全 文 ：书四株胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜
亚种新菌株的分离鉴定
赵玲１，２，３，４，柴兆祥１，李金花１，２，３，４，王蒂２
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；３．草业生态系统
教育部重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；４．中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：采用棋盘式取样法，从正茬、重茬、连作２年和连作３年的马铃薯播前、现蕾期、成熟期和收获期４个不同阶段
采集马铃薯根围土样。以稀释平板法，用选择性培养基ＣＶＰ分离软腐欧文氏杆菌，共得到４２个菌株。在形态学
观察和生理生化特性测定的过程中发现编号为ＧＡＵＰｂ４１０、ＧＡＵＰｂ４９２、ＧＡＵＰｂ４１６和ＧＡＵＰｄ３４等４个菌株
的主要性状一致，且与其他菌株的性状不同。致病性测定结果显示，这４个菌株均能引起马铃薯薯片腐烂。对其
中的２个菌株进行了１６ＳｒＤＮＡ序列分析，其ＰＣＲ产物的序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登记的１８个分离自中国大白菜上的
犈狉狑犻狀犻犪犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪菌株的亲缘关系最近，同源性均达９９％。利用ＤＮＡＳｔａｒ软件绘制系统发育
树状图，菌株ＧＡＵＰｂ４１０亦与这１８个犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪菌株位于系统发育树的同一分支，聚为一
类；菌株ＧＡＵＰｂ４９２与其中的１６个犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪菌株位于系统发育树的同一分支，聚为一类；
结合生理生化特性和１６ＳｒＤＮＡ序列分析，确定这４个菌株为胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪
ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）新菌株。
关键词：马铃薯；连作；根围土壤；胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种；１６ＳｒＤＮＡ
中图分类号：Ｓ４３２．１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０４０２４４０８
　 细菌、真菌和放线菌是土壤微生物的三大类群［１３］，在植物根系的微生态环境中对物质和能量的转化起重要
作用［２６］。欧文氏杆菌（犈狉狑犻狀犻犪）是很多植物的病原菌，植物致病欧文氏杆菌常引起植物器官和组织的软腐［７，８］，
主要有胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪，Ｅｃｃ＝犘犲犮狋狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪
ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）、胡萝卜软腐欧文氏杆菌黑胫亚种（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犪狋狉狅狊犲狆狋犻犮犪，Ｅｃａ＝犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪
ｓｕｂｓｐ．犪狋狉狅狊犲狆狋犻犮犪）和菊欧文氏杆菌（犈．犮犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿犻，Ｅｃｈ＝犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿犻）［８］。胡萝卜
软腐欧文氏杆菌（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）、危害胡萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪ｖａｒ．狊犪狋犻狏犪）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、黄瓜（犆狌
犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）、茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狀犪）、番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）、辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犳狉狌狋犲狊犮犲狀狊）、大白
菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狆犲犽犻狀犲狀狊犻狊）、甘蓝（犅．狅犾犲狉犪犮犲犪ｖａｒ．犮犪狆犻狋犪狋犪）、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）等，同时引起贮藏期蔬
菜腐烂［８］。Ｅｃｃ是机遇性植物病原菌，能够以腐生的形式存活于土壤中，环境条件适合时，能产生许多酶，通过浸
腐的方式引起植物器官和组织的严重损伤［９１１］。
ｒＲＮＡ分子在生物体中普遍存在，其一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列［１２］。在生物进
化的漫长过程中，ｒＲＮＡ分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序，同时也存在着与进化过程相一
致的突变率，在结构上可分为保守区和可变区［１３］。保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能
表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基
础［１４］。细菌ｒＲＮＡ按沉降系数分为３种，分别为５Ｓ、１６Ｓ和２３ＳｒＲＮＡ。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的
１６ＳｒＲＮＡ长约１５４０ｂｐ，结构和碱基排列复杂度适中，较易于进行序列测定和分析比较。１６ＳｒＤＮＡ是细菌染
色体上编码１６ＳｒＲＮＡ相对应的ＤＮＡ序列，存在于所有细菌染色体基因中［１５］，它的内部结构由保守区和可变区
２４４－２５１
２０１１年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２０卷　第４期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
 收稿日期：２０１００３１８；改回日期：２０１００４２３
基金项目：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（ＧＮＳＷ２００６０１），现代农业产业技术体系建设专项资金（ＣＡＲＳ１０Ｐ１８）和国家科技支
撑计划项目（２００６ＢＡＤ２１Ｂ０５）资助。
作者简介：赵玲（１９８５），女，黑龙江齐齐哈尔人，助教，硕士。Ｅｍａｉｌ：７５１４７０５０８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉ＿ｊｉｎｈｕａ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２部分组成。近年来，许多学者通过ＰＣＲ扩增１６ＳｒＤＮＡ相应的ｒＤＮＡ片断，来快速、灵敏地检测鉴定细菌。
本研究通过常规的形态观察、生理生化特性分析和１６ＳｒＤＮＡ序列分析对连作马铃薯田根围土壤中分离到
的４个主要性状一致的菌株进行了鉴定，确定为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅
狏狅狉犪，Ｅｃｃ），为４个Ｅｃｃ新菌株。本研究有助于了解胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种在甘肃省马铃薯连作田中的
分布及其在马铃薯连作障碍中所起的作用，进而为克服越来越严重的马铃薯连作障碍提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　样品采集
从正茬、重茬、连作２年和连作３年的马铃薯播前（２００８年３月）、现蕾期（２００８年６月）、成熟期（２００８年７
月）和收获期（２００８年８月）４个不同阶段，采用棋盘式取样方法采集马铃薯根围耕作层（０～２０ｃｍ）土样。每采样
小区２０ｍ２，每小区共采集５个土样。土样装入无菌袋后混合均匀，标明编号、地点、采集时间，带回实验室备用。
１．２　土壤悬浮液的制备
称取１０ｇ土壤样品，置于无菌三角瓶中，用无菌水定容至１００ｍＬ，摇匀１ｍｉｎ，使土样均匀分散。土壤悬浮
液的浓度为１０－１ｇ／ｍＬ。分离时为保证悬浮液充分混匀，每次吸取悬浮液时摇匀。
１．３　试验用培养基
ＣＶＰ（结晶紫果胶盐）培养基用于软腐欧文氏杆菌的分离和鉴定［１６］，其组分为：结晶紫水溶液１ｍＬ，ＣａＣｌ２·
２Ｈ２Ｏ３ｍＬ，ＮａＮＯ３１ｇ，聚果胶酸钠９ｇ，１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ５ｍＬ，十二烷基硫酸钠０．５ｍＬ，琼脂５ｇ，蒸馏水５００
ｍＬ。配制ＣＶＰ培养基后，待平板的冷凝水消失后再接菌。
１．４　软腐细菌的分离及计数
采用稀释平板法［１６］进行土样细菌的分离。根据预试验，在ＣＶＰ平板上适宜的土壤浓度为１０－１ｇ／ｍＬ，用滴
管吸取０．５ｍＬ土壤悬浮液均匀涂在ＣＶＰ平板上。每个土样重复５个平板。２７℃黑暗条件下培养４８～７２ｈ后
计数。
１．５　致病性测定
试验用马铃薯品种为大西洋，由甘肃省条山农场提供。取新鲜的马铃薯块茎，用清水冲洗干净后再用７５％
的酒精擦洗表面，切成厚约８ｍｍ的薄片，放在直径９０ｍｍ的无菌、内有滤纸的平皿内。在薯片上用无菌解剖刀
刻长约２ｃｍ、深和宽约３ｍｍ平行的５个槽，左边的２个槽接菌试验菌株的菌苔，右边的２个槽接灭菌蒸馏水作
为对照，中间的１个槽既不接灭菌水也不接试验菌株的菌苔。接种后在每个平皿内注入６ｍＬ无菌蒸馏水。每
个菌株重复５个马铃薯薯片。盖上皿盖后于２８℃培养箱中恒温培养。２４ｈ后检查结果［１６］。
１．６　软腐细菌的生理生化测定
对能够引起马铃薯薯片腐烂的细菌菌株进行生理生化特性的测定。将ＣＶＰ上生长的菌落纯化到ＮＡ（肉汁
胨琼脂）平板上培养并依次进行下列试验：革兰氏反应，鞭毛染色，氧化酶，过氧化氢酶，葡萄糖发酵试验，从阿拉
伯糖、乳糖、山梨糖醇、棉籽糖产酸的试验，柠檬酸盐利用，果胶酸盐降解，产生吲哚，３７℃生长情况，对红霉素敏感
性试验［１６］。
１．７　软腐欧氏杆菌的１６ＳｒＤＮＡ鉴定
经过生理生化特性测定后，从完全一致的菌株中随机选取２株进行１６ＳｒＤＮＡ序列分析。
１．７．１　细菌的培养　将试验菌株接种在ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）培养液中，２８℃培养２４ｈ。ＬＢ培养液的成分为：胰
蛋白胨１０ｇ／Ｌ，酵母浸出物５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０～７．２［７］。
１．７．２　细菌基因组ＤＮＡ的提取　本试验采用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒
（离心柱型）进行ＤＮＡ的提取。
１．７．３　细菌基因组ＤＮＡ的纯度检测　配制１％ 琼脂糖凝胶，用１×ＴＡＥ作为电泳缓冲液。以 ＭａｒｋｅｒⅢ（分
子量为：２００，５００，８００，１２００，２０００，３０００，４５００ｂｐ）为分子量标准，８０Ｖ电压（５Ｖ／ｃｍ）恒压电泳。
１．７．４　试验用引物　试验用引物为８ｆ：５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３′，１４９２ｒ：５′ＧＧＴＴＡＣＣＴＴ
ＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３′［１７］。
５４２第２０卷第４期 草业学报２０１１年
引物８ｆ共２０ｂｐ碱基，Ｇ＋Ｃ含量为５０．００％。引物１４９２ｒ共２１ｂｐ碱基，Ｇ＋Ｃ含量为４２．８６％。
１．７．５　聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增　ＰＣＲ２５μＬ反应体系：１６．５μＬｄｄＨ２Ｏ，２．５μＬ１０×ＰＣＲ反应缓冲液，２
μＬｄＮＴＰ，１μＬ上游引物 （８ｆ），１μＬ下游引物 （１４９２ｒ），１．５μＬ模板ＤＮＡ，０．５μＬＴａｑＴＭＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ
扩增中，模板ＤＮＡ使用１∶１０和１∶１００两个稀释浓度。以灭菌ｄｄＨ２Ｏ为阴性对照（－ＣＫ），以甘肃农业大学植
物病理学实验室的一株犈狉狑犻狀犻犪犮犪狉犪狋狅狏狅狉犪为阳性
图１　菌株犌犃犝犘犫４１０接种大西洋马铃薯
薯片后引起的腐烂症状
犉犻犵．１　犜犺犲狉狅狋狋犲狀狊狔犿狆狋狅犿犮犪狌狊犲犱犫狔犪狉狋犻犳犻犮犻犪犾狔
犻狀狅犮狌犾犪狋犲犱狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４１０
　　　左侧２个接种槽接种菌苔 Ｔｈｅｌｅｆｔｔｗｏｓｌｏｔｓｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈ
ｂａｃｔｅｒｉａｌｌａｗｎｏｆｓｔｒａｉｎＧＡＵＰｂ４１０；右侧２个接种槽接种灭菌蒸馏水
ＴｈｅｒｉｇｈｔｓｌｏｔｓｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｄｉｓｔｉｌｅｄＨ２Ｏ；中间接种槽不
接种Ｔｈｅｍｉｄｄｌｅｓｌｏｔｗａｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｎｏｔｈｉｎｇ
图２　菌株犌犃犝犘犫４１０利用阿拉伯糖产酸的情况
犉犻犵．２　犃犮犻犱狆狉狅犱狌犮犻狀犵狅犳狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４１０犳狉狅犿犪狉犪犫犻狋狅犾
　　　Ａ：ＣＫ，试管内培养基不接菌苔，以水琼脂封口，试管封闭Ｍｅｄｉｕｍｉｎ
ｓｉｄｅｗａｓｎｏｔｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｌａｗｎ，ｗａｓｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＷＡ，ｔｕｂｅｃｌｏｓｅｄ；
Ｂ：接种菌株ＧＡＵＰｂ４１０，试管内培养基以水琼脂封口，试管封闭 Ｍｅｄｉ
ｕｍｉｎｓｉｄｅｗａｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｌａｗｎ，ｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＷＡ，ｔｕｂｅｃｌｏｓｅｄ；Ｃ：
ＣＫ，试管内培养基未封口，试管封闭 ＣＫ，ｍｅｄｉｕｍｉｎｓｉｄｅｗａｓｎｏｔｉｎｏｃｕ
ｌａｔｅｄｗｉｔｈｌａｗｎ，ｎｏｔｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈ ＷＡ，ｔｕｂｅｃｌｏｓｅｄ；Ｄ：接 种 菌 株
ＧＡＵＰｂ４１０，试管内培养基未封口，试管封闭ＣＫＭｅｄｉｕｍｉｎｓｉｄｅｗａｓｉｎ
ｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｌａｗｎ，ｎｏｔｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＷＡ，ｔｕｂｅｃｌｏｓｅｄ
对照（＋ＣＫ）。ＰＣＲ 反应步骤：９４℃热启动变性５
ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５７℃退火４０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３０
个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。最后在４℃停止反应。
１．７．６　ＰＣＲ产物的纯化和序列测定　ＰＣＲ产物的纯
化采用北京天为时代科技有限公司的离心柱型ＰＣＲ
产物纯化试剂盒（离心柱型）进行，纯化后的ＰＣＲ产物
送北京华大基因研究中心测序。
１．７．７　ＰＣＲ产物序列同源性比较和聚类分析　将待
测菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ核苷酸数据库
中的序列进行同源性比较，采用ＤＮＡＳｔａｒ软件对所测
菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的同源性较高
的部分细菌的１６ＳｒＤＮＡ序列进行聚类分析，构建同
源性树。
２　结果与分析
２．１　细菌菌株的分离和菌株 ＧＡＵＰｂ４１０、ＧＡＵＰ
ｂ４９２、ＧＡＵＰｂ４１６和ＧＡＵＰｄ３４的分布
从连作马铃薯根围土壤中共分离到了４２个细菌
菌株，其中编号为ＧＡＵＰｂ４１０、ＧＡＵＰｂ４９２、ＧＡＵＰ
ｂ４１６和ＧＡＵＰｄ３４的４个菌株的形态特征和生理生
化特性相一致，且与其他菌株不同，ＧＡＵＰｂ４１０和
ＧＡＵＰｂ４９２采自现蕾期连作２年土壤，ＧＡＵＰｂ４１６
采自现蕾期连作３年土壤，ＧＡＵＰｄ３４采自马铃薯收
获期重茬土壤。
２．２　菌株ＧＡＵＰｂ４１０、ＧＡＵＰｂ４９２、ＧＡＵＰｂ４１６和
ＧＡＵＰｄ３４的致病性测定
经过致病性测定，所分离到的４个菌株在２４ｈ后
均能引起马铃薯薯片的腐烂，对照不引起腐烂。图１
是菌株ＧＡＵＰｂ４１０接种大西洋马铃薯薯片后引起的
腐烂症状。在左侧２个接种槽中接种了菌苔，在右侧
２个接种槽中接种了灭菌的蒸馏水，对中间的一个接
种槽不接种。菌株ＧＡＵＰｂ４１０接种大西洋薯片后，
引起的腐烂症状明显，说明其在人工接种条件下的致
病性强。
２．３　菌株ＧＡＵＰｂ４１０、ＧＡＵＰｂ４９２、ＧＡＵＰｂ４１６和
ＧＡＵＰｄ３４的主要生理生化特性
这４个菌株的主要生理生化特性一致。在肉汁胨
琼脂平板上培养４８ｈ后，菌落呈乳酪白色，圆形，大多
６４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
数直径为０．３～０．６ｍｍ，中央突起。革兰氏染色阴性。菌体短杆状，鞭毛周生，多数为３～６根。能发酵葡萄糖、
阿拉伯糖、乳糖并且产酸；柠檬酸盐利用反应均为阴性；过氧化氢为阳性；能在３７℃下生长（表１）。图２为菌株
ＧＡＵＰｂ４１０利用阿拉伯糖产酸的情况，可以看出，试管内培养基用水琼脂培养基（ＷＡ）封口或不封口，２４ｈ后培
养基的颜色都有变化（图２Ｂ和Ｄ），说明产酸明显；不接菌的ＣＫ颜色没有变化，不产酸（图２Ａ和Ｃ）。
表１　菌株犌犃犝犘犫４１０、犌犃犝犘犫４９２、犌犃犝犘犫４１６和犌犃犝犘犱３４的主要生理生化特性
犜犪犫犾犲１　犜犺犲犽犲狔狆犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犱犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉狅犳狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４１０，
犌犃犝犘犫４９２，犌犃犝犘犫４１６犪狀犱犌犃犝犘犱３４
生理生化特性
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒ
菌株ＧＡＵＰｂ４１０
ＳｔｒａｉｎＧＡＵＰｂ４１０
菌株ＧＡＵＰｂ４９２
ＳｔｒａｉｎＧＡＵＰｂ４９２
菌株ＧＡＵＰｂ４１６
ＳｔｒａｉｎＧＡＵＰｂ４１６
菌株ＧＡＵＰｄ３４
ＳｔｒａｉｎＧＡＵＰｄ３４
革兰氏反应Ｇｒａｍｒｅａｃｔｉｏｎ － － － －
氧化酶Ｏｘｉｄａｓｅ － － － －
过氧化氢酶Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ ＋ ＋ ＋
葡萄糖发酵试验Ｇｌｕｃｏｓｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｓｔ ＋ ＋ ＋ ＋
从下列物质产酸Ａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍ：
阿拉伯糖Ａｒａｂｉｔｏｌ ＋ ＋ ＋ ＋
乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ ＋ ＋ ＋ ＋
山梨糖醇Ｓｏｒｂｉｔｏｌ ＋ ＋ ＋ ＋
棉籽糖Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ＋ ＋ ＋ ＋
柠檬酸盐利用 Ｕｓｅｏｆｃｉｔｒａｔｅ － － － －
果胶酸盐降解Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｃｔｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ ＋ ＋ ＋ ＋
马铃薯软腐Ｐｏｔａｔｏｒｏｔ ＋ ＋ ＋ ＋
产生吲哚Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＋ ＋ ＋ ＋
３７℃生长Ｇｒｏｗｔｈａｔ３７℃ ＋ ＋ ＋ ＋
对红霉素敏感性Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ＋ ＋ ＋ ＋
　注：“＋”表示试验反应为阳性；“－”表示试验反应为阴性。
　Ｎｏｔｅ：“＋”ｍｅａｎｓｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ“－”ｎｅｇａｔｉｖｅ．
２．４　菌株的ＧＡＵＰｂ４１０和ＧＡＵＰｂ４９２的１６ＳｒＤＮＡ
图３　菌株犌犃犝犘犫４１０和犌犃犝犘犫４９２的
犇犖犃电泳图片
犉犻犵．３　犜犺犲犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狆犺狅狋狅犵狉犪狆犺狅犳犇犖犃狅犳
狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４１０犪狀犱犌犃犝犘犫４９２
序列分析
本研究采用天根生化科技（北京）有限公司的细菌
基因组ＤＮＡ提取试剂盒（离心柱型）进行ＤＮＡ的提
取，所提取的ＤＮＡ浓度适中，纯度高（图３）。
ＰＣＲ扩增后，经过电泳，菌株 ＧＡＵＰｂ４１０ 和
ＧＡＵＰｂ４９２都得到了１２００～２０００ｂｐ的条带（图
４）。对所得条带切胶回收纯化后测序分析，ＧＡＵＰ
ｂ４１０得到了大小为 １２９８ｂｐ 的碱基序列，菌株
ＧＡＵＰｂ４９２得到了１３０５ｂｐ的碱基序列。
将所得序列在 ＧｅｎＢａｎｋ 上比对，菌株 ＧＡＵＰ
ｂ４１０与ＧｅｎＢａｎｋ上登记的１８个分离自中国大白菜
（犅犲犪狊狊犻犮犪狆犲犽犻狀犲狀狊犻狊）上的犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪
狉狅狋狅狏狅狉犪（＝犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）菌株如
７４２第２０卷第４期 草业学报２０１１年
犘犮犮（ＦＪ５２７４５４），犘犮犮（ＦＪ５２７４６６），犘犮犮（ＦＪ５２７４５８），犘犮犮（ＦＪ５２７４５７），犘犮犮（ＦＪ５２７４５６），犘犮犮（ＦＪ５２７４６３），犘犮犮
（ＦＪ５２７４６８），犘犮犮（ＦＪ５２７４８５）等的亲缘关系最近，同源性达９９％。利用ＤＮＡＳｔａｒ软件绘制测序菌株的系统发育
树状图，结果表明，菌株ＧＡＵＰｂ４１０亦与这１８个犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪菌株位于系统发育树的同一
分支，聚为一类（图５）。
图４　引物８犳和１４９２狉扩增菌株犌犃犝犘犫４１０和犌犃犝犘犫４９２后的犘犆犚产物片段大小
犉犻犵．４　犅犪狀犱狊狅犳犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狆狉狅犱狌犮犲犱犫狔狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４１０犪狀犱犌犃犝犘犫４９２犪狋狆狉犻犿犲狉狊狊犲狋８犳犪狀犱１４９２狉
图５　菌株犌犃犝犘犫４１０的遗传聚类分析图谱
犉犻犵．５　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４１０
　犘犮犮，即犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪，是犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪的同种异名犘犮犮ｉｓａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｏｆ犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪，
ａｎｄｔｈｅｓｙｎｏｎｙｍｏｆ犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪．下同Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
８４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
　　菌株 ＧＡＵＰｂ４９２与 ＧｅｎＢａｎｋ上登记的１６个分离自中国大白菜上的犘．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪
（＝犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）菌株如犘犮犮（ＦＪ５２７４５５），犘犮犮（ＦＪ５２７４６４），犘犮犮（ＦＪ５２７４５４），犘犮犮（ＦＪ５２７４５６），
犘犮犮（ＦＪ５２７４５７），犘犮犮（ＦＪ５２７４５８），犘犮犮（ＦＪ５２７４６１），犘犮犮（ＦＪ５２７４６６），犘犮犮（ＦＪ５２７４６９）等的亲缘关系最近，同源性
达９９％。从利用ＤＮＡＳｔａｒ软件绘制的系统发育树状图上可以看出，菌株ＧＡＵＰｂ４９２亦与这１６个犘．犮犪狉狅狋狅
狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪菌株位于系统发育树的同一分支，聚为一类（图６）。
图６　菌株犌犃犝犘犫４９２的遗传聚类分析图谱
犉犻犵．６　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳狊狋狉犪犻狀犌犃犝犘犫４９２
２．５　鉴定结果
结合４个菌株的形态特征、主要生理生化特性和２个代表菌株的１６ＳｒＤＮＡ分子鉴定结果，将菌株ＧＡＵＰ
ｂ４１０、ＧＡＵＰｂ４９２、ＧＡＵＰｂ４１６和ＧＡＵＰｄ３４鉴定为犈狉狑犻狀犻犪犮犪狉狅狋狅狏狅狉狌犿ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉狌犿（＝犘犲犮狋狅犫犪犮狋犲
狉犻狌犿犮犪狉狅狋狅狏狅狉狌犿ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉狌犿）。
３　讨论
本研究从连作２年的马铃薯现蕾期根围土壤中分离到了菌株ＧＡＵＰｂ４１０和ＧＡＵＰｂ４９２，从连作３年的现
蕾期根围土壤中分离到了菌株ＧＡＵＰｂ４１６，从重茬田的收获期分离到了菌株ＧＡＵＰｄ３４。通过主要生理生化特
性分析和１６ＳｒＤＮＡ序列分析，对分离到的４个菌株进行了鉴定，确定为４个胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种
（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪，Ｅｃｃ）新菌株。
细菌性软腐病是一种世界范围内的重要植物病害，其中胡萝卜软腐欧文氏菌（犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）是主要病
原［９］，犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪是机遇性植物病原菌，能够以腐生的形式存活于耕作土壤［９１１］和非耕作地
土壤［１８，１９］，也能在植物残体中存活并越冬［２０２２］。Ｔｏｇａｓｈｉ等［２１］报道，在土壤中越冬的病组织上犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪
ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪通常在下一年能够从植物病组织上或者从植物的根围土壤中重新分离到。在条件适合的情况
９４２第２０卷第４期 草业学报２０１１年
下，这些在土壤中越冬后的软腐细菌会引起寄主严重发病［９１１］。但是，关于重新分离到的菌株其致病力有无变化
等问题未见报道。本研究中分离到的４株胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种菌株越冬后致病力有无变化，越冬后
在马铃薯的什么生长阶段开始侵染，以及马铃薯品种对它们的抗病性反应等问题，有待于进一步研究。
土壤中的植物致病细菌群体可以因寄主的缺乏、与其他细菌的竞争以及细胞的溶解而减少［２１］，这些因素也
可能引起土壤中软腐细菌的群体数量下降［２３，２４］。另外，土壤中植物或杂草的残体或者根对在土壤中越冬的植物
致病细菌的越冬和生存也起着很重要的作用，因为这些因素的存在使得植物致病细菌在土壤中的生存更加长
久［９，２５，２６］。近年来，随着甘肃省马铃薯产业的逐渐兴盛，尽管马铃薯的产量一直在增加，可还是满足不了各行各
业对马铃薯高产优质的需求。由于土地资源有限，人们自然想到了连作，而且连作马铃薯的面积越来越大。然
而，随着连作年限越长，残留在土壤中的马铃薯残体会越多，无疑将导致软腐细菌在土壤中的积累，这就引发了连
作障碍。不仅对马铃薯的生产不利，而且也不利于犈．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪ｓｕｂｓｐ．犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪其他寄主作物的生产。这个
问题不得不引起人们的重视。
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ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒＰＣＲａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
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ａｓｉｎｏｃｕｌｕｍｆｏｒｓｏｆｔｒｏｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊，ＰｅｋｉｎｅｎｓｉｓＧｒｏｕｐ）［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｓｏｆｐｏｔａｔｏ（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）ｗｅｒｅｓａｍｐｌｅｄｖｉａａｃｈｅｓｓｂｏａｒｄｐａｔｔｅｒｎｆｒｏｍｆｉｅｌｄｓ
ｏｆｐｏｔａｔｏｇｒｏｗｎｆｏｒｏｎｅｙｅａｒ，ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｆｏｒ２ｙｅａｒｓ，３ｙｅａｒｓａｎｄ４ｙｅａｒｓａｔ４ｇｒｏｗｉｎｇｓｔａｇｅｓ（ｂｅｆｏｒｅｐｌａｎｔ
ｉｎｇ，ｓｑｕａｒｉｎｇｓｔａｇｅ，ｍａｔｕｒｉｔｙｓｔａｇｅａｎｄｈａｒｖｅｓｔｓｔａｇｅ）．ＴｈｅｓｏｉｌｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｏｎＣＶＰｍｅｄｉｕｍｖｉａｔｈｅｄｉｌｕｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｏｆｔｒｏｔ犈狉狑犻狀犻犪ａｎｄ４２ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｄｕｒｉｎｇｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｔｅｓｔｓｏｆｔｈｅｉｒ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔ４ｏｆｔｈｅ４２ｓｔｒａｉｎｓｓｈａｒｅｄｔｈｅｓａｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ｔｉｃｓｂｕｔｄｉｆｆｅｒｅｄｆｒｏｍｔｈｅｏｔｈｅｒｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ４ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅＧＡＵＰｂ４１０，ＧＡＵＰｂ４９２，ＧＡＵＰｂ４１６ａｎｄ
ＧＡＵＰｄ３４．Ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｅｓｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅ４ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃｔｏｃｕｔｐｏｔａｔｏ
ｐｉｅｃｅｓ．ＧＡＵＰｂ４１０ａｎｄＧＡＵＰｂ４９２ｗｅｒｅｔａｋｅｎａｔｒａｎｄｏｍｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄ
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１５２第２０卷第４期 草业学报２０１１年