全 文 ：书一年生黑麦草制取燃料酒精发酵工艺的初步研究
代王莹，郭和蓉，张兴龙，李强
（华南农业大学农学院，广东 广州５１０６４２）
摘要：以分别经过酸预处理（１％ Ｈ２ＳＯ４）和碱预处理（１０％ ＮａＯＨ），再用绿色木酶酶解的一年生黑麦草邦德
（Ａｂｕｎｄａｎｔ）为材料，进行了燃料酒精发酵工艺研究。结果表明，通过预处理后，方案１（普通酵母＋毕赤酵母，体积
比７∶３）的相对最优发酵条件为：温度３７℃，菌株浓度１０％，ｐＨ５．５，时间４８ｈ。方案２（普通酵母＋毕赤酵母＋黑
曲霉，体积比７∶３∶２）的相对最优发酵条件为：温度３７℃，菌株浓度１２％，ｐＨ５．５，时间４８ｈ。２种方案中，菌株浓
度和发酵温度是比较重要的影响因素。对于酸碱预处理而言，均是发酵方案２的原料酒精转化率相对较高，分别
为８．３６％和８．３９％，差异不显著。
关键词：一年生黑麦草；发酵工艺；酒精度；原料酒精转化率；燃料酒精
中图分类号：Ｓ５４３＋．６０９．９　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０１０２２００９
　 目前国内外生产燃料酒精的原料主要有玉米（犣犲犪犿犪狔狊）（美国）［１］、甘蔗（犛犪犮犮犺犪狉狌犿狅犳犳犻犮犻狀犪狉狌犿）（巴
西）［２］、薯类、谷类等，考虑到粮食短缺、人口压力等问题，寻找一种新的燃料酒精的生产底物势在必行。纤维质原
料具有来源广泛、成本低廉、可再生等优点［３］，因此被看作是最具价值的生产燃料酒精的潜在资源，以将纤维素为
原料转化为燃料酒精最具现实意义。在纤维素燃料酒精转化的生产和研究方面，巴西和美国走在了世界的前
列［４］。巴西开发了以甘蔗渣为原料制酒精的新技术（迪丁尼快速水解法，ＤＨＲ），减少水解蔗渣的时间而获得高
的转化率［５］；美国也进行了“纤维素水解与发酵同步”及木质纤维素“溶解性分离”等一系列研究工作［６］，但以纤维
素制乙醇的工业规模技术一直未达到成熟［７］。此外，加拿大Ｉｏｇｅｎ公司在纤维乙醇技术开发，尤其是纤维素酶技
术开发方面居世界领先地位［８］；德国产业技术综合研究所进行发酵液中乙醇的膜分离技术的开发；日本也建立了
较完善的与纤维素燃料乙醇相关的研发体系［５］。
我国在纤维素酒精生产和技术开发上也取得了一些重要进展。中粮集团在黑龙江肇东建立了年产５００ｔ的
纤维素乙醇中试装置，并已经拥有３６项燃料酒精方面的专利，其中，与纤维素酒精相关的有１４项；２００８年５月８
日，河南天冠集团研制建成了中国首条年产５０００ｔ纤维酒精项目产业化生产线，并且顺利产出了第一批纤维酒
精［６］。中国科学院过程工程所已在山东建立了年产３０００ｔ的纤维乙醇示范工程；吉林燃料乙醇有限公司已和华
东理工大学就建立年产３０００ｔ纤维乙醇的合作达成协议，并启动了项目实施［８］。除此之外，我国也进行了“利用
农业纤维废弃物代替粮食生产酒精”，玉米秸秆间歇蒸汽爆破预处理、纤维素酶水解和戊糖己糖同步发酵技术制
取纤维乙醇中试装置等一系列研究工作［６］。
一年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）是禾本科黑麦草属植物，生长速度快，产量高［９］，易种植，好管理［１０］，是
我国南方广泛栽培的优良牧草［１１］。目前，可作为能源植物发展的植物种类丰富，如甘蔗［１２］渣、麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊
狋犻狏狌犿）秆［１３］、柳枝稷（犘犪狀犻犮狌犿狏犻狉犵犪狋狌犿）［１４，１５］等。它们的木质素含量［１６１８］均比一年生黑麦草高，而它们的纤维
素和半纤维素含量［１６１８］与一年生黑麦草却有着极大的相似性。另外，一年生黑麦草纤维构成适合于酒精的转化，
所以具有较大的研究和开发价值。有研究表明黑麦草已经被应用到发酵等工业领域，将其经过预处理及纤维素、
半纤维素酶解后，对探索生物酒精的制备有重要意义［１９］。本试验采用２种发酵方案，研究利用一年生黑麦草发
酵处理制取酒精，通过对影响因素的优化，得出最佳发酵体系，为再生能源的开发寻找到一条新的途径。
２２０－２２８
２０１２年２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第１期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
 收稿日期：２０１０１１２５；改回日期：２０１１０３２９
基金项目：广东省科技计划项目（工业攻关计划，能源技术）（２００６Ａ１０７０３００３）和广东生物质产业化发展研究（广东软科学计划项目）
（２００７Ｂ０７０９００１１１）资助。
作者简介：代王莹（１９８６），女，江西樟树人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：４５４７２８７００＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｈｅｒｏｎｇ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　材料
试验于２００８－２００９年在华南农业大学农学院进行，以分别经过酸预处理［在温度１２０℃条件下，粒度１８～３５
目（０．４２５～０．８８０ｍｍ）的邦德以８∶１液固比经１％ Ｈ２ＳＯ４ 处理２ｈ］和碱预处理［在温度１００℃条件下，粒度
１８～３５目（０．４２５～０．８８０ｍｍ）的邦德以６∶１液固比经１０％ ＮａＯＨ 处理２ｈ］，再用绿色木酶（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪
狏犻狉犻犱犲）酶解７２ｈ后的一年生黑麦草邦德（犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿ｃｖ．Ａｂｕｎｄａｎｔ）为材料。
１．２　发酵单因素试验
经过酶解后的酸碱预处理材料在发酵阶段主要采取２种方案，酵母组合均为普通酿酒酵母（犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊
犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲，产品代码ＣＩＣＣ１００１）＋毕赤酵母（犘犻犮犺犻犪狆犪狊狋狅狉犻狊）。方案１：预处理材料＋酵母组合，体积比约为
７∶３；方案２：预处理材料＋酵母组合＋黑曲霉（犃狊狆犲狉犵狌犾犾狌狊狀犻犵犲狉，产品代码ＡＳ３．８７７），体积比约为７∶３∶２。
所有微生物均由广州微生物所提供。发酵处理的具体方法见表１，试验设３次重复，测定指标为酒精度、原料酒
精转化率。
１．３　发酵正交试验
为进一步优化发酵的工艺条件和研究各因素对发酵影响的主次顺序，采用正交试验研究了发酵温度、时间和
菌株浓度对预处理的影响，其中酸碱预处理的ｐＨ均是５．５，其余各因素水平是在单因素试验基础上选定的，测
定指标及试验重复次数同单因素试验，试验条件见表２。
１．４　发酵方法
将酸碱预处理＋酶解后的材料放在２５０ｍＬ三角瓶中进行发酵试验，每瓶装酸（碱）预处理液体（中和后，全
部加入）、（ＮＨ４）ＨＰＯ４（０．２５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）共１００ｍＬ。灭菌后置恒温振荡培养箱内振荡培
养，控制温度３１～４３℃。按发酵液体积的８％～１４％接种菌株。
表１　酸碱预处理材料酶解后的发酵单因素试验
犜犪犫犾犲１　犚犪狀犵犲狅犳犳犪犮狋狅狉狊犻狀犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狊犻狀犵犾犲犳犪犮狋狅狉狋犲狊狋犫犪狊犲犱狅狀狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋狑犻狋犺
犎２犛犗４（犖犪犗犎）犪狀犱犲狀狕狔犿犪狋犻犮犺狔犱狉狅犾狔狊犻狊
影响因素
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆａｃｔｏｒ
酸碱预处理＋酶解＋酵母组合
Ｈ２ＳＯ４（ＮａＯＨ）ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
菌株浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ
（％）
时间
Ｔｉｍｅ
（ｈ）
ｐＨ
酸碱预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉
Ｈ２ＳＯ４（ＮａＯＨ）ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ＋犃．狀犻犵犲狉
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
菌株浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ
（％）
时间
Ｔｉｍｅ
（ｈ）
ｐＨ
温度处理
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
３１ １０ ４８ ５．５ ３１ １２ ４８ ５．５
３７ １０ ４８ ５．５ ３７ １２ ４８ ５．５
４３ １０ ４８ ５．５ ４３ １２ ４８ ５．５
时间处理
Ｔｉｍｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
３７ １０ ３６ ５．５ ３７ １２ ３６ ５．５
３７ １０ ４８ ５．５ ３７ １２ ４８ ５．５
３７ １０ ６０ ５．５ ３７ １２ ６０ ５．５
酸度处理
Ａｃｉｄｉｔｙｔｒｅａｔｍｅｔ
３７ １０ ４８ ４．０ ３７ １２ ４８ ４．０
３７ １０ ４８ ５．５ ３７ １２ ４８ ５．５
３７ １０ ４８ ６．０ ３７ １２ ４８ ６．０
浓度处理
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
３７ ８ ４８ ５．５ ３７ １０ ４８ ５．５
３７ １０ ４８ ５．５ ３７ １２ ４８ ５．５
３７ １２ ４８ ５．５ ３７ １４ ４８ ５．５
１２２第２１卷第１期 草业学报２０１２年
表２　硫酸（氢氧化钠）预处理材料酶解后的发酵正交试验
犜犪犫犾犲２　犚犪狀犵犲狅犳犳犪犮狋狅狉狊犻狀犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾狋犲狊狋犫犪狊犲犱狅狀狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋
狑犻狋犺犎２犛犗４（犖犪犗犎）犪狀犱犲狀狕狔犿犪狋犻犮犺狔犱狉狅犾狔狊犻狊
试验序号
Ｔｅｓｔｓｅｒｉａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
酸（碱）预处理＋酶解＋酵母组合
Ｈ２ＳＯ４（ＮａＯＨ）ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
菌株浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ（％）
时间
Ｔｉｍｅ（ｈ）
酸（碱）预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉
Ｈ２ＳＯ４（ＮａＯＨ）ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ＋犃．狀犻犵犲狉
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
菌株浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ（％）
时间
Ｔｉｍｅ（ｈ）
１ ３１ ８ ３６ ３１ １０ ３６
２ ３１ １０ ４８ ３１ １２ ４８
３ ３１ １２ ６０ ３１ １４ ６０
４ ３７ ８ ４８ ３７ １０ ４８
５ ３７ １０ ６０ ３７ １２ ６０
６ ３７ １２ ３６ ３７ １４ ３６
７ ４３ ８ ６０ ４３ １０ ６０
８ ４３ １０ ３６ ４３ １２ ３６
９ ４３ １２ ４８ ４３ １４ ４８
１．５　测定指标
１．５．１　酒精度　发酵结束后将发酵液置于蒸馏瓶中，缓缓加热蒸馏，收集约９６ｍＬ馏出液，定容至１００ｍＬ容量
瓶，调温至２０℃。用２５ｍＬ附温度计密度瓶测试样馏出液２０℃的相对密度，附温度计比重瓶（整套）先用蒸馏水
清洗干净，再用乙醇、乙醚清洗干净，称得自重，计Ｇ１；蒸馏水煮沸３０ｍｉｎ冷却至１５℃注满瓶中，装上温度计（注
意排空瓶中气体），浸入（２０±１）℃的恒温水浴锅中，至比重瓶温度稳定到２０～３０℃，用滤纸吸去侧管之水，盖上
小罩，取出擦干，称得瓶（整套）和水之重，计Ｇ３；重复上一步骤测定待测液体，称得瓶（整套）和待测液之重，计
Ｇ２；酒精相对密度（２０℃）计算公式：犢＝（犌２－犌１）×０．９９８２３／（犌３－犌１），根据相对密度查表，得到试样的酒精度
（Ｑ）。酒精相对密度见文献［２０］。
１．５．２　原料酒精转化率　原料酒精转化率计算公式
狔＝（犙×犞×０．８／２５．００）×１００％
式中，ｙ表示原材料酒精转化率（％，ｗ／ｗ），Ｑ表示酒精度（％，Ｖ／Ｖ），Ｖ（ｍＬ）是蒸馏液体积，０．８（ｇ／ｍＬ）是酒精密
度，２５．００（ｇ）表示原材料质量。
１．６　数据处理和统计分析
采用ＳＡＳ８．１和Ｅｘｃｅｌ２００３进行试验数据统计分析。
２　结果与分析
２．１　发酵温度的影响
２种发酵处理的酒精度随着温度的升高均呈现出先增加后减少的趋势（图１）。酸预处理＋酶解和碱预处理
＋酶解材料的２种发酵处理的酒精度均在３７℃时达到最大值，分别为２．３％，２．５％和２．１％，２．５％。酵母组合
＋黑曲霉处理的酒精度略高于酵母组合处理，差异不显著，说明黑曲霉起到了同步降解纤维素的作用。３７℃是比
较理想的发酵温度。
２．２　发酵时间的影响
２种发酵处理的酒精度随着发酵时间的延长均呈现出先增加后基本保持不变的趋势（图２）。当发酵时间在
３６ｈ左右时，酸预处理＋酶解材料的２种发酵处理的酒精度比较接近，而碱预处理＋酶解材料的２种发酵处理的
酒精度却相差较大，但二者差值却相对恒定，表现为随着发酵时间的延长，绝对差值变幅不大。酸预处理＋酶解
２２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
和碱预处理＋酶解材料的２种发酵处理的酒精度分别在３６～４８和４８～６０ｈ时达到最大值，分别为２．３％，２．５％
和２．１％，２．４％。酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度略高于酵母组合处理，差异不显著。结合发酵数据发现，发酵
时间超过４８ｈ后，酒精度的增加幅度接近于０或者出现负增长，这可能与微生物自身消耗有一定的关系，综合考
虑认为４８ｈ是相对最优的发酵时间。
图１　不同发酵温度下的酒精度比较
犉犻犵．１　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狋犲狀狋犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊
　Ａ：硫酸预处理＋绿色木霉酶解７２ｈ后的发酵情况；Ｂ：氢氧化钠预处理＋绿色木霉酶解７２ｈ后的发酵情况。下同。Ａ：ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ，ｆｉｒｓｔｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙＨ２ＳＯ４ａｎｄｔｈｅｎｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙ犜．狏犻狉犻犱犲ｆｏｒ７２ｈ；Ｂ：ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｆｉｒｓｔｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙＮａＯＨａｎｄｔｈｅｎｈｙ
ｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙ犜．狏犻狉犻犱犲ｆｏｒ７２ｈ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
图２　不同发酵时间下的酒精度比较
犉犻犵．２　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狋犲狀狋犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狋犻犿犲
２．３　发酵液ｐＨ值的影响
２种发酵处理的酒精度随着ｐＨ的升高均呈现出先增加后减少的趋势（图３）。酸预处理＋酶解材料的２种
发酵处理的酒精度范围分别是１．４％～２．３％和１．５％～２．５％，碱预处理＋酶解材料的２种发酵处理的酒精度范
围分别是１．４％～２．１％和１．６％～２．５％，且均在ｐＨ为５．５时达到最大值，酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度略
高于酵母组合处理，差异不显著。
２．４　菌株浓度的影响
２种发酵处理的酒精度随着菌株浓度的升高均呈现出先增加后减少的趋势（图４）。酵母组合＋黑曲霉处理
的酒精度高于酵母组合处理，说明黑曲霉起到了同步降解纤维素的作用。
在不同菌株浓度下，酵母组合处理的酒精度范围分别是１．９％～２．３％和１．７％～２．３％，酵母组合＋黑曲霉
处理的酒精度范围分别是２．１％～２．５％和２．１％～２．３％。两种发酵处理的酒精度在菌株浓度分别为１０％、
１２％时达到最大值。
３２２第２１卷第１期 草业学报２０１２年
图３　不同狆犎值下的酒精度比较
犉犻犵．３　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狋犲狀狋犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犎狏犪犾狌犲狊
图４　不同菌株浓度下的酒精度比较
犉犻犵．４　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狋犲狀狋犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳狊狋狉犪犻狀狊
　Ａ：硫酸预处理＋绿色木霉酶解７２ｈ后的发酵情况；Ｂ：氢氧化钠预处理＋绿色木霉酶解７２ｈ后的发酵情况。下同。Ａ：ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ，ｆｉｒｓｔｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙＨ２ＳＯ４ａｎｄｔｈｅｎｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙ犜．狏犻狉犻犱犲ｆｏｒ７２ｈ；Ｂ：ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｆｉｒｓｔｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙＮａＯＨａｎｄｔｈｅｎｈｙ
ｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙ犜．狏犻狉犻犱犲ｆｏｒ７２ｈ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．５　发酵正交试验分析
２．５．１　原料酒精转化率变化趋势　２种发酵方案的原料酒精转化率随着温度的升高均表现出先升高后降低的
趋势（图５，６），随着发酵时间的延长，原料酒精转化率表现出先有所增加后维持稳定的趋势，当发酵时间超过４８
ｈ以后，原料酒精转化率变化幅度不大，时间过长还会导致原料酒精转化率出现负增长。
酸（碱）预处理＋酶解后的材料在发酵阶段，随着菌株浓度的增加呈抛物线形状（图７），即在菌株浓度达到一
定程度时，菌株浓度的增加会降低原料酒精转化率，这与微生物自身的消耗有关。随着发酵温度的增加、发酵时
间的延长、菌株浓度的增加，原料酒精转化率均呈先增加后降低的趋势。
由图５～７可以得出合适的发酵温度、适中的发酵时间与适宜的菌株浓度均有利于原料酒精转化率的提高，
与单因素试验结果一致。
２．５．２　正交试验结果与极差分析　酸预处理＋酶解＋酵母组合的酒精度与原料酒精转化率影响因素主次顺序
相同（表３，４），均为菌株浓度＞发酵温度＞发酵时间；酸（碱）预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉和碱预处理＋酶
解＋酵母组合３种处理方式的酒精度与原料酒精转化率影响因素主次顺序均相同，均为发酵温度＞菌株浓度＞
发酵时间。
酸预处理＋酶解＋酵母组合正交试验的最优水平组合相同，均为 Ｄ２Ｅ２Ｆ２，即发酵温度３７℃，菌株浓度
１０％，发酵时间４８ｈ；酸预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉正交试验的最优水平组合相同，均为Ｄ２Ｅ３Ｆ１，即温度
４２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
３７℃，菌株浓度１４％，发酵时间３６ｈ（表４）。整体上对于酸预处理＋酶解的材料而言，２种发酵方案的相对最优
发酵温度均为３７℃，但相对最优菌株浓度和发酵时间均不一致。结合单因素试验和极差值可以得出，随着菌株
浓度的提高，原料酒精转化率的提高幅度不明显，但至于是否会缩短发酵时间还有待于进一步验证。综合考虑认
为菌株浓度１２％，发酵时间４８ｈ是相对最优的选择。
图５　原料酒精转化率随温度提高的变化趋势
犉犻犵．５　犜犺犲狋狉犲狀犱狅犳犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狏犲狉狊犻狅狀狉犪狋犲狅犳狉犪狑犿犪狋犲狉犻犪犾狊狑犻狋犺狋犺犲狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犻狀犮狉犲犪狊犲
图６　原料酒精转化率随发酵时间延长的变化趋势
犉犻犵．６　犜犺犲狋狉犲狀犱狅犳犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狏犲狉狊犻狅狀狉犪狋犲狅犳狉犪狑犿犪狋犲狉犻犪犾狊狑犻狋犺狋犺犲犲狓狋犲狀狊犻狅狀狅犳犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狋犻犿犲
图７　原料酒精转化率随菌株浓度增加的变化趋势
犉犻犵．７　犜犺犲狋狉犲狀犱狅犳犪犾犮狅犺狅犾犮狅狀狏犲狉狊犻狅狀狉犪狋犲狅犳狉犪狑犿犪狋犲狉犻犪犾狊狑犻狋犺狋犺犲犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳狊狋狉犪犻狀狊犻狀犮狉犲犪狊犲
５２２第２１卷第１期 草业学报２０１２年
表３　酸碱预处理邦德酶解后发酵的正交试验结果
犜犪犫犾犲３　犚犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀狅狀犃犫狌狀犱犪狀狋犫犪狊犲犱狅狀狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋
狑犻狋犺犎２犛犗４（犖犪犗犎）犪狀犱犲狀狕狔犿犪狋犻犮犺狔犱狉狅犾狔狊犻狊 ％
试验序号
Ｔｅｓｔ
ｓｅｒｉａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
预处理＋酶解＋酵母组合
Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
酸预处理 Ｈ２ＳＯ４ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｊ ｋ
碱预处理ＮａＯＨｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｊ ｋ
预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋
ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ＋犃．狀犻犵犲狉
酸预处理 Ｈ２ＳＯ４ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｊ ｋ
碱预处理ＮａＯＨｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｊ ｋ
１ ２．０１ ６．１７ １．８１ ５．５６ ２．０９ ６．４２ １．９１ ５．８７
２ ２．１０ ６．４７ １．９１ ５．８７ ２．１２ ６．５１ ２．１０ ６．４５
３ ２．１０ ６．４７ １．９１ ５．８７ ２．１１ ６．４９ ２．１２ ６．５１
４ ２．０６ ６．３３ １．９５ ５．９８ ２．１４ ６．５８ ２．４６ ７．５６
５ ２．２８ ７．０１ ２．２８ ７．００ ２．７１ ８．３３ ２．７３ ８．３９
６ ２．０９ ６．４１ ２．１１ ６．４８ ２．７２ ８．３６ ２．２１ ６．７９
７ １．９４ ５．９７ １．９０ ５．８４ ２．２８ ７．００ ２．３０ ７．０７
８ ２．１５ ６．６０ ２．０７ ６．３６ ２．３８ ７．３０ ２．５２ ７．７４
９ ２．１９ ６．７２ ２．１９ ６．７３ ２．４３ ７．４６ ２．４９ ７．６５
　ｊ：酒精度；ｋ：原料酒精转化率；试验序号同表２。
　ｊ：ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ；ｋ：ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｒａｗｍａｔｅｒｉａｌ；ＴｈｅｔｅｓｔｓｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｓａｒｅｔｈｅｓａｍｅａｓＴａｂｌｅ２．
表４　酸碱预处理邦德酶解后发酵的正交试验极差分析
犜犪犫犾犲４　犜犺犲狉犪狀犵犲犪狀犪犾狔狊犻狊犿犲狋犺狅犱狅犳狋犺犲犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋狅狀犃犫狌狀犱犪狀狋
犫犪狊犲犱狅狀狆狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋狑犻狋犺犎２犛犗４（犖犪犗犎）犪狀犱犲狀狕狔犿犪狋犻犮犺狔犱狉狅犾狔狊犻狊
项目
Ｉｔｅｍ
预处理＋酶解＋酵母组合
Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
＋ｙｅａｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
酸预处理
Ｈ２ＳＯ４ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｄ Ｅ Ｆ
碱预处理
ＮａＯＨｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｄ Ｅ Ｆ
预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉
Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ＋ｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ＋ｙｅａｓｔ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ＋犃狊狆犲狉犵狌犾犾狌狊狀犻犵犲狉
酸预处理
Ｈ２ＳＯ４ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｄ Ｅ Ｆ
碱预处理
ＮａＯＨｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｄ Ｅ Ｆ
ｊ１ ２．０７ ２．００ ２．０８ １．８８ １．８９ ２．００ ２．１１ ２．１７ ２．４０ ２．０４ ２．２２ ２．２１
ｊ２ ２．１４ ２．１８ ２．１２ ２．１１ ２．０９ ２．０２ ２．５２ ２．４０ ２．２３ ２．４７ ２．４５ ２．３５
ｊ３ ２．０９ ２．１３ ２．１１ ２．０５ ２．０７ ２．０２ ２．３６ ２．４２ ２．３７ ２．４４ ２．２７ ２．３５
ｋ１ ６．３７ ６．１６ ６．３９ ５．７７ ５．７９ ６．１３ ６．４７ ６．６７ ７．３６ ６．２８ ６．８３ ６．８０
ｋ２ ６．５８ ６．６９ ６．５０ ６．４９ ６．４１ ６．１９ ７．７５ ７．３８ ６．８５ ７．５８ ７．５３ ７．２２
ｋ３ ６．４３ ６．５３ ６．４８ ６．３１ ６．３６ ６．２０ ７．２５ ７．４３ ７．２７ ７．４９ ６．９８ ７．３２
Ｒ（ｊ） ０．０７ ０．１８ ０．０４ ０．２３ ０．２０ ０．０２ ０．４１ ０．２５ ０．１７ ０．４３ ０．２３ ０．１４
Ｒ（ｋ） ０．１８ ０．５３ ０．１１ ０．７２ ０．３２ ０．０７ １．３２ ０．７６ ０．４１ １．３０ ０．７０ ０．５２
ｊ最优水平Ｏｐｔｉｍｕｍｌｅｖｅｌｏｆｊ Ｄ２ Ｅ２ Ｆ２ Ｄ２ Ｅ２ Ｆ２ Ｄ２ Ｅ３ Ｆ１ Ｄ２ Ｅ２ Ｆ２
ｋ最优水平Ｏｐｔｉｍｕｍｌｅｖｅｌｏｆｋ Ｄ２ Ｅ２ Ｆ２ Ｄ２ Ｅ２ Ｆ３ Ｄ２ Ｅ３ Ｆ１ Ｄ２ Ｅ２ Ｆ３
　ｊ：酒精度；ｋ：原料酒精转化率；Ｄ：发酵温度；Ｅ：菌株浓度；Ｆ：发酵时间。Ｄ２：３７℃；Ｅ２：１０％；Ｅ３：１２％；Ｆ１：３６ｈ；Ｆ２：４８ｈ；Ｆ３：６０ｈ．
　ｊ：ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ；ｋ：ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｓ；Ｄ：ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｅ：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ；Ｆ：ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ；Ｄ２：
３７℃ｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｅ２：１０％ｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ；Ｅ３：１２％ｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎ；Ｆ１：３６ｈｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ．Ｆ２：４８ｈｉｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ；Ｆ３：６０ｈｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ．
６２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
　　碱预处理＋酶解＋酵母组合正交试验的最优水平组合分别为Ｄ２Ｅ２Ｆ２和Ｄ２Ｅ２Ｆ３，即相对最优发酵温度和
菌株浓度均一致，分别为３７℃和１０％，相对最优发酵时间不一致。碱预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉正交试
验的最优水平组合分别为Ｄ２Ｅ２Ｆ２和Ｄ２Ｅ２Ｆ３，即相对最优温度和菌株浓度均一致，分别为３７℃和１２％，相对最
优发酵时间不一致。结合单因素试验和极差值可以得出，发酵时间在超过４８ｈ后，原料酒精转化率变化幅度不
大，时间过长还会导致原料酒精转化率出现负增长。整体上对于碱预处理＋酶解的材料而言，２种发酵方案的相
对最优发酵温度均为３７℃，相对最优菌株浓度分别为１０％和１２％，相对最优发酵时间均为４８ｈ。
３　讨论与结论
本试验主要针对普通酵母、毕赤酵母、黑曲霉进行了一些探索。通过预处理后，方案１（普通酵母＋毕赤酵
母，体积比７∶３）的相对最优发酵条件为：温度３７℃，菌株浓度１０％，ｐＨ５．５，时间４８ｈ。在此条件下，酸碱预处
理＋酶解后发酵的酒精度分别为２．２％和２．１％。方案２（普通酵母＋毕赤酵母＋黑曲霉，体积比７∶３∶２）的相
对最优发酵条件为：温度３７℃，菌株浓度１２％，ｐＨ５．５，时间４８ｈ。在此条件下，酸碱预处理＋酶解后发酵的酒
精度分别为２．３％和２．５％。
酸碱预处理＋酶解后的材料采用发酵方案２的原料酒精转化率相对较高，分别为８．３６％和８．３９％。２种方
案的原料酒精转化率随着发酵温度的增加、发酵时间的延长、菌株浓度的增加，均呈先增加后降低的趋势。综合
分析可以得出，２种处理方式的酒精度均为２．２％左右，原料酒精转化率均约８．０％，差异不显著，和安宏［２１］的纤
维素发酵结果１３．６％、李文亮等［２２］的甜高粱（犛狅狉犵犺狌犿狏狌犾犵犪狉犲）发酵结果１４．２％相比，转化率相对较低，说明要
在后续研究中深入分析酸碱预处理的特点及预处理后的物质组成，进而为发酵菌种的驯化和选择奠定基础。另
外，本试验是在摇瓶条件下进行的，在种子液培养过程中，菌种接入较大，所以实际酒精转化率可能要略小于上述
值，离工业应用要求还有很大的差距，还需要进一步的探索研究。
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犃狆狉犲犾犻犿犻狀犪狉狔狊狋狌犱狔狅狀犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔犻狀狋犺犲犿犪狀狌犳犪犮狋狌狉犲
狅犳犳狌犲犾犪犾犮狅犺狅犾狌狊犻狀犵犪狀狀狌犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊
ＤＡＩＹｉｎｇ，ＧＵＯＨｅｒｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＸｉｎｇｌｏｎｇ，ＬＩＱｉａｎｇ
（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＣｏｌｅｇｅ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｆｕｅｌａｌｃｏｈｏｌｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇａｎａｎｎｕ
ａｌｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）ｖａｒｉｅｔｙｆｏｒａｂｕｎｄａｎｔｍａｔｅｒｉａｌ．Ｉｔｗａｓｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１％ Ｈ２ＳＯ４ａｎｄ１０％
ＮａＯＨｔｈｅｎｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙ犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪狏犻狉犻犱犲．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｐｒｏｇｒａｍ１（ａｖｏｌｕｍｅｒａｔｉｏ
ｏｆ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲ｔｏ犘犻犮犺犻犪狆犪狊狋狅狉犻狊ｏｆ７∶３）ｗｅｒｅａ１０％ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｙｅａｓｔｓａｔ３７℃，ｐＨ
５．５ｆｏｒ４８ｈ．Ｆｏｒｐｒｏｇｒａｍ２（ａｒａｔｉｏｏｆ犛．犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲，犘．狆犪狊狋狅狉犻狊，ａｎｄ犃狊狆犲狉犵狌犾犾狌狊狀犻犵犲狉ｏｆ７∶３∶２）ａ１２％
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅａｔ３７℃，ｐＨ５．５ｗａｓｔｅｓｔｅｄｆｏｒ４８ｈ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈｅｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗｅｒｅｔｈｅｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｉｎｂｏｔｈｐｒｏｇｒａｍｓ．ＦｏｒｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｉｔｈＨ２ＳＯ４ａｎｄ
ＮａＯＨ，ｐｒｏｇｒａｍ２ａｃｈｉｅｖｅｄｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｅｒａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｓ（８．３６％ａｎｄ８．３９％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｂｕｔ
ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｎｎｕａｌｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ；ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｖｅｒ
ｓｉｏｎｒａｔｅｏｆｒａｗｍａｔｅｒｉａｌ；ｆｕｅｌａｌｃｏｈｏｌ
８２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１