫花苜蓿，只有３．０×１０３ｃｆｕ／ｇＦＷ。
２．２　乳酸菌的分离
挑选ＧＹＰ培养基上具有黄色溶菌环的菌株分
离，初步分离出８６株乳酸菌菌株进行革兰氏染色、镜
检、过氧化氢酶试验、通过不同温度、不同ｐＨ 和耐盐
性试验的比较，分离得到２４株耐低温、低ｐＨ的乳酸
表１　苜蓿和箭薚豌豆微生物分析
犜犪犫犾犲１　犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犪犾犳犪犾犳犪
犪狀犱犮狅犿犿狅狀狏犲狋犮犺
青贮材料Ｓａｍｐｌｅｓ
微生物计数Ｃｏｕｎｔｓｏｆｖｉａｂｌｅ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ｃｆｕ／ｇＦＷ）
乳酸菌
Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ
ｂａｃｔｅｒｉａ
好氧菌
Ａｅｒｏｂｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ
霉菌
Ｍｏｌｄ
酵母
Ｙｅａｓｔ
箭薚豌豆Ｃｏｍｍｏｎｖｅｔｃｈ ５．１×１０３ ３．２×１０７ ５．０×１０４ ３．０×１０３
紫花苜蓿Ａｌｆａｌｆａ ６．７×１０３ １．１×１０６ ２．０×１０４ ３．６×１０５
　ｃｆｕ：Ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ；ＦＷ：鲜重Ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ．
菌菌株，再对其进行生长产酸试验，共得到６株生长迅速、产酸快的优良乳酸菌菌株。菌株来源如表２所示：苜蓿
青贮饲料共分离得到３株乳酸菌菌株，早期分离得到ＡＧ１１，晚期分离得到ＬＡＧ１和ＬＡ３；ＣＧ３５来自发酵５ｄ箭
薚豌豆青贮饲料，ＬＣＧ３和ＬＣＧ９分离于发酵４５ｄ的箭薚豌豆青贮饲料。
１０１第６期 杨晓丹　等：西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选
２．３　乳酸菌的生理生化特性
乳酸菌的表型特征及生理特点如表３所示。６株
乳酸菌菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、同型发
酵乳酸菌，其中ＬＣＧ９，ＣＧ３５和 ＡＧ１１为乳酸球菌；
ＬＡＧ１，ＬＡ３和 ＬＣＧ３为乳酸杆菌。ＡＧ１１和 ＬＡＧ１
在５℃生长微弱，１０～２０℃生长旺盛；其余乳酸菌菌株
均能在５～２０℃范围内表现出很强的生长活力。不同
ｐＨ值和盐浓度条件下的生长情况为：除 ＬＣＧ９和
ＡＧ１１在ｐＨ３．０，ｐＨ８．０条件下生长微弱外，其余乳
酸菌菌株均能在ｐＨ值为３．０，３．５，４．０，４．５，５．０，７．５
和８．０内生长；所有乳酸菌菌株在３．０％和６．５％ＮａＣｌ
条件下生长旺盛，表明分离出的乳酸菌菌株具有耐低
温、耐酸碱和强的耐盐特性。
乳酸菌菌株的糖发酵试验结果如表４所示：６株
乳酸菌菌株均能利用核糖，半乳糖，Ｄ葡萄糖，Ｄ果
糖，Ｄ甘露糖，Ｎ乙酰葡萄糖胺，熊果苷，七叶灵，麦芽
糖和海藻糖产酸。除ＬＡ３外，其余乳酸菌菌株均可利
用Ｌ阿拉伯糖，苦杏仁甙，纤维二糖和龙胆二糖，微弱
利用葡萄糖酸盐。从利用Ｄ松二糖和山梨醇的情况
来看，ＬＡＧ１，ＬＣＧ３和ＬＡ３可以利用其发酵产酸，但
ＬＣＧ９，ＣＧ３５ 和 ＡＧ１１ 不能；除此之外，ＬＡＧ１ 和
ＬＣＧ３能够发酵甘露醇，α甲基Ｄ甘露糖苷，水杨苷，
乳糖，蜜二糖，蔗糖，松三糖和Ｄ棉籽糖，而其余乳酸
菌菌株不能。
２．４　分离乳酸菌菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析
结合图１系统进化树和表５分离乳酸菌菌株的
１６ＳｒＲＮＡ序列分析结果可知：ＬＣＧ９，ＣＧ３５和ＡＧ１１
与戊糖片球菌（犘犲犱犻狅犮狅犮犮狌狊狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊）的进化亲缘
度均为１００％，ＬＡ３与弯曲乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊犮狌狉
狏犪狋狌狊）为９７％，与对应标准菌序列相似性分别为
１００％，１００％，１００％和９９．９％；因此，ＬＣＧ９、ＣＧ３５和
ＡＧ１１被准确地鉴定为戊糖片球菌，ＬＡ３为弯曲乳杆
菌。ＬＡＧ１ 和 ＬＣＧ３ 与植物乳杆菌 （犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊
狆犾犪狀狋犪狉狌犿）和戊糖乳杆菌（犘犲犱犻狅犮狅犮犮狌狊狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌）
处于同一族群，进化亲缘度达到１００％，并具有９９．９％
的序列相似性，故只通过１６ＳｒＲＮＡ序列比较，无法确
表２　青贮饲料中分离的乳酸菌菌株
犜犪犫犾犲２　犐狊狅犾犪狋犲犱犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪犳狉狅犿狊犻犾犪犵犲
青贮饲料
Ｓｉｌａｇｅｓａｍｐｌｅ
发酵时间
Ｅｎｓｉｌｉｎｇｔｉｍｅ（ｄ）
菌株名称
Ｓｔｒａｉｎｎａｍｅ
苜蓿Ａｌｆａｌｆａ ５ ＡＧ１１
４５ ＬＡＧ１，ＬＡ３
箭薚豌豆 Ｃｏｍｍｏｎ
ｖｅｔｃｈ
５ ＣＧ３５
４５ ＬＣＧ３，ＬＣＧ９
表３　青贮饲料中分离出的乳酸菌的特性
犜犪犫犾犲３　犆犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪犳狉狅犿狊犻犾犪犵犲
特性Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ＬＣＧ９ ＣＧ３５ ＡＧ１１ ＬＡＧ１ ＬＣＧ３ ＬＡ３
菌形状Ｓｈａｐｅ 球菌
Ｃｏｃｃｕｓ
球菌
Ｃｏｃｃｕｓ
球菌
Ｃｏｃｃｕｓ
杆菌
Ｂａｃｉｌｕｓ
杆菌
Ｂａｃｉｌｕｓ
杆菌
Ｂａｃｉｌｕｓ
发酵类型
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｙｐｅ
Ｈｏｍｏ Ｈｏｍｏ Ｈｏｍｏ Ｈｏｍｏ Ｈｏｍｏ Ｈｏｍｏ
革兰氏染色
Ｇｒａｍｓｔａｉｎ
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
过氧化氢酶促
Ｃａｔａｌａｓｅ
－ － － － － －
葡萄糖产气
Ｇａｓｆｒｏｍｇｌｕｃｏｓｅ
－ － － － － －
５℃ ＋ ＋ Ｗ Ｗ ＋ ＋
１０℃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１５℃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
２０℃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ｐＨ３．０ Ｗ ＋ Ｗ ＋ ＋ ＋
ｐＨ３．５ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ｐＨ４．０ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ｐＨ４．５ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ｐＨ５．０ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ｐＨ７．５ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
ｐＨ８．０ Ｗ ＋ Ｗ ＋ ＋ ＋
３．０％ ＮａＣｌ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
６．５％ ＮａＣｌ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
　注：“＋”阳性，“－”阴性；“Ｗ”弱阳性。
　Ｎｏｔｅ：“＋”ｐｏｓｉｔｉｖｅ，“－”ｎｅｇａｔｉｖｅ，“Ｗ”ｗｅａｋｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅ．
定他们的种族。ＬＣＧ９，ＣＧ３５，ＡＧ１１，ＬＡＧ１，ＬＣＧ３和ＬＡ３在基因库中的登录号分别为：ＫＪ８０６２９６，ＫＪ８０６３０５，
ＫＪ８０６３０９，ＫＪ８０６２９５，ＫＪ８０９２９９和ＫＪ８０６３０６。
２．５　分离的乳酸菌菌株的产酸及生长特性
分离乳酸菌菌株的产酸速率曲线如图２所示，ＬＡＧ１和ＬＣＧ３的产酸速率最快，它们在０～８ｈ产酸迅速，
８～１２ｈ逐渐变缓，１２ｈ以后趋于平稳。其中ＬＣＧ３早期产酸最快，培养１２ｈ后，培养液ｐＨ降至３．９；１６ｈ之后
２０１ 草　业　学　报 第２４卷
与ＬＡＧ１表现出相似的产酸速率。ＬＣＧ９，ＣＧ３５，ＡＧ１１和ＬＡ３在整个发酵过程中培养液ｐＨ值保持持续缓慢的
下降趋势，在发酵结束４８ｈ时分别达到最低值３．８２（ＬＣＧ９），３．８３（ＣＧ３５），３．９１（ＡＧ１１）和３．９５（ＬＡ３），ｐＨ值均
达到４以下，同样具备较强的产酸能力。
表４　分离出乳酸菌的糖发酵特性
犜犪犫犾犲４　犛狌犵犪狉犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狆狉狅犳犻犾犲狊狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪犳狉狅犿狊犻犾犪犵犲
特性Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ＬＣＧ９ ＣＧ３５ ＡＧ１１ ＬＡＧ１ ＬＣＧ３ ＬＡ３
赤藓糖醇Ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ － － － Ｗ － －
Ｄ阿拉伯糖 Ｄａｒａｂｉｎｏｓｅ － － － － － －
Ｌ阿拉伯糖Ｌａｒａｂｉｎｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋ －
核糖 Ｒｉｂｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
半乳糖 Ｇａｌａｃｔｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
Ｄ葡萄糖 Ｄｇｌｕｃｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
Ｄ果糖 Ｄｆｒｕｃｔｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
Ｄ甘露糖 Ｄｍａｎｎｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ － － － ＋＋ ＋＋ －
山梨醇Ｓｏｒｂｉｔｏｌ － － － ＋＋ ＋＋ ＋＋
α甲基Ｄ甘露糖苷αｍｅｔｈｙｌＤｍａｎｎｏｓｉｄｅ － － － ＋＋ ＋＋ －
Ｎ乙酰葡萄糖胺 Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
苦杏仁甙 Ａｍｙｇｄａｌｉｎ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ －
熊果苷 Ａｒｂｕｔｉｎ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
七叶灵Ｅｓｃｕｌｉｎ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
水杨苷Ｓａｌｉｃｉｎ ＋ － ＋ ＋＋ ＋＋ ＋
纤维二糖Ｃｅｌｏｂｉｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ －
麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ － － － ＋＋ ＋＋ －
蜜二糖 Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ － － － ＋＋ ＋＋ －
蔗糖Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ － － － ＋＋ ＋＋ －
海藻糖 Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
松三糖 Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ － － － ＋＋ ＋＋ －
Ｄ棉籽糖 Ｄｒａｆｆｉｎｏｓｅ － － － ＋＋ ＋＋ －
龙胆二糖 Ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ －
Ｄ松二糖 Ｄｔｕｒａｎｏｓｅ － － － ＋＋ ＋＋ ＋＋
葡糖酸盐 Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ Ｗ Ｗ Ｗ Ｗ Ｗ －
　注：“＋”生长，“＋＋”生长良好，“－”不生长，“Ｗ”微弱生长。
　Ｎｏｔｅ：“＋”ｇｒｏｗｔｈ，“＋＋”ｇｒｏｗｔｈｗｅｌ，“－”ｎｏｎｇｒｏｗｔｈ，“Ｗ”ｇｒｏｗｔｈｗｅａｋｌｙ．
不同菌株的生长速率曲线见图３，分离乳酸菌菌株的生长特性均为对数生长曲线；ＬＣＧ３和ＬＡＧ１在发酵过
程中没有明显的迟滞期，培养０～２ｈ开始进入对数生长期，２～８ｈ生长速度达到最快，８～１０ｈ开始进入稳定期，
１６ｈＯＤ值分别达到２．５１２和２．３８２；在整个培养过程中，ＬＣＧ３的生长速度最快，这一结果与产酸速率结果基本
一致。ＬＣＧ９，ＣＧ３５，ＡＧ１１和ＬＡ３生长速率较缓慢，早期培养迟缓期长，但后期培养基中细胞浓度较高，２０ｈ后
ＯＤ值分别为２．２０３（ＬＣＧ９），２．１８５（ＣＧ３５），２．１１４（ＡＧ１１）和２．１８５（ＬＡ３），也表现出良好的生长特性。
３　讨论
乳酸菌数量和活性是抑制不良微生物生长和减少发酵损失的一个重要因素，发酵品质取决于青贮材料上初
始乳酸菌数量和底物含量［８］。但自然条件下，植物本身附着的乳酸菌数量较低，而且主要为异型乳酸菌［９］，难以
３０１第６期 杨晓丹　等：西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选
保证青贮发酵品质。Ｐａｎｇ等［１１］曾报道：保证青贮发酵成功的最低乳酸菌数量为１０５ｃｆｕ／ｇＦＷ，本试验中，西藏
地区箭薚豌豆和紫花苜蓿表面附着乳酸菌的数量均小于１０４ｃｆｕ／ｇＦＷ，不能满足青贮发酵的最低需求。因此在
西藏进行青贮饲料生产时，仅靠材料上附着的乳酸菌进行乳酸发酵，来获得优质青贮饲料较为困难。这样，分离
青贮饲料中生长迅速、耐酸能力强的优良乳酸菌菌株显得尤为重要。
图１　乳酸菌菌株犔犆犌９，犆犌３５，犃犌１１，犔犃犌１，犔犆犌３和犔犃３及相关菌种进化树
犉犻犵．１　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狊犺狅狑犻狀犵狋犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲狆狅狊犻狋犻狅狀狊狅犳狊狋狉犪犻狀狊犔犆犌９，犆犌３５，犃犌１１，犔犃犌１，犔犆犌３，犔犃３犪狀犱狉犲犾犪狋犲犱狊狆犲犮犻犲狊
犪狊犻狀犳犲狉狉犲犱犫狔狋犺犲狀犲犻犵犺犫狅狉犼狅犻狀犻狀犵犿犲狋犺狅犱狑犻狋犺１６犛狉犚犖犃犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊
在自然青贮过程中，环境温度是影响乳酸菌活性的重要因素［１２］。Ｃａｏ等［１３］在对不同季节的发酵ＴＭＲ进行
研究后发现，冬季的低温条件限制了乳酸发酵。青藏高原具有海拔高，气温低，昼夜温差大等气候特点，可能会抑
制商品乳酸菌的生长及活性的发挥。Ｌｉｕ等［１４］研究发现：商品乳酸菌在２０℃条件下生长活性会受到影响，不能
很好地发挥作用。但本研究所分离得到的６株乳酸菌均具有较强的耐低温特性，能够在５℃条件下生长，在１０℃
时生长旺盛；其中ＬＣＧ９，ＣＧ３５，ＬＣＧ３和ＬＡ３的耐低温能力较强，在５℃条件下仍生长旺盛。体现了高寒环境分
离的乳酸菌对低温条件具有强的适应特性。
４０１ 草　业　学　报 第２４卷
表５　分离出的乳酸菌菌株１６犛狉犚犖犃基因序列分析
犜犪犫犾犲５　犚犲狊狌犾狋狅犳１６犛狉犚犖犃犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳狋犺犲犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪
菌株及编号
Ｓｔｒａｉｎａｎｄ
ｎｕｍｂｅｒ
基因库登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ
近源种
Ｃｌｏｓｅｓｔｒｅｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎ
与Ｇｅｎｂａｎｋ中近源种的相似性
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｃｌｏｓｅｓｔｄｅｓｃｒｉｂｅｄ
ｓｐｅｃｉｅｓｉｎＧｅｎｂａｎｋ（％）
ＬＣＧ９ ＫＪ８０６２９６ 戊糖片球菌ＡＴＣＣ２５７４５犘．狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊ＡＴＣＣ２５７４５ １００
ＣＧ３５ ＫＪ８０６３０５ 戊糖片球菌ＡＴＣＣ２５７４５犘．狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊ＡＴＣＣ２５７４５ １００
ＡＧ１１ ＫＪ８０６３０９ 戊糖片球菌ＡＴＣＣ２５７４５犘．狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊ＡＴＣＣ２５７４５ １００
ＬＡＧ１ ＫＪ８０６２９５ 植物乳杆菌ＪＣＭ１１４９犔．狆犾犪狀狋犪狉狌犿ＪＣＭ１１４９ ９９．９
戊糖乳杆菌１２４２犔．狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊１２４２ ９９．８
ＬＣＧ３ ＫＪ８０９２９９ 植物乳杆菌ＪＣＭ１１４９犔．狆犾犪狀狋犪狉狌犿ＪＣＭ１１４９ １００
戊糖乳杆菌１２４２犔．狆犲狀狋狅狊犪犮犲狌狊１２４２ ９９．９
ＬＡ３ ＫＪ８０６３０６ 弯曲乳杆菌 ＤＳＭ２００１９犔．犮狌狉狏犪狋狌狊ＤＳＭ２００１９ ９９．９
图２　乳酸菌的酸产生速率
犉犻犵．２　犃犮犻犱狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪
　
图３　乳酸菌的生长曲线
犉犻犵．３　犌狉狅狑狋犺犮狌狉狏犲狅犳犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犫犪犮狋犲狉犻犪
　
ＭｃＤｏｎａｌｄ等［８］归纳总结了作为理想的青贮接种菌必须满足的条件为：１）生长旺盛，能够竞争植物本身所附
着的各种菌群；２）为同型发酵乳酸菌，能在尽量短的时间内产生大量乳酸；３）耐酸，能迅速降低ｐＨ值，４）可广泛
地利用各种可溶性糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、果聚糖，尤其是戊糖等。本试验所分离得到的６株乳酸菌菌株均为
同型发酵乳酸菌；生长速度快、产酸能力强，能迅速降低ｐＨ值；具有较强的耐酸特性，能够在ｐＨ３．０条件下生
长，ｐＨ３．５时生长旺盛；均满足理想青贮接种剂的条件。其中ＬＣＧ３和ＬＡＧ１的产酸能力最强，但由于ＬＡＧ１
在５℃条件下生长微弱，而ＬＣＧ３生长旺盛，因此ＬＣＧ３最适宜于用作西藏地区青贮饲料生产用乳酸菌添加剂菌
种。但其余乳酸菌菌株在１０℃条件下生长能力强，培养４８ｈ后培养液ｐＨ均降至４．０以下，ＯＤ值达到２．２左
右，同样具有制备乳酸菌添加剂的潜质。
根据１６ＳｒＲＮＡ序列分析和系统进化树，ＬＣＧ９，ＣＧ３５和ＡＧ１１被准确地鉴定为戊糖片球菌；ＬＡ３为弯曲乳
杆菌。由图１可知：ＬＡＧ１和ＬＣＧ３与植物乳杆菌和戊糖乳杆菌处于同一族群，且进化亲缘度为１００％；其中
ＬＣＧ３与植物乳杆菌，戊糖乳杆菌的序列相似性分别为１００．０％和９９．９％；ＬＡＧ１分别为９９．９％和９９．８％。许多
研究结果表明［１５１８］：植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的１６ＳｒＲＮＡ序列只有２ｂｐ的差别，表现出很高的序列相似性，故
无法确定种族。结合伯杰氏细菌鉴定手册和其他研究结果［１９］：戊糖乳杆菌可以利用Ｌ阿拉伯糖，Ｄ木糖和鼠李
糖产酸，植物乳杆菌不利用鼠李糖产酸；Ｅｎｎａｈａｒ等［１６］曾指出：植物乳杆菌能够利用松三糖，Ｄ棉籽糖和α甲基
Ｄ甘露糖苷发酵产酸，但戊糖乳杆菌不能。ＬＣＧ３和ＬＡＧ１能利用松三糖，Ｄ棉籽糖，α甲基Ｄ甘露糖苷和Ｌ阿
拉伯糖发酵产酸，但不利用鼠李糖和Ｄ木糖，故被准确地鉴定为植物乳杆菌。
５０１第６期 杨晓丹　等：西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选
本试验分离得到的植物乳杆菌、戊糖片球菌和弯曲乳杆菌均为青贮用常见乳酸菌菌种，这为制备优良的青贮
饲料添加剂提供了可能。对于分离所得的乳酸菌菌株能否很好地作为西藏及其他低温地区青贮用乳酸菌添加剂
以及如何确定添加剂量，还需要在后续试验中做进一步的研究。
４　结论
本研究从西藏地区豆科牧草青贮饲料中分离得到６株优良乳酸菌菌株。经过糖发酵试验和１６ＳｒＲＮＡ序列
分析，３株为戊糖片球菌，２株为植物乳杆菌，１株为弯曲乳杆菌。６株乳酸菌菌株均为同型发酵乳酸菌，具有耐低
温，耐酸碱，强的耐盐特性，其中植物乳杆菌ＬＣＧ３产酸能力最强，发酵速度最快，最适宜于用作青藏高原青贮饲
料生产用乳酸菌添加剂。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＱｉｎＹ，ＬｉＸＺ，ＪｉａｎｇＷＱ，犲狋犪犾．ＡｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｎｕｔｒｉｔｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎｄｔｙｐｅｓｉｎＴｉｂｅｔｍａｉｎｃｒｏｐｓｔｒａｗｓａｎｄｐａｓｔｕｒｅｓ．
ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１０，１９（５）：１２２１２９．
［２］　ＹａｎｇＹ，ＳｈｉＣ，ＧｕｏＸＳ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犠犲犻狊狊犲犾犾犪ｓｐｅｃｉｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犓狅犫狉犲狊犻犪犾犻狋狋犾犲犱犪犾犲犻ｇｒｏｗｉｎｇｉｎ
ａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（１）：２６６２７５．
［３］　ＬｉＪＦ，ＳｕｎＸＨ，ＹｕａｎＸＪ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｄｉｎｇａｃｅｔｉｃａｃｉｄｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙａｎｄａｅｒｏｂｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｉｘｅｄｏａｔａｎｄａｌ
ｆａｌｆａｓｉｌａｇｅｉｎＴｉｂｅｔｔ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（５）：２７１２７８．
［４］　ＷａｎｇＱ，ＹｕＣＱ，ＬｉＺＨ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｄｉｎｇｃｏｅｎｚｙｍｅａｎｄｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆｍｉｘｅｄｓｉｌａｇｅｓｏｆ
ｔａｌｆｅｓｃｕｅ（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）ａｎｄｃｏｍｍｏｎｖｅｔｃｈ（犞犻犮犻犪狊犪狋犻狏犪）ｉｎＴｉｂｅｔ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１２，２１（４）：１８６
１９１．
［５］　ＺｈａｏＱＪ，ＹｕａｎＸＪ，ＧｕｏＧ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｄｉｎｇａｎｉｎｏｃｕｌａｎｔａｎｄｍｏｌａｓｓｅｓｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆｍｉｘｅｄｓｉｌａｇｅｏｆｈｕｌ
ｌｅｓｓｂａｒｌｅｙｓｔｒａｗａｎｄｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｉｎＴｉｂｅｔ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（４）：１００１０６．
［６］　ＣａｉＹＭ，ＫｕｍａｉＳ，ＯｇａｗａＭ，犲狋犪犾．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犘犲犱犻狅犮狅犮犮狌狊ｓｐｅｃｉｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｏｒａｇｅｃｒｏｐｓａｎｄ
ｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｓｉｌａｇｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，６５：２９０１２９０６．
［７］　ＣａｉＹ，ＢｅｎｎｏＹ，ＯｇａｗａＭ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｐｐｌｙｉｎｇｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｏｒａｇｅｃｒｏｐｓｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｓｔｉｃｓａｎｄａｅｒｏｂｉｃｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎｏｆｓｉｌａｇｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，８２（３）：５２０５２６．
［８］　ＭｃＤｏｎａｌｄＰ，ＨｅｎｄｅｒｓｏｎＡＲ，ＨｅｒｏｎＳＪ．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＳｉｌａｇｅ（２ｎｄｅｄ）［Ｍ］．Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ：ＣａｍｂｒｉａｎＰｒｉｎｔｅｒｓＬｔｄ，
１９９１．
［９］　ＴｏｒｒｉａｎｉＳ，ＤｅｌａｇｌｉｏＦ，ＰａｌｕｍｍｅｒｉＭ，犲狋犪犾．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｐｈｙｔｉｃｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｏｎｇｒｏｗｉｎｇｐｌａｎｔｓ
ｏｆｍａｉｚｅａｎｄｌｕｃｅｒｎｅ．ＡｎｎａｌｉｄｉＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａｅｄＥｎｚｉｍｏｌｏｇｉａ，１９９２，４２：４９５９．
［１０］　ＧｕｏＧ，ＳｕｎＸＨ，ＱｉｕＸＹ，犲狋犪犾．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｓｉｌａｇｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｎａｐｉｅｒ
ｇｒａｓｓ．ＰａｋｉｓｔａｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＪｏｕｒｎａｌ，２０１４，３４（２）：１７０１７４．
［１１］　ＰａｎｇＨ，ＴａｎＺ，ＱｉｎＧ，犲狋犪犾．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｏｒａｇｅｃｒｏｐｓａｎｄｇｒａｓ
ｓｅｓｉｎｔｈｅＴｉｂｅｔａｎＰｌａｔｅａｕ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，５０（１）：６３７１．
［１２］　ＷｅｉｎｂｅｒｇＺＧ，ＳｚａｋａｃｓＧ，ＡｓｈｂｅｌＧ，犲狋犪犾．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｎｓｉｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃｏｒｎａｎｄｗｈｅａｔ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，９０（４）：５６１５６６．
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（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊Ｓｗ．）ｓｉｌａｇｅｑｕａｌｉｔｙａｔｖａｒｉｏｕｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌ，２０１２，８３（２）：１２８１３５．
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６０１ 草　业　学　报 第２４卷
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎｄ１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡａｎａｌｙｓｅｓ．ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，２８（２）：７６７７７６．
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７０１第６期 杨晓丹　等：西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选