全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４３７２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
李惠霞，彭焕，彭德良，朱锐东，徐鹏刚，李建荣．甘肃省高寒草原牧草孢囊线虫的鉴定．草业学报，２０１５，２４（８）：１７４１８０．
ＬｉＨＸ，ＰｅｎｇＨ，ＰｅｎｇＤＬ，ＺｈｕＲＤ，ＸｕＰＧ，ＬｉＪＲ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅｉｎａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓｔｅｐｐｅ，Ｇａｎｓｕ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，
２０１５，２４（８）：１７４１８０．
甘肃省高寒草原牧草孢囊线虫的鉴定
李惠霞１，彭焕２，彭德良２，朱锐东１，徐鹏刚１，李建荣１
（１．甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０；
２．中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京１００１９３）
摘要：２０１３年８月下旬，对甘肃天祝高寒草甸草原孢囊线虫发生情况进行调查，从嵩草和矮嵩草根部和根际土样中
分离得到孢囊线虫。通过对孢囊和孢囊阴门锥的形态观察，初步鉴定为禾谷孢囊线虫（犎犲狋犲狉狅犱犲狉犪犪狏犲狀犪犲）。其特
征为孢囊浅褐色，阔柠檬形，阴门锥双膜孔，未见阴门下桥，泡状突明显。利用通用引物 ＡＢ２８和ＴＷ８１对其群体
ｒＤＮＡＩＴＳ区进行ＰＣＲ扩增和序列测定，得到ＩＴＳ区序列长度为１０４５ｂｐ。将所测得序列在Ｇｅｎｂａｎｋ和Ｂｌａｓｔ上比
对，结果显示，此禾谷孢囊线虫群体与犎．犪狏犲狀犪犲群体相似度达９９％～１００％。进一步证实寄生于甘肃天祝高寒草
甸草原嵩草和矮嵩草的孢囊线虫均为犎．犪狏犲狀犪犲，这是首次报道莎草科嵩草和矮嵩草也是禾谷孢囊线虫的寄主。
关键词：高寒草甸草原；禾谷孢囊线虫；嵩草；矮嵩草
犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狔狊狋狀犲犿犪狋狅犱犲犻狀犪犾狆犻狀犲犿犲犪犱狅狑狊狋犲狆狆犲，犌犪狀狊狌
ＬＩＨｕｉＸｉａ１，ＰＥＮＧＨｕａｎ２，ＰＥＮＧＤｅＬｉａｎｇ２，ＺＨＵＲｕｉＤｏｎｇ１，ＸＵＰｅｎｇＧａｎｇ１，ＬＩＪｉａｎＲｏｎｇ１
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犪犲，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪狋犻狅狀，
犛犻狀狅犝．犛．犆犲狀狋犲狉狊犳狅狉犌狉犪狕犻狀犵犾犪狀犱犈犮狅狊狔狊狋犲犿犛狌狊狋犪犻狀犪犫犻犾犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；２．犛狋犪狋犲犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犳狅狉犅犻狅犾狅犵狔狅犳
犘犾犪狀狋犇犻狊犲犪狊犲狊犪狀犱犐狀狊犲犮狋犘犲狊狋，犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犘犾犪狀狋犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀，犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犅犲犻犼犻狀犵１００１９３，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｓｕｒｖｅｙｏｆｇｒａｓｓｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅｓｉｎＴｉａｎｚｈｕａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓｔｅｐｐｅ，ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｉｎ
Ａｕｇｕｓｔ，２０１３．Ｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｏｏｔｓａｎｄｒｏｏｔｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆ犓狅犫狉犲狊犻犪ｓｐ．ａｎｄ犓狅犫狉犲狊犻犪
犺狌犿犻犾犻狊．Ｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｓｗｅｒｅｉｎｉｔｉａｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犎犲狋犲狉狅犱犲狉犪犪狏犲狀犪犲ｂａｓｅｄｏｎｃｙｓｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ
ｌｙｔｈｅｃｙｓｔｖｕｌｖａｃｏｎｅｓ．Ｔｈｅｃｙｓｔｓｗｅｒｅｌｉｇｈｔｂｒｏｗｎ，ｌａｒｇｅｌｅｎｍｏｎｓｈａｐｅｄａｎｄｃｏｎｔａｉｎｅｄｖｕｌｖａｃｏｎｅｓｗｉｔｈ
ｂｉｆｅｎｅｓｔｒａｔｅａｎｄｏｂｖｉｏｕｓｂｕｌａｅａｎｄｗｉｔｈｏｕｔａｖｕｌｖａｕｎｄｅｒｂｒｉｄｇｅ．Ｔｈｅ１０４５ｂｐｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＩＴＳｒｅｇｉｏｎ
ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇＰＣＲｗｉｔｈｇｅｎｅｒａｌｐｒｉｍｅｒｓＡＢ２８ａｎｄＴＷ８１．Ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｇｒｏｕｐｓａｎｄ犎．
犪狏犲狀犪ｗｅｒｅ９９％－１００％．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犓狅犫狉犲狊犻犪ｓｐ．ａｎｄ
犓狅犫狉犲狊犻犪犺狌犿犻犾犻狊ｇｒｏｗｉｎｇｉｎＴｉａｎｚｈｕａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓｔｅｐｐｅｗｅｒｅ犎．犪狏犲狀犪犲．Ｔｈｉｓｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ
犓狅犫狉犲狊犻犪ｓｐ．ａｎｄ犓狅犫狉犲狊犻犪犺狌犿犻犾犻狊ａｓｈｏｓｔｓｏｆ犎．犪狏犲狀犪犲．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓｔｅｐｐｅ；ｃｅｒｅａｌｃｙｓｔｎｅｍａｔｏｄｅ；犓狅犫狉犲狊犻犪ｓｐ．；犓狅犫狉犲狊犻犪犺狌犿犻犾犻狊
禾谷孢囊线虫（犎犲狋犲狉狅犱犲狉犪）是一类危害小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）、燕麦（犃狏犲狀犪
狊犪狋犻狏犪）等禾谷类作物的世界性重要病原线虫。属于复合种群组，包括１２个有效种，其中禾谷孢囊线虫（犎犲狉狅
犱犲狉犪犪狏犲狀犪犲），菲利普孢囊线虫（犎．犳犻犾犻狆犼犲狏犻）和麦类孢囊线虫（犎．犾犪狋犻狆狅狀狊）是最为常见且最具经济重要性的
第２４卷 第８期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．８
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年８月
Ａｕｇ，２０１５
收稿日期：２０１４０９０２；改回日期：２０１４１２２５
基金项目：国家自然科学基金（３１４６０４６３）和草业生态系统教育部重点实验室（甘肃农业大学）开放课题基金（ＣＹＺＳ２０１１０１０）资助。
作者简介：李惠霞（１９７２），女，甘肃天水人，副教授。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｈｘ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
种［１３］。犎．犪狏犲狀犪犲是温带地区禾谷类植物上最重要的，也是世界上分布最广的种［１，４］。目前，犎．犪狏犲狀犪犲在我国
湖北、河南、河北、山东、山西、青海、内蒙古、北京、安徽、陕西、甘肃、江苏、宁夏、天津、新疆和西藏等１６个省市自
治区分布报道的小麦禾谷孢囊线虫主要为该种［５１２］。犎．犳犻犾犻狆犼犲狏犻分布在欧洲、美洲和中亚［２，８］，彭德良等［１３］在
河南省临颍、许昌、卫辉和延津发现犎．犳犻犾犻狆犼犲狏犻。犎．犾犪狋犻狆狅狀狊主要分布在地中海地区［２，１４１５］，我国尚未见报道。
禾谷孢囊线虫除危害小麦、大麦和燕麦，齐淑华等［１６］报道禾谷孢囊线虫可危害青稞（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｖａｒ．
狀狌犱狌犿）。王明祖等［１７］的研究表明除小麦、裸大麦（犎狅狉犱犲狌犿狊犪狋犻狏狌犿ｖａｒ．犺犲狓犪狊狋犻犮犺狅狀）、米大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾
犵犪狉犲）、家燕麦（犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪）、野燕麦（犃狏犲狀犪犳犪狋狌狉犪）外，黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）、鹅观草（犚狅犲犵狀犲狉犻犪犽犪狀狅犼犻）、
苇状羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犲犾犪狋犻狅狉ｖａｒ．犪狉狌狀犱犻狀狌犮犲犪）、球茎草芦（犘犺犪犾犪狉犻狊狋狌犫犲狉狅狊犪）和鸭茅（犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪）等禾本
科植物也是该线虫的良好寄主。这些多年生的禾本科植物作为禾谷孢囊线虫的中间寄主或桥梁寄主存在于麦类
作物田间。西北农牧交错带分布最广，面积最大的，是以各种针茅为主的丛生禾草高寒草原，以紫花针茅（犛狋犻狆犪
狆狌狉狆狌狉犲犪）和坐花针茅（犛．狊狌犫狊狊犲狊犻犾犻犳犾狅狉犪）为主的典型草原，还有以戈壁针茅（犛．犵狅犫犻犮犪）和沙生针茅（犛．犵犾犪狉犲狅
狊犪）为主的荒漠草原，以嵩草属（犓狅犫狉犲狊犻犪ｓｐ．）为建群种的草甸草原，其建群的群系主要为禾草和莎草，而这些牧
草很可能也是禾谷孢囊线虫的寄主。但对于农牧交错带禾谷孢囊线虫对牧草的寄生情况了解甚少，因此，针对寄
生于牧草的孢囊线虫的种类、交叉侵染、生态分布多样性进行研究，显得尤为重要。
ｒＤＮＡＩＴＳ序列是一个多用途的遗传标记，常用ＩＴＳＲＦＬＰ（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｐａｃｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析线虫不同群体的差异及多态性。Ｓｕｂｂｏｔｉｎ等［１８］研究了７０个犎．犪狏犲狀犪犲复合种群的
ＩＴＳＲＦＬＰ图谱，揭示出犎．犪狏犲狀犪犲是一个并系分类群，中国禾谷孢囊线虫不同于其他的犎．犪狏犲狀犪犲群体。彭
德良等［１９］对７个国内种群与摩洛哥种群做ＲＦＬＰ分析，发现我国部分群体属于“Ｂ”型。欧师琪等［２０］用６种限制
性内切酶酶切发现，陕西禾谷孢囊线虫群体和青海群体、河南群体不完全一致，呈现丰富的多样性。上述国内外
的研究充分说明我国不同地域犎．犪狏犲狀犪犲群体间ｒＤＮＡＩＴＳ具有丰富的多样性。
综上所述，近年来，麦类作物孢囊线虫的研究得到广泛重视，但对于农牧交错带禾谷孢囊线虫对麦类和牧草
的寄生情况了解甚少，因此，针对寄生于牧草的孢囊线虫的种类多样性进行研究，显得尤为重要。本文利用形态
学和分子生物学手段相结合的方法对天祝高寒草甸草原的针茅（犛狋犻狆犪犮犪狆犻犾犾犪狋犪）、披碱草（犈犾狔犿狌狊犱犪犺狌狉犻犮狌狊）、
嵩草和矮嵩草（犓狅犫狉犲狊犻犪犺狌犿犻犾犻狊）孢囊线虫进行鉴定，以期明确天祝草原孢囊线虫的种类。
１ 材料与方法
１．１ 线虫的采集
于２０１３年８月牧草生长季在甘肃省天祝高寒草甸草原不同地点进行采样。采用“Ｚ”字形法采集受害牧草根
及根际土壤，每点采取５～２０ｃｍ深处的土样５００～１０００ｇ，充分混匀，取其中的５００～１０００ｇ作为一个标样，带回
实验室进行线虫分离。具体采样信息见表１。
１．２ 线虫的分离方法
采用简易漂浮法进行孢囊的分离，取２００ｇ土样用强水流冲洗，搅动，沉淀片刻，将混合物通过２０目（８５０
μｍ）和６０目（２５０μｍ）的样品筛，重复以上步骤３次。再用小水流轻轻清洗６０目（２５０μｍ）筛上残余物，将其淋
洗入三角瓶中，用滤纸过滤收集，４℃冷藏备用。
１．３ 孢囊线虫标本的制作
１．３．１ 二龄幼虫标本的制作 将二龄幼虫置于６０℃水浴２ｍｉｎ，进行热杀死，用三乙醇胺－福尔马林液
（ＴＡＦ）固定过夜。用吸管汲取一滴浮载剂滴于洁净载玻片中央。在体视显微镜下用挑针将固定好的二龄幼虫
挑至载玻片中央的浮载剂中。选取与线虫虫体直径相似的３根５ｍｍ左右的支撑物，均匀置于浮载剂边缘，将烤
热的盖玻片盖于浮载剂上，应避免产生气泡。在体视显微镜下用裁成小条的滤纸吸取多余的浮载剂。然后用封
片剂封片。待封片剂干后，贴上标签，即可用于短时间形态的观察、拍照并测量。
１．３．２ 孢囊阴门锥标本的制作 用细毛笔挑取饱满孢囊置于载玻片的水滴中，在体视显微镜下用锋利的解剖
刀切下孢囊阴门锥部分。用毛针或竹针仔细清除阴门锥内附着物，用刀适当修正阴门锥边缘，最好使阴门锥的高
５７１第８期 李惠霞 等：甘肃省高寒草原牧草孢囊线虫的鉴定
度不超过阴门窗区域宽度的１０～１５倍。将切下的阴门锥用４０％双氧水处理数分钟。将阴门锥移至载玻片的水
滴中，用凡士林封片制成临时玻片。在光学显微镜下进行形态的观察、拍照、测量及参照王明祖等［１７］的方法鉴
定。
１．４ 孢囊线虫ＤＮＡ的提取
从检出孢囊的样品中，挑取饱满的孢囊，参考彭德良等［１１］的方法提取孢囊线虫的ＤＮＡ，将单个孢囊放入Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入１０μＬ灭菌重蒸水、７μＬ的１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ
２＋）、３μＬ蛋白酶Ｋ（６００μｇ／ｍＬ），在液氮
中速冻１ｍｉｎ，取出后用７５％乙醇消毒的玻璃棒研磨１～２ｍｉｎ后，置于－２０℃冷冻至少２ｈ。之后，将Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
管置于６５℃下温育１．５ｈ，９５℃１０ｍｉｎ，４℃至少５ｍｉｎ。最后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。取 ＤＮＡ 上清液于
－２０℃保存备用。
１．５ ｒＤＮＡＩＴＳ的ＰＣＲ扩增
反应采用５０μＬ体系，１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ
２＋）５．０μＬ，ｄＮＴＰｓ４μＬ，引物ＴＷ８１（ＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴ
ＧＡＡＣＣＴＧＣ）１μＬ，引物ＡＢ２８（ＡＴＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴ）１μＬ，ＥｘＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）１
μＬ，模板ＤＮＡ３．０μＬ，灭菌双蒸水补足到５０μＬ，同时设置无ＤＮＡ模板的阴性对照。在ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＰＣＲ仪上进
行扩增，扩增反应条件为９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃４５ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，循环３５次，７２℃延伸１０ｍｉｎ，
４℃５ｍｉｎ，最后－２０℃保存。取１０μＬ扩增产物加２μＬ６×Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ在１．５％琼脂糖凝胶上电泳，用０．５×
ＴＡＥ电泳缓冲液，１２０Ｖ电泳４０ｍｉｎ，ＥＢ染色，在ＢＩＯ－ＲＡＤ成像仪紫外光灯下观测并照相。
１．６ ｒＤＮＡＩＴＳ区域ＰＣＲ产物的回收纯化、克隆、测序和序列分析
将上述电泳后的目的条带切下，用普通琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒（ＴＩＡＮＧＥＮ）按步骤进行回收纯化。取
４μＬ纯化后的产物与６μＬｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ在１６℃连接４ｈ，然后将１０μＬ连接产物转入感受态细胞ＤＨ５α中，
用热击法进行转化后均匀涂在含有Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ（１００ｍｇ／Ｌ）、ＩＰＴＧ（２４ｍｇ／Ｌ）和Ｘｇａｌ（２００ｍｇ／Ｌ）的ＬＢ（Ｌｕｒｉａ
Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基平板上，之后倒置在３７℃培养箱中１２～１６ｈ，进行蓝白斑筛选。挑取单个白斑于含有Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ
（１００ｍｇ／Ｌ）的液体ＬＢ中置于３７℃２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ｈ，经菌液ＰＣＲ鉴定后，将含有正确片段的菌液进行测
序。所得序列用Ｃｈｒｏｍａｓ、ＤＮＡＭＡＮ分析比对，在ＧｅｎＢａｎｋ注册，并在ＮＣＢＩ下载已知近缘种序列，用 ＭＥＧＡ
５．２中的ＵＰＧＭＡ法构建禾谷孢囊线虫群体的系统发育树，进行亲缘关系分析。
２ 结果与分析
２．１ 孢囊线虫发生情况
采集到不同地点禾本科牧草的２０份根部和根际土样，其中嵩草和矮嵩草根部观察到寄生于根部的白色雌虫
（图１），并从其根际土样中分离得到２个浅褐色孢囊群体，每１００ｇ土样中孢囊数分别为３６个和５４个。孢囊密
度较高，表明嵩草和矮嵩草是其良好寄主。但在针茅和披碱草根部均未观察到白雌虫，根际土样也未分离到孢囊
（表１）。
２．２ 孢囊线虫的形态鉴定
对收集自嵩草和矮嵩草的２个孢囊线虫群体进行形态学观察（图１），孢囊柠檬形，颈部明显，呈浅褐色，孢囊
长（５８４．１±６３．２）μｍ（４７２～６９１μｍ）；孢囊宽（４５１．９±５６．９）μｍ（２６４～５１９μｍ）。阴门锥膜孔为双膜孔，无下
桥，阴门裂清晰可见。形态测量值分别为：阴门膜孔长（２９．２±２．４）μｍ（２５～３２μｍ）；膜孔宽（１４．３±１．５）μｍ
（１２～１７μｍ）；阴门裂长（８．９±１．６）μｍ（７～１１μｍ），且阴门锥下方有较多泡状突。二龄幼虫都为线形，唇区圆，
与身体连接处缢缩明显，口针强壮，中食道球发达。尾部呈锥形，有较长的透明区，其相关形态测量值为：线虫体
长（３８２．４±２８．９）μｍ（３１４．１～４２１．９μｍ）；线虫体宽（２２．７±２．１）μｍ（１９．５～２６．９μｍ）；体长／虫体最宽处体宽
（１７．０±１．９）μｍ（１４．１～２０．０μｍ）；体长／尾长（１０．４±１．６）μｍ（７．０～１１．６μｍ）；尾长（３７．３±５．８）μｍ（２８．７～
５８．６μｍ）；透明尾长（２７．３±５．７）μｍ（１９．１～３６．６μｍ）。受精卵长（１０８．４±６．５）μｍ（９７．１～１２１．１μｍ）；受精卵
宽（４８．２±５．０）μｍ（４０．２～５５．９μｍ）；卵量（粒／孢囊）（２３１．５±３６．９）（１９６～３１１）。根据上述形态观察和测量
值，参考文献［２１２３］，将分离自甘肃天祝嵩草和矮嵩草的孢囊群体鉴定为禾谷孢囊线虫（犎．犪狏犲狀犪犲）。
６７１ 草 业 学 报 第２４卷
表１ 甘肃省天祝高寒草甸牧草孢囊线虫发生情况
犜犪犫犾犲１ 犗犮犮狌狉狉犲狀犮犲狅犳犮狔狊狋狀犲犿犪狋狅犱犲狅狀犵狉犪狊狊犳狉狅犿犪犾狆犻狀犲犿犲犪犱狅狑狊狋犲狆狆犲狅犳犜犻犪狀狕犺狌，犌犪狀狊狌
样品
编号
Ｓａｍｐｌｅ
Ｎｏ．
采样地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
寄主植物
Ｈｏｓｔｐｌａｎｔ
孢囊数
Ｃｙｓｔｄｅｎｓｉｔｙ
（Ｎｏ．／
１００ｇ）
样品
编号
Ｓａｍｐｌｅ
Ｎｏ．
采样地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
寄主植物
Ｈｏｓｔｐｌａｎｔ
孢囊数
Ｃｙｓｔｄｅｎｓｉｔｙ
（Ｎｏ．／
１００ｇ）
１ Ｎ３７°１０．８０７′，Ｅ１０８°４７．７８７′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０ １１ Ｎ３７°１１．９４６′，Ｅ１０８°４６．４５６′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０
２ Ｎ３７°１１．８６′，Ｅ１０８°４６．６４４′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０ １２ Ｎ３７°１１．９６４′，Ｅ１０８°４７．７３０′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０
３ Ｎ３７°１０．１０７′，Ｅ１０８°４７．６４４′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０ １３ Ｎ３７°１０．６８２′，Ｅ１０８°４７．６８６′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０
４ Ｎ３７°１１．１７１′，Ｅ１０８°４８．５５１′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０ １４ Ｎ３７°１１．３４０′，Ｅ１０８°４７．９７０′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０
５ Ｎ３７°１１．６２５′，Ｅ１０８°４７．１５４′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０ １５ Ｎ３７°１１．５０９′，Ｅ１０８°４７．２３２′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０
６ Ｎ３７°１１．７５４′，Ｅ１０８°４７．１５９′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０ １６ Ｎ３７°１０．７８４′，Ｅ１０８°４７．２５２′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０
７ Ｎ３７°１２．１３７′，Ｅ１０８°４７．３３７′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０ １７ Ｎ３７°１０．７８７′，Ｅ１０８°４７．１４２′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０
８ Ｎ３７°１１．９２８′，Ｅ１０８°４７．０５０′ 嵩草、矮嵩草 ３６ １８ Ｎ３７°１２．０７９′，Ｅ１０８°４７．０４８′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０
９ Ｎ３７°１０．６８２′，Ｅ１０８°４７．６８６′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０ １９ Ｎ３７°１２．０６５′，Ｅ１０８°４７．４１２′ 针茅犛．犮犪狆犻犾犾犪狋犪 ０
１０ Ｎ３７°１１．９６４′，Ｅ１０８°４６．７３０′ 披碱草犈．犱犪犺狌狉犻犮狌狊 ０ ２０ Ｎ３７°１１．７９４′，Ｅ１０８°４７．１５２′ 嵩草、矮嵩草 ５４
嵩草犓狅犫狉犲狊犻犪ｓｐ．，矮嵩草犓．犺狌犿犻犾犻狊．
图１ 孢囊线虫形态特征
犉犻犵．１ 犐犾狌狊狋狉犪狋犻狅狀狅犳犮犲狉犲犪犾犮狔狊狋狀犲犿犪狋狅犱犲
Ａ．浅褐色孢囊Ｃｙｓｔ；Ｂ．受精卵Ｅｇｇｓ；Ｃ，Ｄ．阴门膜孔Ｆｅｎｅｓｔｒａａｒｅａ；Ｅ，Ｆ．泡状突Ｂａｌａｅ；Ｇ．二龄幼虫头部Ｈｅａｄｏｆｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅｊｕｖｅｎｉｌｅ；Ｈ．二龄幼
虫尾部Ｔａｉｌｏｆｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅｊｕｖｅｎｉｌｅ；Ｉ．矮嵩草犓．犺狌犿犻犾犻狊．
２．３ ｒＤＮＡＩＴＳ区序列分析
将采集自嵩草和矮嵩草的２个孢囊线虫群体编号为群体Ⅰ和群体Ⅱ，从群体Ⅰ随机挑选１０个饱满的孢囊，
编号依次为ＧＳ１～ＧＳ１０，从群体Ⅱ随机挑选１０个饱满的孢囊，编号依次为ＧＳ１１～ＧＳ２０。以ＡＢ２８和ＴＷ８１为
引物，对上述２个孢囊线虫群体ｒＤＮＡＩＴＳ进行扩增，得到所有片段长多约为１０００ｂｐ，阴性对照无扩增条带出
现（图２，图３）。
将ＰＣＲ产物经回收，纯化，克隆和测序，最终得到长度均为１０４５ｂｐ的ＩＴＳ序列，将序列提交Ｇｅｎｂａｎｋ并与
ＮＣＢＩ下载的ＩＴＳ序列进行Ｂｌａｓｔ比对，这些序列分别包括犃狏犲狀犪犲组的有效种（澳大利亚的犎．犪狌狊狋狉犪犾犻狊，中国、
法国、德国、以色列、印度的犎．犪狏犲狀犪犲，德国的犎．犿犪狀犻，美国的犎．犳犻犾犻狆犼犲狏犻，英国的犎．犪狉犲狀犪狉犻犪）、犛犮犺犪犮犺狋犻犻
组（伊朗的犎．犵犾狔犮犻狀犲狊、比利时的犎．狊犮犺犪犮犺狋犻犻）、犌狅犲狋狋犻狀犵犻犪狀犪组（德国的犎．犵狅犲狋狋犻狀犵犻犪狀犪、荷兰的犎．犮狉狌犮犻犳犲
狉犪犲、意大利的犎．犮犪狉狅狋犪犲）和比利时犎．狌狉狋犻犮犪犲。用ＭＥＧＡ５．２的ＵＰＧＭＡ方法构建ＩＴＳ区的系统发育树（图４）。
７７１第８期 李惠霞 等：甘肃省高寒草原牧草孢囊线虫的鉴定
图２ 甘肃天祝嵩草和矮嵩草孢囊线虫群体Ⅰ的狉犇犖犃犐犜犛序列犘犆犚扩增产物
犉犻犵．２ 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狉犇犖犃犐犜犛狅犳犮狔狊狋狀犲犿犪狋狅犱犲狊狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀Ⅰ犳狉狅犿犓狅犫狉犲狊犻犪狊狆．，犓．犺狌犿犻犾犻狊犻狀犜犻犪狀狕犺狌狅犳犌犪狀狊狌
Ｍ：Ｍａｋｅｒ（ＤＬ２０００）；Ｎ：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；１～１０：ＧＳ１，ＧＳ２，ＧＳ３，ＧＳ４，ＧＳ５，ＧＳ６，ＧＳ７，ＧＳ８，ＧＳ９，ＧＳ１０．
图３ 甘肃天祝嵩草和矮嵩草孢囊线虫群体Ⅱ狉犇犖犃犐犜犛序列犘犆犚扩增产物
犉犻犵．３ 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狉犇犖犃犐犜犛狅犳犮狔狊狋狀犲犿犪狋狅犱犲狊狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀Ⅱ犳狉狅犿犓狅犫狉犲狊犻犪狊狆．，犓．犺狌犿犻犾犻狊犻狀犜犻犪狀狕犺狌狅犳犌犪狀狊狌
Ｍ：Ｍａｋｅｒ（ＤＬ２０００）；Ｎ：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；１１～２０：ＧＳ１１，ＧＳ１２，ＧＳ１３，ＧＳ１４，ＧＳ１５，ＧＳ１６，ＧＳ１７，ＧＳ１８，ＧＳ１９，ＧＳ２０．
图４ 犝犘犌犕犃法构建的甘肃天祝高寒草甸
草原禾谷孢囊线虫群体及其近原种
的犐犜犛序列系统进化树
犉犻犵．４ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狊狅犳犮犾狅狊犲狉犲犾犪狋犲犱
狊狆犲犮犻犲狊犪狀犱狋犺犲狋犲狊狋犲犱狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊犫犪狊犲犱
狅狀狉犇犖犃犐犜犛狊犲狇狌犲狀犮犲犫狔犝犘犌犕犃
犎．犪狏犲狀犪犲，禾谷孢囊线虫；犎．犿犪狀犻，稀少孢囊线
虫；犎．犳犻犾犻狆犼犲狏犻，菲利普孢囊线虫；犎．犪狉犲狀犪狉犻犪，蚤
缀孢 囊 线 虫；犎．犵犾狔犮犻狀犲狊，大 豆 孢 囊 线 虫；犎．
狊犮犺犪犮犺狋犻犻，甜菜孢囊线虫；犎．犵狅犲狋狋犻狀犵犻犪狀犪，豌豆孢囊
线虫；犎．狌狉狋犻犮犪犲，荨麻孢囊线虫；犎．犮狉狌犮犻犳犲狉犪犲，十
字花科孢囊线虫；犎．犮犪狉狅狋犪犲，胡萝卜孢囊线虫．横线
上数字为置信度。Ｎｕｍｂｅｒｓｏｎｔｈｅｌｉｎｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｅ
ｇｒｅｅｏｆｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ．
８７１ 草 业 学 报 第２４卷
聚类分析结果表明，所有的序列聚为３个大的分支，其中本研究中的９个禾谷孢囊线虫群体与上述犃狏犲狀犪犲组的
１０个群体聚为一个大的分支，犎．犵犾狔犮犻狀犲狊和犎．狊犮犺犪犮犺狋犻犻聚为一分支，其置信度为１００。犌狅犲狋狋犻狀犵犻犪狀犪组３个
群体和犎．狌狉狋犻犮犪犲为一类。在犃狏犲狀犪犲组的分支中，本研究线虫群体与中国的禾谷孢囊线虫和澳大利亚的 犎．
犪狌狊狋狉犪犾犻狊群体聚为一个小的分支，其他国家的犎．犪狏犲狀犪犲聚在另外一个小的分支中。
３ 讨论
孢囊线虫病在我国的分布逐年扩大，已成为小麦的重要病害，严重威胁我国粮食的安全生产。农牧交错带农
业种植区与草原畜牧区相连接的生态过渡地带，又称半农半牧区或生态脆弱带。在过渡带内，种植业和草地畜牧
业在空间上交错分布，具有生态多样性和复杂性。西北农牧交错带是遏制西北荒漠化、沙化东移和南下的生态屏
障。处于甘肃中部的天祝高寒草甸草原（东经１０２°０１′－１０３°４０′，北纬３６°４５′－３７°５４′）是半农半牧区，麦类作物
及禾草种类多样。本研究采集高寒草甸牧草（针茅、披碱草和矮嵩草）根部及根际土壤，观察根部并分离样品中的
孢囊。其结果显示，采自嵩草和矮嵩草根际土样中分离到孢囊，在其根部发现白色雌虫。这表明，莎草科嵩草和
矮嵩草可以作为禾谷孢囊线虫的寄主。该结果首次表明犎．犪狏犲狀犪犲的寄主不局限于禾本科植物，还包括莎草科
植物。
禾谷孢囊线虫种群的鉴定目前主要采用形态特征和分子生物学相结合的方法。形态特征鉴定主要包括对孢
囊、阴门锥及二龄幼虫形态的观察以及相关体值的测定，但是仅根据形态学和形态测量值区别这１２个种比较困
难，需要许多专业知识和技巧，用单个个体经常不能鉴定到种的水平。本研究对采集自甘肃天祝高寒草甸草原嵩
草和矮嵩草的根际土样中孢囊进行了形态观察和形态体值的测量，形态特征与陈品三等［２１］、Ｚａｆａｒ［２２］和王明
祖［２３］禾谷孢囊线虫的描述基本一致，但形态测量值略微偏小。形态测量值的略微偏差，可能是生态环境、地域差
异造成，不同的寄主也可能对群体分化存在一定的影响。孢囊线虫ｒＤＮＡＩＴＳ的多种内切酶的ＲＦＬＰ图谱可用
来分析禾谷孢囊线虫种内ＩＴＳ多态性，彭德良等［１９］用１１种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫ＩＴＳ扩增产物，成功
地将采集到的禾谷孢囊线虫ＩＴＳ与摩洛哥群体ＩＴＳ分开，分别属于“Ｂ型”和“Ａ型”。欧师琪等［２０］用６种限制性
内切酶酶切发现，陕西禾谷孢囊线虫群体和青海群体、河南群体不完全一致，呈现丰富的多样性。分子生物学鉴
定是通过ｒＤＮＡＩＴＳ区序列的分子特征分析，结合以形态学鉴定提高了禾谷孢囊线虫种类鉴定的准确性。ＩＴＳ
构建的系统发育树表明，本研究线虫群体与中国的禾谷孢囊线虫、德国的犎．狆狉犪狋犲狀狊犻狊和澳大利亚的犎．犪狌狊狋
狉犪犾犻狊群体聚为一个小的分支，揭示了它们之间具有更高的亲缘关系。
４ 结论
本研究对寄生于甘肃中部天祝高寒草甸草原牧草（嵩草和矮嵩草）的孢囊线虫群体进行形态学鉴定和ｒＤ
ＮＡＩＴＳ区序列的分子特征分析。结果显示，该群体均为禾谷孢囊线虫，这是首次报道莎草科嵩草和矮嵩草也是
禾谷孢囊线虫的寄主植物。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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０８１ 草 业 学 报 第２４卷