全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０５１９ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
刘健，肖雅文，芦佳，吴忠义，张中保，徐杰，姚磊．四个抗草甘膦基因的抗性比较．草业学报，２０１５，２４（５）：１５９１６６．
ＬｉｕＪ，ＸｉａｏＹＷ，ＬｕＪ，ＷｕＺＹ，ＺｈａｎｇＺＢ，ＸｕＪ，ＹａｏＬ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｆｏｕｒｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｇｅｎｅｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（５）：
１５９１６６．
四个抗草甘膦基因的抗性比较
刘健１，２，肖雅文２，芦佳１，２，吴忠义２，张中保２，徐杰１，姚磊２
（１．内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特０１００２２；２．北京市农林科学院农业生物技术研究中心，北京１０００９７）
摘要：草甘膦抗性是当代农业重要的农艺性状。为了选择最佳的抗性基因用于植物筛选标记，通过选取犮狆４
犲狆狊狆狊、犌犚７９犲狆狊狆狊、犵犪狋４６２１和犌犃犜四个草甘膦抗性基因进行比较，在拟南芥中验证各基因对草甘膦的抗性。４
个基因的转化苗经４个浓度的草甘膦喷施检测，结果显示，犌犃犜类基因的抗性明显高于犲狆狊狆狊类基因，基因间的差
异达到了极显著水平。犵犪狋４６２１基因对草甘膦的抗性最好，在各浓度下存活率均表现为最高值，且抗性稳定。国内
发掘的犌犃犜基因对草甘膦也表现出良好的抗性。犌犃犜类基因的拟南芥转化苗在喷施高浓度草甘膦条件下出现
严重抽苔抑制；但在停施草甘膦后抑制解除，且可以开花结实。转犲狆狊狆狊类基因可以获得高抗草甘膦植株，但在花
期喷施草甘膦将造成败育。从基因大小及抗性强弱考虑，犌犃犜类基因作为筛选标记基因应该更为适合。
关键词：比较；草甘膦；抗性；基因
犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犳狅狌狉犵犾狔狆犺狅狊犪狋犲狋狅犾犲狉犪狀犮犲犵犲狀犲狊
ＬＩＵＪｉａｎ１，２，ＸＩＡＯＹａＷｅｎ２，ＬＵＪｉａ１，２，ＷＵＺｈｏｎｇＹｉ２，ＺＨＡＮＧＺｈｏｎｇＢａｏ２，ＸＵＪｉｅ１，
ＹＡＯＬｅｉ２
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犐狀狀犲狉犕狅狀犵狅犾犻犪犖狅狉犿犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎狅犺犺狅狋０１００２２，犆犺犻狀犪；２．犅犲犻犼犻狀犵犃犵狉狅犅犻狅狋犲犮犺
狀狅犾狅犵狔犚犲狊犲犪狉犮犺犆犲狀狋犲狉，犅犲犻犼犻狀犵犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱犉狅狉犲狊狋狉狔，犅犲犻犼犻狀犵１０００９７，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｉｎｍｏｄｅｒｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅ
ｂｅｓｔｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｇｅｎｅｆｏｒｐｌａｎｔｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｓｗｅｃｏｍｐａｒｅｄｆｏｕｒｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｇｅｎｅｓ，犮狆４
犲狆狊狆狊，犌犚７９犲狆狊狆狊，犵犪狋４６２１ａｎｄ犌犃犜，ｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊．Ｆｏｕｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｈａｒｂｏｒｉｎｇｅａｃｈｇｅｎｅｗｅｒｅｔｒｅａ
ｔｅｄｗｉｔｈｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｅｓｏｆｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｐｌａｎｔｓｗｉｔｈ犌犃犜ｇｅｎｅｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｔｈｅ犲狆狊狆狊ｇｅｎｅ．Ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｔｈｅ犵犪狋４６２１ｇｅｎｅｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ
ａｔａｌｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒａｔｅｓ．Ｔｈｅｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｔｈｅｄｏｍｅｓｔｉｃ犌犃犜ｇｅｎｅａｌｓｏｈａｄｓｔｒｏｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｔｈｅ犌犃犜ｇｅｎｅｗａｓｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄａｔｈｉｇｈｅｒｇｌｙｐｈｏｓａｔｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｓ．Ｉｔｗａｓ
ｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅ犌犃犜ｇｅｎｅｗａｓｍｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅａｓａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ；ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ；ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｇｅｎｅ
草甘膦（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）是由美国孟山都公司开发的一种内吸传导型除草剂，具有无选择性、无残留、灭生性的
特点，特别是对灭除多年生杂草非常有效。植物绿色部分均能很好地吸收草甘膦，以叶片吸收为主。草甘膦通过
第２４卷 第５期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．５
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年５月
Ｍａｙ，２０１５
收稿日期：２０１４０５１６；改回日期：２０１４０６２２
基金项目：北京市农林科学院科技创新能力建设专项（Ｎｏ．ＫＪＣＸ２０１１０２００３）资助。
作者简介：刘健（１９８８），男，山西吕梁人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：９０６０４７８９２＠ｑｑ．ｃｏｍ。肖雅文（１９８８），女，四川成都人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｘｙｗ＿１０２０＠
１２６．ｃｏｍ。芦佳（１９８７），女，山西大同人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：９０５６９６４４１＠ｑｑ．ｃｏｍ。共同第一作者 Ｔｈｅｓｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ
ｅｑｕａｌｙｔｏｔｈｉｓｗｏｒｋ．
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｙａｏｌｅｉ＠ｂａａｆｓ．ｎｅｔ．ｃｎ，ｘｕｊｉｅ＠ｉｍｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
与磷酸烯醇式丙酮酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ，ＰＥＰ）竞争而和５烯醇式丙酮酸莽草酸３磷酸合成酶（５ｅｎｏｌｐｙｒｕ
ｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＥＰＳＰＳ）、莽草酸３磷酸（ｓｈｉｋｉｍａｔｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｓ３Ｐ）形成稳定的复合体
ＥＰＳＰＳＳ３Ｐ草甘膦，使得芳香族氨基酸化合物合成受阻，促使黄酮以及酚类化合物等激素和关键代谢物失调［１］，
打乱了生物正常氮代谢而导致生物体的死亡［２］。
随着当前世界农业生产向着机械化和集约化方向迅速发展，抗除草剂转基因作物成为一种普遍的种植需求。
目前，植物获得草甘膦抗性主要是通过两种不同的途径［３］。一种是通过诱变或向植物体内导入对草甘膦不敏感
的ＥＰＳＰＳ，进而提高植物对草甘膦的耐受性。另一种是通过向植物体内导入草甘膦降解基因，在草甘膦发挥作
用前将其降解，进而使植物对草甘膦产生抗性。ＥＰＳＰＳ是草甘膦作用于植物产生抑制的关键性合成酶。在提高
植物对草甘膦耐受性的研究中多数是致力于对草甘膦不敏感的ＥＰＳＰＳ发掘。当前世界范围内应用最广的是来
自根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＣＰ４菌株的ＥＰＳＰＳ［４］。因其对ＰＥＰ亲和性较好且高抗草甘膦，转
犮狆４犲狆狊狆狊基因的植物对草甘膦具有较高的抗性，在抗草甘膦作物中应用最多［３］。草甘膦降解机制与牺牲ＥＰ
ＳＰＳ和ＰＥＰ结合催化活性为代价而获得对草甘膦抗性不同，是在草甘膦发生作用前将其降解以使植物产生抗
性。在长期受草甘膦污染的土壤中存在许多可降解草甘膦的细菌［５］。多种基因已经被发现对草甘膦具有分解作
用。草甘膦 Ｎ乙酰转移酶（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅＮａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＡＴ）基因即为其中一种。研究发现，草甘膦在
ＧＡＴ的作用下转化成对植物没有毒害的 Ｎ乙酰草甘膦（Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＮＡＧ）［６］。现在先锋公司的转
犵犪狋４６２１抗草甘膦作物已得到大面积商业种植［３］。目前商业化的抗草甘膦作物所利用的抗性基因均属国外专
利。国内对草甘膦抗性基因的研究以中国农业科学院生物技术研究所获得抗性基因相对较多。林敏实验室分离
到的犌犚７９（或称犃犕７９犪狉狅犃）［７］的草甘膦抗性表现较好，被推测具有较大的商业应用价值［８］。此外，该实验室还
分离获得了国内唯一的草甘膦降解基因犌犃犜，转犌犃犜的烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）获得较好的草甘膦抗性［９１０］。
植物筛选标记基因是植物遗传转化体系中重要的组成部分。因植物材料的不同，最佳筛选标记基因的选择
有所不同［１１］。最适的筛选标记基因对植物的遗传转化能起到事半功倍的作用。因犮狆４犲狆狊狆狊基因对草甘膦具
有高度抗性，被建议用作植物筛选标记基因［１２］。本实验室已构建一套含多种筛选标记基因的植物表达双元载
体［１３］，寻找最佳的抗草甘膦基因用于构建载体的植物筛选标记是丰富现有载体的目标。虽然犮狆４犲狆狊狆狊和
犵犪狋４６２１基因已经在商业生产中得以应用。但未见报道两类基因对草甘膦的抗性是否存在差异。本研究选择
犮狆４犲狆狊狆狊、犌犚７９犲狆狊狆狊、犵犪狋４６２１和犌犃犜四个草甘膦抗性基因进行比较，在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中验
证各基因对草甘膦的抗性，以期获得最佳的抗性基因用于载体的构建。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 植物材料与菌株 野生型拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ０），大肠杆菌菌株 ＤＨ５α和根癌农杆菌 ＧＶ３１０１：
ｐＭＰ９０都为北京市农林科学院农业生物技术研究中心保存。
１．１．２ 载体、酶和试剂 本实验使用的各种限制性内切酶、ＭＭＬＶ反转录酶、Ｔ４连接酶、去磷酸化酶购自
ＴａＫａＲａ、Ｐｒｏｍｅｇａ和ＮＥＢ公司。高保真酶Ｐｈｕｓｉｏｎ购自 Ｔｈｅｒｍｏ公司。ＥａｓｙＴａｑ购自ＴｒａｎｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈ公
司。ＰＣＲ纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自博迈德有限公司。引物合成及测序由中美泰和生物
技术（北京）有限公司完成。
１．２ 试验方法
１．２．１ 草甘膦抗性基因的获得 根据孟山都公司的ｐＭＯＮ植物转化载体序列［１４］，设计引物ＡｔＰＴ５′和ＣＰ４
３′（本试验所用引物序列见表１，下划线部分为酶切位点），从抗草甘膦玉米基因组中扩增犮狆４犲狆狊狆狊基因。该
犮狆４犲狆狊狆狊基因序列５′端含有１段２２５ｂｐ的拟南芥犲狆狊狆狊基因的引导肽ＣＰＴ序列。
根据中国专利ＺＬ２００７１０１７７０９０．１中犌犚７９序列，由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司根据植物偏爱密码子优化碱基序列并合
成。为保持与上述犮狆４犲狆狊狆狊基因相同，通过融合ＰＣＲ方法在犌犚７９的５′端添加ＣＰＴ引导肽序列。方法是用
０６１ 草 业 学 报 第２４卷
引物ＡｔＰＴ５′和ＡｔＰＴＧＲ７９Ｒ以犮狆４犲狆狊狆狊基因为模板扩增ＣＰＴ引导肽序列；用引物ＡｔＰＴＧＲ７９Ｆ和ＧＲ７９
３′扩增犌犚７９基因。琼脂糖凝胶电泳纯化ＰＣＲ产物后，以纯化产物为模板，将ＣＰＴ和犌犚７９基因混合，再用引物
ＡｔＰＴ５′和犌犚７９３′扩增，获得５′端添加ＣＰＴ引导肽序列的犌犚７９犲狆狊狆狊基因。
根据美国专利ＵＳ７９７３２１８Ｂ２中犵犪狋４６２１序列，基因由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，并克隆至
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ载体犛犪犮Ⅰ（基因５′端）和犓狆狀Ⅰ（基因３′端）位点。
根据中国专利２００５１００８６６２６．Ｘ中犌犃犜序列，并选用单子叶植物偏爱密码子优化碱基序列后命名犌犃犜犿。
基因犌犃犜犿由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，并克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ载体犛犪犮Ⅰ（基因５′端）和
犓狆狀Ⅰ（基因３′端）位点。
表１ 试验中所用犘犆犚引物
犜犪犫犾犲１ 犘犆犚狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋狊
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ 序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＡｔＰＴ５′ ５′ＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧ３′
ＣＰ４３′ ５′ＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴＡＴＣＧＧ３′
ＡｔＰＴＧＲ７９Ｆ ５′ＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧ３′
ＡｔＰＴＧＲ７９Ｒ ５′ＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧ３′
ＧＲ７９３′ ５′ＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＴＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＣ３′
ＣＰ４Ｆ ５′ＣＡＡＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＡＴＣ３′
ＣＰ４Ｒ ５′ＣＣＧＣＴＣＧＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＡＣ３′
ＧＲ７９Ｆ ５′ＣＣＡＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴ３′
ＧＲ７９Ｒ ５′ＡＣＡＣＧＧＡＴＡＧＧＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＡ３′
ＧＡＴ４６２１Ｆ ５′ＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＡＣＣ３′
ＧＡＴ４６２１Ｒ ５′ＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＣ３′
ＧＡＴｍＦ ５′ＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣ３′
ＧＡＴｍＲ ５′ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＣＣＡ３′
ＳＡＮＤＦ ５′ＡＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧ３′
ＳＡＮＤＲ ５′ＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＡＣ３′
注：引物下划线部分为位点犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｃｌｅａｖｅｓｉｔｅｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ犛犪犮Ⅰａｎｄ犓狆狀Ⅰ．
１．２．２ 植物转化双元载体的构建 用犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ分别双酶切犮狆４犲狆狊狆狊和犌犚７９犲狆狊狆狊含ＣＰＴ的ＰＣＲ
产物及含犵犪狋４６２１和犌犃犜犿的ｐＢＳＫ载体，琼脂糖凝胶电泳纯化后备用。用犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ双酶切植物表达载
体ｐＹＢＡ１３０５［１５］（ｐＹＢＡ１００衍生载体，植物筛选标记基因为犫犪狉，含ＣａＭＶ３５ＳΩ启动子和ＣａＭＶｐｏｌｙＡ终止子
的植物表达框），琼脂糖凝胶电泳纯化后分别与上述各基因片段连接。连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，挑选克隆
提取质粒ＤＮＡ酶切验证并测序，得到４个基因用于植物转化的双元载体，各载体的ＴＤＮＡ区段见图１。
１．２．３ 拟南芥的遗传转化及阳性苗的筛选 ２０１３年，利用电击法将各载体转入农杆菌ＧＶ３１０１：ｐＭＰ９０中，
采用农杆菌介导的花序浸渍法侵染拟南芥［１６］，每个基因各侵染３２株野生型拟南芥。将收获的各基因转化Ｔ０ 代
种子分别均匀播撒在３盘盛有营养土的培养托盘中，置于２２℃（昼）／１８℃（夜），光照周期为１６ｈ（光）／８ｈ（暗）的
人工气候室。待幼苗长出两片子叶后喷洒２～３次浓度为０．２％（体积比）的商业Ｂａｓｔａ除草剂筛选阳性苗。存活
植株用小量快速法［１７］提取植物基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增检测。用引物ＡｔＰＴ５′和ＣＰ４３′检测犮狆４犲狆狊狆狊转
化苗；扩增出１．８ｋｂ目的条带为阳性苗。用引物ＡｔＰＴＧＲ７９Ｆ和ＧＲ７９３′检测犌犚７９犲狆狊狆狊转化苗；扩增出１．５
ｋｂ目的条带的为阳性苗。用引物ＧＡＴ４６２１Ｆ／Ｒ检测犵犪狋４６２１转化苗；扩增出约２６９ｂｐ目的条带为阳性苗。用
引物ＧＡＴｍＦ／Ｒ检测犌犃犜犿转化苗；扩增出约２４５ｂｐ目的条带为阳性苗。
１６１第５期 刘健 等：四个抗草甘膦基因的抗性比较
１．２．４ 草甘膦抗性的鉴定 待喷洒Ｂａｓｔａ除草剂获得阳性苗后，对４个基因的转基因苗按照浓度从低至高逐
步喷施不同浓度的孟山都公司“农达”除草剂（Ｒｏｕｎｄｕｐ，４１％草甘膦异丙胺盐水剂）稀释液。稀释浓度梯度为
０．２％，０．４％，０．６％，０．８％（体积比），每隔３ｄ喷１次，每个梯度喷２次。统计４个基因的转化株在每个草甘膦
浓度下的存活率，存活率＝存活株数／Ｂａｓｔａ抗性株。每个基因３盘苗，为３次重复进行统计。
１．２．５ 基因表达量的定量ＰＣＲ检测 在０．４％浓度“农达”处理下，４个基因的转基因苗对草甘膦的抗性差异
已经非常明显。随机选取各基因的高抗与弱抗苗各１株，用ＴＲＩｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，用 ＭＭＬＶ翻转成ｃＤＮＡ。
以拟南芥犛犃犖犇基因（ＡＴ２Ｇ２８３９０）为内参进行基因表达量的荧光相对定量检测。基因检测引物为ＣＰ４Ｆ／Ｒ、
ＧＲ７９Ｆ／Ｒ、ＧＡＴ４６２１Ｆ／Ｒ、ＧＡＴｍＦ／Ｒ和ＳＡＮＤＦ／Ｒ。
１．３ 抗性分析
各基因在不同草甘膦浓度下的抗性差异，用ＳＰＳＳ软件进行差异显著性方差分析。
２ 结果与分析
２．１ 抗性基因的获得与载体构建
用引物ＡｔＰＴ５′和ＣＰ４３′以抗草甘膦玉米基因组ＤＮＡ为模板，扩增获得犮狆４犲狆狊狆狊基因。经ＧｅｎＢａｎｋ的
Ｂｌａｓｔ比对，该犮狆４犲狆狊狆狊基因序列５′端含１段与拟南芥犲狆狊狆狊基因（ＡＴ２Ｇ４５３００）前２２５ｂｐ同源性１００％的引导
肽序列；其犮狆４犲狆狊狆狊 基因区段与抗草甘膦大豆中犮狆４犲狆狊狆狊 基因（ＡＦ４６４１８８）核酸序列同源性最高，为
９９．６４％，氨基酸同源性为１００％。该犮狆４犲狆狊狆狊基因ＰＣＲ产物经犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ双酶切后连入植物表达载体
ｐＹＢＡ１３０５；酶切及测序验证正确后命名１３０５犮狆４犲狆狊狆狊。
由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司根据植物偏爱密码子合成的犌犚７９序列与原始序列核酸的同源性为７２．４８％，氨基酸同源
性为１００％。通过融合ＰＣＲ添加ＣＰＴ引导肽后，该犌犚７９犲狆狊狆狊基因ＰＣＲ产物经犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ双酶切后连
入植物表达载体ｐＹＢＡ１３０５；酶切及测序验证正确后命名１３０５犌犚７９犲狆狊狆狊。
基因犵犪狋４６２１合成后用犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ双酶切相应载体，纯化后的基因连入植物表达载体ｐＹＢＡ１３０５；酶切
及测序验证正确后命名１３０５犵犪狋４６２１。
根据单子叶植物偏爱密码子优化后，犌犃犜犿 与原始序列核酸的同源性为８２．１７％，氨基酸同源性为１００％。
基因犌犃犜犿合成后用犛犪犮Ⅰ和犓狆狀Ⅰ双酶切相应载体，纯化后的基因连入植物表达载体ｐＹＢＡ１３０５；酶切及测
序验证正确后命名１３０５犌犃犜犿。
图１ 载体犜犇犖犃区段示意图
犉犻犵．１ 犛狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳狋犺犲犜犇犖犃狉犲犵犻狅狀狅犳狏犲犮狋狅狉狊
Ａ：载体１３０５犮狆４犲狆狊狆狊Ｖｅｃｔｏｒ１３０５犮狆４犲狆狊狆狊；Ｂ：载体１３０５犌犚７９犲狆狊狆狊Ｖｅｃｔｏｒ１３０５犌犚７９犲狆狊狆狊；Ｃ：载体１３０５犵犪狋４６２１Ｖｅｃｔｏｒ１３０５
犵犪狋４６２１；Ｄ：载体１３０５犌犃犜犿Ｖｅｃｔｏｒ１３０５犌犃犜犿．
２６１ 草 业 学 报 第２４卷
２．２ 拟南芥的遗传转化及转基因阳性苗的筛选
利用电击法将４个载体分别转入农杆菌ＧＶ３１０１：ｐＭＰ９０中，采用农杆菌介导的花序浸渍法侵染拟南芥［１６］。
将每个载体收获的拟南芥Ｔ０ 代种子播种于３盘盛有营养土的托盘中置于人工气候室培养。因ｐＹＢＡ１３０５载体
的植物筛选标记基因为犅犪狉，转基因苗首先应具有草胺磷抗性。幼苗经喷洒２～３次Ｂａｓｔａ除草剂筛选后，能够
继续生长且长势良好的植株为抗性株。从各载体的抗性苗中随机抽取１２株提取植物基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ验
证，结果全部为阳性（图２），证明目的基因已整合到拟南芥植物基因组中。经统计４个载体１３０５犮狆４犲狆狊狆狊、
１３０５犌犚７９犲狆狊狆狊、１３０５犵犪狋４６２１和１３０５犌犃犜犿分别平均每盘各获得转化苗（１８５．７±１８．６），（１９２．０±２３．５），
（１４５．３±４３．５）和（１１９．０±８．５）棵；平均每转化１株拟南芥获得１１～１８株Ｔ１ 代转化苗。
图２ 转基因阳性苗４种抗性基因的犘犆犚检测
犉犻犵．２ 犜犺犲犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狊狅犳犳狅狌狉犵犾狔狆犺狅狊犪狋犲狉犲狊犻狊狋犪狀狋犵犲狀犲狊犳狉狅犿狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
Ａ：犮狆４犲狆狊狆狊；Ｂ：犌犚７９犲狆狊狆狊；Ｃ：犵犪狋４６２１；Ｄ：犌犃犜犿；Ｍ：ＤＮＡ分子量标记ＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１～１２：不同转化植株Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；１３：空白
对照Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ．
２．３ 草甘膦抗性的比较
图３ 不同草甘膦浓度梯度下各基因转化苗的存活率
犉犻犵．３ 犜狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊狊狌狉狏犻狏犪犾犪犿狅狌狀狋狅狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋
犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳犵犾狔狆犺狅狊犪狋犲
不同字母表示差异显著（犘＜０．０５）。Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（犘＜０．０５）．
在先经除草剂Ｂａｓｔａ筛选的基础上，分别对４
个载体的转化苗逐步喷施了０．２％～０．８％四个浓
度梯度的“农达”。转化苗喷施草甘膦后的存活率统
计结果见图３，生长情况见图４。由图３和图４可以
看到各浓度下ＧＡＴ类（犵犪狋４６２１和犌犃犜犿）转化苗
的存活率都较ＥＰＳＰＳ类（犮狆４犲狆狊狆狊和犌犚７９犲狆
狊狆狊）转化苗的存活率高。结果显示浓度间和基因间
的差异都达到了极显著的水平（犘＜０．０５）。相比低
浓度的０．２％，当浓度提升至０．６％时差异开始显
著。４个基因间的差异都达到了显著性水平（犘＜
０．０５）；其中抗性最好的犵犪狋４６２１与其他３个基因的
差异达到极显著水平。
对４个“农达”浓度和４个基因组成的全部１６
个处理的存活率进行单因子方差分析（图３）。
犵犪狋４６２１基因对草甘膦的抗性最好，在各浓度下存活率均表现为最高值，且抗性稳定，只在０．８％浓度时才有所下
降，差异达到显著性水平。犌犃犜犿基因对草甘膦也表现出良好的抗性，但随着浓度的提高抗性逐渐下降，浓度达
到０．６％时基因内差异达到了显著水平；其与犵犪狋４６２１基因的抗性在０．２％的浓度时无差异。
３６１第５期 刘健 等：四个抗草甘膦基因的抗性比较
图４ 不同草甘膦浓度梯度下各基因转化苗的存活情况
犉犻犵．４ 犜犺犲犵狉狅狑狋犺狊犻狋狌犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犵犲狀犲狊狅狀狋犺犲犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳犵犾狔狆犺狅狊犪狋犲
图５ 喷施草甘膦后犌犃犜类和犲狆狊狆狊类基因转化苗的抽苔情况
犉犻犵．５ 犜犺犲犫狅犾狋犻狀犵狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊狅犳犌犃犜狅狉犲狆狊狆狊犵犲狀犲狊
Ａ：犌犃犜犿 转化苗 Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｏｆ犌犃犜犿；Ｂ：犮狆４犲狆狊狆狊
转化苗Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｏｆ犮狆４犲狆狊狆狊．
图６ 犲狆狊狆狊类和犌犃犜类基因转化苗的果荚结实情况
犉犻犵．６ 犜犺犲狊犻犾犻狇狌犲狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊狅犳犌犃犜狅狉犲狆狊狆狊犵犲狀犲狊
Ａ：犮狆４犲狆狊狆狊转化苗 Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｏｆ犮狆４犲狆狊狆狊；Ｂ：犌犃犜犿
转化苗 Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｏｆ犌犃犜犿．
４６１ 草 业 学 报 第２４卷
犲狆狊狆狊基因转化苗对草甘膦相对较敏感。在喷施０．２％的“农达”后，犌犚７９犲狆狊狆狊基因转化苗的存活率急剧
下降至４２．０８％。犮狆４犲狆狊狆狊基因转化苗的存活率虽然达到８３．０６％，但其中许多苗出现心叶变黄不良症状（图
４）。当“农达”浓度达到０．４％时，犮狆４犲狆狊狆狊基因转化苗中前期表现不良症状的苗死亡，存活率降到４９．２１％。
当浓度提高到０．８％时，犮狆４犲狆狊狆狊基因转化苗的存活率下降到１７．０４％。各浓度下犌犚７９犲狆狊狆狊基因转化苗的
存活率最低，且均约为犮狆４犲狆狊狆狊基因转化苗存活率的５０％，在低浓度时差异达显著水平。
２．４ 喷施草甘膦后抗性苗的不良症状
由于在长日照条件下拟南芥Ｃｏｌ０生态型生长３～４周后开始抽苔。当用０．２％浓度的“农达”处理转化苗时
生长时期已经接近３周，部分苗已经开始抽苔。随着施用“农达”浓度的提高和生长期的变化，犲狆狊狆狊高抗转化苗
陆续抽苔开花，但ＧＡＴ转化苗表现出抽苔受到抑制，叶片颜色变暗（图４）。但在停止继续喷施草甘膦后，生长受
到抑制的转化苗叶片逐渐转绿，并陆续抽苔结实（图５Ａ）。犲狆狊狆狊存活的高抗转化苗在喷施草甘膦后抽苔没有受
到影响，叶片颜色较绿（图５Ｂ）；但在种子收获时发现所有的果荚都没有结实（图６Ａ），没有收到１粒种子。在体
式显微镜下拨开犲狆狊狆狊转化苗的果荚可以看到所有的胚珠都在早期停止了发育，而ＧＡＴ转化苗的果荚内胚珠发
育成正常的种子（图６Ｂ）。将ＧＡＴ转化苗收获的种子播种于人工气候室，经喷洒除草剂Ｂａｓｔａ后，存活的抗性苗
在不喷施除草剂“农达”的条件下可以正常抽苔结实。
２．５ 草甘膦抗性与基因表达量的关系
图７ 转基因苗的基因表达量分析
犉犻犵．７ 犜犺犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犵犲狀犲狊犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
当“农达”浓度提升到０．４％时，４个基因的转化苗
都出现生长受到抑制幼苗。各基因转化苗中随机选取
高抗和弱抗幼苗各１株，提取叶片总ＲＮＡ并反转录
成ｃＤＮＡ。在检测ＲＮＡ无基因组ＤＮＡ污染后，用此
ｃＤＮＡ为模板，以犛犃犖犇为内源参照基因进行抗性基
因表达的荧光相对定量分析（犛犃犖犇 基因引物见表
１）。结果如图７所示，４个基因分别在高抗株中的表
达量远高于弱抗株。为了明确高抗株的高抗性是否源
于拷贝数的增加而引起。分别对犵犪狋４６２１和犌犃犜犿
各１６个高抗转化株Ｔ２ 代幼苗进行了抗除草剂Ｂａｓｔａ
分离比统计。犵犪狋４６２１和犌犃犜犿 各有７５．０％和４３．８％
的转化株系符合３∶１分离比，这些株系可以初步认为是单拷贝插入。
３ 讨论
草甘膦抗性是重要的农艺性状。本研究选取两类４个草甘膦抗性基因构建于同一载体的相同克隆位点，且
犲狆狊狆狊类基因都含有相同的ＣＰＴ引导肽序列，相对客观地体现了该４个基因对草甘膦的真实抗性。从Ｔ１ 代转
化苗喷施“农达”后的存活率来看，犌犃犜类基因的抗性明显高于犲狆狊狆狊类基因。先锋公司的犵犪狋４６２１是由地衣芽
孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犾犻犮犺犲狀犻犳狅狉犿犻狊）３个菌株的犌犃犜基因经体外重组（ＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）后大量筛选获得。此外，为了
在植物中更好表达该蛋白，一个由ＧＣＴ编码的丙氨酸被插在蛋白质氨基酸序列的第二位［１８］。国内发掘的ＧＡＴ
蛋白氨基酸序列第二位不含有插入的丙氨酸，也表现出对草甘膦的良好抗性，且在施用低浓度草甘膦时抗性已经
接近犵犪狋４６２１，其在将来的农业生产上应具有广阔的应用前景。犌犃犜类基因的转化苗在喷施高浓度“农达”条件
下存活率高，但严重抑制抽苔。由于在不施用草甘膦时ＧＡＴ转基因苗能够正常抽苔，这种抽苔抑制可能是由于
中间产物ＮＡＧ不能迅速降解而积累所致。这一现象以前未见相关报道，具体原因有待以后进一步深入研究。
在实际应用中注意草甘膦的施用浓度，将有助于防止或缓解药害的发生。
采用过量表达犲狆狊狆狊或引入突变的犲狆狊狆狊使植物获得对草甘膦耐性方法易造成植物体内草甘膦的累积，使
植物出现败育、授粉率降低、不耐胁迫、农艺性状改变等问题［１９］。本研究结果再次证实尽管转犲狆狊狆狊基因可以获
得高抗草甘膦植株，但在花期喷施草甘膦将造成败育，这就要求在草甘膦的实际使用中注意作物适用生育期。
５６１第５期 刘健 等：四个抗草甘膦基因的抗性比较
研究结果显示高抗转基因植株是由于转入基因的转录水平（或表达量）高；而从分离比看这又不是因为多拷
贝引起；更主要的原因应该是由不同的插入位点所致。最近的研究发现由于草甘膦的多年使用，在选择压下自然
界中的杂草有的对草甘膦产生了自然抗性。美国佐治亚州的抗草甘膦长芒苋（犃犿犪狉犪狀狋犺狌狊狆犪犾犿犲狉犻）中含有５～
１６０倍拷贝数的犲狆狊狆狊基因，且分布于每条染色体［２０］，表明多拷贝超剂量的表达抗性基因可增加植物的草甘膦抗
性。虽然多拷贝的转入外源基因有可能造成转入的基因沉默和抑制，但在适当的情况下这未尝不是一种可用的
手段。此外，将犲狆狊狆狊基因和草甘膦降解基因联合使用将有可能做到优势互补。
本研究只是利用十字花科模式植物进行的验证。由于不同的物种自身对草甘膦的抗性表现不同，在单子叶
大田作物中抗性基因的抗性和表现可能会有差异。在目前的大田作物应用中犮狆４犲狆狊狆狊基因仍是最主要的草甘
膦抗性基因［３］。从基因大小和抗性强弱考虑，ＧＡＴ类基因作为筛选标记基因应该更为适合，但在具体实施中应
注意草甘膦的施用浓度。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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６６１ 草 业 学 报 第２４卷