全 文 ：林业科学研究　2009, 22 (2) : 177～181
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0220177205
油桐种仁 cDNA文库的构建及其油体蛋白
oleosin基因的生物信息学分析
周　冠 1, 2 , 汪阳东 2 , 陈益存 2 , 李　鹏 1, 2 , 张姗姗 1, 2 , 张小平 13
(1. 安徽师范大学生命科学学院 ,安徽 芜湖　241000; 2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘要 :以木本油料植物油桐为研究对象 ,通过预实验选择种子成熟过程中脂肪酸转变关键时期 ,构建油桐种仁 cDNA
文库 ,并进行部分测序。初级文库的滴度为 1 ×106 pfu·mL - 1 ,重组率为 99. 7% ,插入片段大小为 0. 5～2. 5 kb,平
均约 1 kb。通过测序获得的功能基因类型主要包括抗性基因、油体蛋白基因、贮藏蛋白基因及种子发育相关基因
等 ,还有大量的未知功能基因和其他基因存在 ,各类基因的表达丰度不一。着重对首次分离到的油桐油体蛋白
oleosin基因序列进行了同源性和蛋白结构预测分析。
关键词 :油桐 ;种仁 ; cDNA文库 ; oleosin;生物信息学
中图分类号 : S794. 3 文献标识码 : A
收稿日期 : 2008208225
基金项目 : 中国林科院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项重点项目 (060702)资助
作者简介 : 周冠 (1984—) ,男 ,安徽濉溪人 ,在读硕士生 ,主要从事植物生物技术研究.3 通讯作者
Con struction of Kernel cD NA L ibrary and B io informa tic Ana lysis on
oleosins Gene of V ern ic ia ford ii
ZHOU Guan1, 2 , WANG Yang2dong2 , CHEN Yi2cun2 , L I Peng1, 2 , ZHANG Shan2shan1, 2 , ZHANG X iao2ping1
(1. College of L ife Science, Anhui Normal University, W uhu　241000, Anhui, China;
2. Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang　311400, Zhejiang, China)
Abstract: Seed kernel of V ern icia ford ii was used as materials to construct a cDNA library at the key stage of fatty
acids synthesis. A p rimary library of 1 ×106 pfu·mL - 1 was obtained. The recombinant efficiency was 99. 7% , and
the sizes of inserted fractions ranged from 0. 5 to 2. 5 kb, with an average value of l kb. These sequences mainly
involved oil synthesis related genes, seed development genes with respective abundance. And there are also many
other genes to be unknown. Furthermore, bioinformatic analysis on oil body p rotein oleosins gene from V. ford ii was
done, which was firstly obtained from the cDNA library.
Key words:V ern icia ford ii; seed kernel; cDNA library; oleosin; bioinformatics
油桐 (V ern icia ford ii (Hem sl. ) A iry2Shaw) ,又叫
三年桐 ,隶属大戟科 ( Euphorbiaceae)油桐属 (V ern i2
cia Lour. ) ,是我国南方重要的木本油料经济树种。
油桐干种仁含油率达 60% ～70% ,桐油含有的脂肪
酸主要包括软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、
桐酸 ,其中桐酸约占总脂肪酸含量的 80% ,是决定
桐油性质的主要物质 [ 1 ]。桐油是最好的干性油之
一 ,是环保型新型化工产品原料 ,具有绝缘、耐酸碱、
防腐防锈等优良性能 ,可用来研制新型天然涂料、合
成树脂、粘合剂、药品等 ,广泛应用于化工制造业。
近年研究还发现 ,桐油具有抗肿瘤作用 [ 2 ]。我国是
世界上最大的桐油生产国 ,年产量达 10万 t以上 ,
占世界桐油产量的 80%。
油桐还可用来开发生物柴油原料 ,与其他许多
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
生物柴油原料植物类似 ,桐油中多元脂肪酸含量过
高 ,制造生物柴油稳定性较低 ,残留较多 ,需要进一
步进行遗传改良 ,这有赖于阐明油桐脂肪酸合成及
油脂形成、转化、贮藏分子机制 ,从而有效调控油脂
含量和品质 ,而目前国内外关于这方面的研究还比
较欠缺。2006年 , Shockey等 [ 3 ]报道了油桐两种类
型的二酰甘油酰基转移酶 ( diacylglycerol acyltrans2
ferase, DGAT1和 DGAT2)在三酰甘油合成中具有至
关重要的调控作用。汪阳东等 [ 4 - 6 ]分离得到α2桐酸
(18∶3Δ9cis, 11 trans, 13 trans )合成的关键酶基因 FADX ,并初
步分析了其功能。为了获取更好的与脂肪酸、油脂
相关的功能基因 ,阐述合成调控机理 ,从而通过对关
键基因的调控进行定向遗传改良 ,本研究通过构建
优质油桐种仁 cDNA文库 ,为筛选获得油桐脂肪酸
油脂合成调控相关基因及遗传育种、分子改良奠定
基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
油桐 (小米桐品种群 ,浙江丛生球桐 )种子于 8
月下旬采自浙江省富阳市中国林科院亚热带林业研
究所后山 ,去种皮后于液氮中速冻 , - 70 ℃保存
备用。
1. 2　试剂
Trizol购自 Invitrogen公司 , Absolutely mRNATM
Purification Kit, cDNA Synthesis Kit, ZAP2cDNA Syn2
thesis Kit和 ZAP2cDNA Gigapack Ⅲ均购自 Strata2
gene公司 , CHROMA SP IN2400 Column购自 Clontech
公司 ,其余试剂均为进口分析纯。
1. 3　方法
1. 3. 1　总 RNA及 mRNA纯化 　用 Trizol提取油桐
种仁总 RNA。将样品在液氮中迅速研磨充分 ,取约
0. 1 g样品加入盛有预冷的 1 mL Trizol的 1. 5 mL离
心管中 ,室温放置 5 m in; 4 ℃, 12 000 r·m in - 1离心
5～10 m in;取上清 ,每 1 mL Trizol加 300μL氯仿 ,
剧烈振荡 15 s,室温静置 3 m in; 4 ℃, 12 000 r·
m in - 1离心 10～15 m in;取水相 ,加等体积氯仿重复
抽提 2次 ;取上清加等体积异丙醇混匀 ,室温放置
10～20 m in; 4 ℃, 12 000 r·m in - 1离心 10 m in;弃上
清 ,加 1 mL 75%乙醇洗涤沉淀 , 4 ℃, 7 000 r·m in - 1
离心 5 m in;弃上清 ,晾干后加 30～100μL DEPC水
溶解。用 Absolutely mRNATM Purification Kit (磁珠
法 )进行 mRNA分离纯化。
1. 3. 2　cDNA合成及文库构建 　参照 Stratagene公
司的 cDNA Synthesis Kit提供的方法 :以 5μg mRNA
为模板合成 cDNA,对 cDNA 末端进行平滑化 ,连接
EcoR I Adap ters,用 X ho I酶切后的产物按照 Clon2
tech公司建议的方法过柱 , 收集过柱液约 40μL,取
3μL电泳检测 ,然后收集大于 500 bp 的 cDNA片
段。将目的片段连接入 Uni2ZAP XR vector载体后 ,
用 Gigapack III Gold Packaging Extract体外包装 ,得
到 cDNA 初级文库 ,同步用 testRNA做对照实验。
1. 3. 3　cDNA 文库的质量分析 　参照 Stratagene公
司的 cDNA Synthesis Kit提供的方法 ,对初级文库和
扩增文库的滴度及重组率进行测定。设计一对引
物 : T7 ( 5′2GTAATACGACTCACTATAGG23′) 和 SK
(5′2AATTAACCCTCACTAAAG23′)对 cDNA 克隆进
行 PCR扩增 ,检测插入片段大小 ,挑取单个噬菌斑
环化后提取质粒 DNA, EcoR I和 X ho I双酶切 ,用
1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果 ;随机挑选阳性
克隆进行测序。
1. 3. 4　序列的生物信息学分析 　将得到的基因序
列在 NCB I上进行 BLAST;用 GenBank等数据库中
的在线软件对一些重要功能基因的蛋白质结构进行
预测和分析。
2　结果与分析
2. 1　总 RNA的提取及 m RNA的纯化
经过对不同时期的油桐种仁脂肪酸含量的测
定 ,选定油桐脂肪酸转变关键时期 ( 8月下旬 )的油
桐种仁提取总 RNA ,但按常规方法提取的总 RNA得
率较低、质量较差 ,故在用 Trizol提取时增加了氯仿
抽提次数 ,得到的总 RNA利用 1%琼脂糖凝胶电泳
可检测到 28S RNA、18S RNA和 5S RNA 3条带 ,且
28S RNA与 18S RNA的亮度比例约为 2∶1, 5S RNA
条带较弱 (图 1) ,说明总 RNA没有降解 ,较完整 ,完
全符合构建高质量 cDNA文库的要求。用分光光度
计检测 OD260 /280比值在 1. 9～2. 0之间。在用磁
珠法分离纯化 mRNA时 ,将总 RNA浓缩后再过磁珠
得到的 mRNA质量较好。
2. 2　ds cD NA合成及分级分离
mRNA反转录合成的双链 cDNA在凝胶电泳上
检测 ,得知其分子大小范围在 0. 3～4. 0 kb之间 (图
2) ,基因丰度满足试验研究需要 ;为确定 cDNA的大
小 ,将分级分离后的 cDNA片段通过琼脂糖凝胶电
泳 ,收集片段长度在 500 bp以上的过柱液并混合到
871
第 2期 周 　冠等 :油桐种仁 cDNA文库的构建及其油体蛋白 oleosin基因的生物信息学分析
同一管中。
由于按照 Stratagene公司的 ZAP2cDNA Gigapack
III Gold Cloning Kit使用说明 ,在分级分离时 ,需要
进行装柱 ,时间比较长 ,且容易产生气泡 ,故改选用
Clontech公司的 CreatorTM SMARTTM cDNA L ibrary
Construction Kit中分级分离部分的 CHROMA SP IN2
400 Column,操作简单且时间短 ,且能得到较好的分
级分离效果。
　　　1:油桐种仁总 RNA;M: DNA Marker　　　　　1:单链 cDNA; 2:双链 cDNA; M: DNA Marker
　　　　　　　图 1　油桐种仁总 RNA　　　　　　　　　图 2　单链、双链 cDNA的大小范围
2. 3　cD NA文库质量的检测
按照 Stratagene公司的 ZAP2cDNA Gigapack III
Gold Cloning Kit检测 ,所建立的油桐种仁 cDNA 初级
文库的滴度为 1 ×106 pfu·mL - 1 ,重组率为 99. 7% ,
扩增后文库的滴度为 1. 2 ×109 pfu·mL - 1 ,随机挑选
20个阳性克隆进行 PCR 检测 ,琼脂糖凝胶电泳检测
结果表明 :插入片段大小在 0. 5～2. 5 kb之间 ,平均约
1 kb (图 3) ,对环化后质粒 DNA进行 EcoR I和 Xho I
双酶切 ,检测结果与 PCR 一致。文库的滴度、重组率
及完整性均符合构建高质量文库标准。
1～20: cDNA文库随机插入片段 PCR检测
图 3　cDNA文库随机插入片段 PCR检测
2. 4　cD NA文库测序与分析
将文库进行大量测序 ,共测得 3 000条序列 ,并
已向 NCB I提交了 10 个基因序列 (序列号为 :
FJ362588～FJ362597) ,对文库初步分析显示 ,与拟
南芥 (A rabidopsis tha liana L. )、毛果杨 ( Populus trich2
ocarpa Torr. )、麻疯树 ( Ja tropha curcas L. )、蓖麻
(R icinus comm unis L. )等一些物种的同源性较高。
挑选其中 93条原始序列做了详细的分析 ,去除载体
后 ,用 Phrap软件对序列进行 cluster分析得到重叠
群 ( contig) ,然后将 contig和 siglet序列在 NCB I上进
行 BLASTX分析 ,初步预测功能基因的类型及分布
的结果见表 1,包含有抗性基因、油体蛋白基因、贮
藏蛋白基因等 ,另外还有大量未知功能基因及其他
基因在种仁中表达 [ 7 - 8 ]。
表 1　油桐种仁中部分表达基因分类
基因类别 条数
油体蛋白基因 3
氨基酸合成基因 2
贮藏蛋白基因 12
抗性基因 6
基因表达调控基因 5
种子成熟和胚胎发育相关基因 7
蛋白质降解基因 5
信号转导基因 4
未知功能基因 11
其他基因 56
971
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
2. 5　油体蛋白生物信息学分析
oleosin是一类特殊贮藏蛋白 ,主要在植物种子特
异表达 ,覆盖于油体表面 ,在油体发生到分解消失过
程中起着重要的生物学作用 ,在植物基因工程研究中
有重要的应用价值。目前 , oleosin基因已在很多作物
中分离获得 ,包括油菜 (B rassica cam pestris L. )、玉米
( Zea m ays L. )、大豆 (Glycine m ax (L. ) Merrill)、拟南
芥、向日葵 ( Helian thus annuus L. )、棉花 (Gossypium
hirsutum L. )、芝麻 (Sesam um ind icum L. )、水稻 (O ryza
Sativa L. )、小麦 ( Triticum aestivum L. )和木本油料植
物油茶 (Cam ellia oleifera Abel. )、麻疯树 [ 9 - 10 ]。
作者测序得到油桐 2个编码油体蛋白 olesion的
转录本序列 ,根据其编码氨基酸的大小可分为低分子
量 oleosin和高分子量 oleosin。与其他油料植物 oleo2
sin蛋白的同源性分析 ,结果显示与蓖麻、麻风树的序
列同源性最高 (图 4)。
生物信息学关于蛋白一级结构和二级结构的预
测表明 ,油桐低分子量 olesion (L2OLE)序列编码 154
个氨基酸 ,相对分子量是 16. 188 kD ,理论等电点是
9. 93;二级结构预测表明 ,该蛋白含有 7个α2螺旋 , 5
个β2折叠。应用 TMHMM 预测模型预测跨膜螺旋
及拓扑结构 ,该序列存在 3个跨膜螺旋 ,分别位于 34
～56 aa、58～80 aa、85～107 aa ,与在线工具 ( ht2
tp: / /www. expasy. org / cgi2bin /p rotscale. p l)上预测
的疏水区相一致。油桐高分子量 olesion (H2OLE)序
列编码 137个氨基酸 ,相对分子量是 14. 443 kD,理
论等电点是 9. 87;二级结构预测表明 ,该蛋白含有 3
个α2螺旋 , 5个β2折叠。应用 TMHMM 预测模型预
测跨膜螺旋及拓扑结构 ,该序列存在 2个跨膜螺旋 ,
分别位于 32～54 aa、69～91 aa,此结果和预测的
Jc: 麻疯树 (Jc1, Jatropha curcas OLE1; Jc2, Jatropha curcas OLE2; Jc3, Jatropha curcas OLE3) ; Vf: 油桐 (Vf1, Vernicial fordii H2
OLE; Vf2, Vernicial fordii L2OLE) ; Rc: 蓖麻 (Rc1, R icinus communis OLE1; Rc2, R icinus communisOLE2) ; Cv: 榛木 (Cv1, Corylus
avellana OLE; Cv2, Corylus avellana OLE) ; Ca: 咖啡 (Ca1, Coffea A rabica OLE1; Ca2, Coffea canephora OLE2; Ca3, Cofee canephora
OLE3; Ca4, Coffea canephora OLE4; Ca5, Cofee canephora OLE5) ; Si: 芝麻 ( Si1H, Sesamum indicum; Si2H, Sesamum indicum OLE;
SiL, Sesamum indicum OLE) ; Co: 油茶 ( Co1, Camellia oleifera O leⅠ; Co2, Camellia oleifera O leⅡ; Co3, Camellia oleifera OLEⅢ;
Co4, Camellia oleifera O leⅣ; Co5, Camellia oleifera OLeⅤ) ; Lu: 亚麻 (Lu, L inum usitatissimum L2OLE ; LuH, L inum usitatissimum H2
OLE) ; Eg: 油棕 ( Eg, Elaeis guineensis OLE) ; Pd: 杏仁 ( Pd, Prunus Dulcis OLE)
图 4　油料植物中 oleosin蛋白同源性分析 (其中油桐 oleosin序列与蓖麻、麻疯树的序列同源性最高 )
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第 2期 周 　冠等 :油桐种仁 cDNA文库的构建及其油体蛋白 oleosin基因的生物信息学分析
含有两性 N末端区、中心疏水区 ( 32～89 aa )和两
性 C末端区一致。
利用 SMART对 oleosin功能结构域的分析显示 ,
oleosin蛋白中间的疏水区域很保守 ,由 2个反向平
行的β2折叠和 1个脯氨酸结组成 ,脯氨酸结“p roline
knot”为 2PX5 SPX3 P2(图 4) ,该结构域对 oleosin靶向
结合油体起着重要作用 [ 11 ]。 oleosin通过决定油体
大小而在油脂调控中发挥重要作用 [ 12 ]。
3　讨论
植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目
标的结构基因组学转向功能基因组学研究。近年
来 ,通过 cDNA 文库筛选获得功能基因成为功能基
因组学研究的重要方法之一。 cDNA 文库代表了
mRNA的反转录复本 [ 13 - 15 ] ,其质量高低是功能基因
筛选成功与否的关键。由于油桐种子含大量的多
糖、多酚及一些成分复杂的次生代谢物质 ,按常规方
法提取 RNA得率低、质量差 ,本试验进行了改进 ,增
加氯仿抽提次数 ,得到较完整的总 RNA。
本试验构建的文库插入片段大小在 0. 5～2. 5
kb之间 ,平均约为 1 kb。文库的滴度、重组率及完
整性都符合鉴定文库质量的重要标准 [ 16 ]。部分测
序结果表明 ,油桐种子发育过程中相关的功能基因
主要有油体蛋白基因、抗性基因、贮藏蛋白基因、种
子发育相关基因等 ,另外还有大量的未确定功能的
基因 ,其中 ,作者通过文库首次分离到油桐油体蛋白
oleosin两条异构体序列 ,并进行了生物信息学分析 ,
预测 oleosin对油体结构的稳定及决定油脂含量高低
都起着重要作用。在此基础上 ,作者正在进一步利
用试验分析其功能 , oleosin的功能分析对于调控桐
油合成具有关键性作用。
油桐作为原产于我国的重要木本经济油料植
物 ,具有生长快、适生能力强的特征。和油料作物如
油菜、大豆等相比较 ,国内外对木本油料植物的开发
利用还处于研究的起步阶段。油桐种仁高质量 cD2
NA文库的建立 ,为后期通过大规模测序、芯片等技
术分离获得大量与油脂合成、调控和贮藏相关的基
因奠定了基础 ,从而为深入阐述木本油料植物油脂
合成调控分子机制提供了平台。同时 ,油桐种仁
cDNA文库的建立有助于了解木本油料植物种子发
育过程。
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