全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (4) : 551～555
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0420551205
五种双翅目昆虫细胞系染色体分析
张　欣 , 冯　颖 3 , 马　涛 , 马　艳 , 丁伟峰
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室 ,云南 昆明　650224)
摘要 :采用直接法制备传代细胞染色体标本、常规 Giem sa染色、显微镜下计数中期分裂相染色体数目的方法对 5个
双翅目昆虫细胞系进行了染色体分析。结果显示 : C6 /36染色体众数为 6,为二倍体细胞系 ; SL2染色体众数为 8～
12,超二倍体细胞系 ; L22 /M delta 223染色体众数为 8～20,超二倍体细胞系 ; A edes a lbopictus Skuse染色体众数为 6,
为二倍体细胞系 ; N IH2SaPe24染色体众数为 10条 ,为二倍体或亚二倍体细胞系。与来源细胞相比 ,以上 5种细胞染
色体数目没有发生根本性的改变。
关键词 :双翅目 ;细胞系 ;染色体 ;核型
中图分类号 : S763 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007202228
基金项目 : 国家林业局“948”项目“昆虫细胞系及细胞库建立技术引进”(2002252)
作者简介 : 张欣 (1981—) ,女 ,云南彝良人 ,硕士.3 通讯作者
The Chrom osom e Ana lysis of 5 D iptera In sect Cell L ines
ZHANG X in, FENG Ying, MA Tao, MA Yan, D ING W ei2feng
(1. Research Institute of Resource Insects, CAF; Key Laboratory of Cultivating and U tilization
of Resource Insects of State Forestry Adm inistration, Kunm ing　650224, Yunnan, China)
Abstract: The Chromosome analysis of 5 D ip tera insect cell lines was made by direct method, with regular Giem sa
staining. Chromosomes of these cells in metaphase were counted under the m icroscope. The chromosome numbers
and their nuclear types were analyzed. C6 /36 belonged to dip loid cell lines and its chromosome mode was 6. SL2
belonged to hyperdip loid cell lines and its chromosome mode range was 8～12. L22 /M delta 223 belonged to hyper2
dip loid cell lines and its chromosome mode range was 8～20. A edes a lbopictus Skuse belonged to dip loid cell lines
and its chromosome mode was 6. N IH2SaPe24 belonged dip loid or hypodip loid cell lines and its chromosome mode
was 10. Chromosome numbers in the 5 cell lines were not comp letely changed.
Key words:D ip tera; cell lines; chromosome; karyotype
自 20世纪 60年代建立了第一个能够稳定传代
的昆虫细胞系以来 ,经过几十年的研究和发展 ,昆虫
细胞培养已在细胞系建立、培养技术和方法、昆虫细
胞培养技术的利用等方面取得了很大的进展 ,由于
昆虫细胞系与细胞培养技术在很多方面体现出了重
要的研究和应用价值 ,被广泛地应用于分子及细胞
生物学研究中 [ 1 ]。特别是自 Sm ith等 [ 2 ]创建了昆虫
杆状病毒表达系统以来 ,昆虫杆状病毒作为一种安
全、高效的表达载体被广泛应用 ,从而使昆虫细胞培
养倍受青睐。近年来 ,由于昆虫细胞大规模培养、昆
虫杆状病毒表达系统、生物杀虫剂、抗菌肽等的研究
和发展 ,昆虫细胞作为昆虫生理生化研究、生物反应
器以及表达基因产物等的重要研究工具 ,更是受到
越来越广泛及深入的研究和利用 [ 3 ]。
目前 ,对昆虫细胞培养的研究涉及到昆虫细胞
生物学特性、昆虫细胞培养基、细胞冻存、污染及应
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
用等方面。细胞形态、细胞生长特性及细胞核型等
细胞的生物学特性是昆虫细胞培养的重要特征。细
胞系的生物学特性很大程度依赖于其遗传稳定
性 [ 4 ] ;体内细胞的遗传学性状是稳定的 ,而在离体培
养过程中却很容易发生改变。因此 ,一般认为培养
细胞的染色体特征不能作为细胞系的分类学特征 ,
但由于其生物学特征是影响细胞生长及应用的主要
因素 ,所以检测细胞学遗传特征是体外培养细胞的
一项重要指标 [ 5 ]。昆虫细胞系建立后染色体是否异
倍化是该细胞系的生物学特征之一 ,就这方面来看 ,
鳞翅目细胞昆虫细胞系的染色体研究较多 ,研究表
明 ,培养的鳞翅目昆虫细胞染色体异倍化严重 [ 6～8 ] ,
而双翅目昆虫细胞的染色体研究较少 ,文中对 5种
来源于双翅目的昆虫细胞系进行了染色体分析。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　供试细胞系 　C6 /36 (来源于白纹伊蚊 Aedes
a lbopictus Skuse新孵幼虫 ) ; SL2 (来源于黑腹果蝇
D rosoph ila m elanogaster Fallen胚胎 ) ; L22 /M delta 223
(来源于黑腹果蝇胚胎 ) ; A edes a lbopictus Skuse (来源
于白纹伊蚊新孵幼虫 ) ; N IH2SaPe24 (来源于麻蝇
S arcophaga peregrine Rob. 2Desvoidy成虫卵巢内发育
成胚 ) ;以上细胞均由中国林业科学研究院资源昆虫
研究所保存。
1. 1. 2 　主要试剂 秋水仙素溶液 : 0. 005 mol·
L - 1 ;低渗 KCl溶液的质量分数 :分别为 0. 50%、
0158%和 0. 65% ; Carnoy氏固定液 :甲醇 ∶冰醋酸 = 3
∶1;磷酸缓冲液 : 1 /15 mol·L - 1 Na2 HPO4和 1 /15 mol
·L - 1 KH2 PO4按 4∶1混合 ; Giem sa染料 : 1份 Giem sa
原液和 10份磷酸缓冲液混合 ;香柏油。
1. 2　染色体分析方法
1. 2. 1　终止培养 　培养细胞至对数生长期 ,加入占
培养基总体积 1 /10的 0. 005 mol·L - 1秋水仙素混
匀 ,继续培养 4～5 h。
1. 2. 2　低渗处理 　收集细胞 , 150 g下离心 5 m in,
弃上清 ;分别轻轻加入 7 mL的 0. 50% ～0. 65%的低
渗 KCl液 ,在室温下处理 15 m in, 150 g下离心 5
m in,弃上清。
1. 2. 3　固定 　使细胞沉淀重悬于 1 mL低渗 KCl溶
液中 ,加入 1 mL的新鲜固定液 (要与细胞悬液相同
体积 )混匀 ,再轻轻的加入 6 mL固定液 ,混匀固定
15 m in, 150 g下离心 5 m in,弃上清。
1. 2. 4　重复固定 加入 7 mL固定液 ,混匀 ,室温下
固定 15 m in, 150 g下离心 5 m in,弃上清。
1. 2. 5　制片 　用少量的固定液 (0. 1～0. 3 mL,应依
照细胞的多少来加 )混匀细胞 ,从高处滴细胞悬液至
干净的载玻片上 ,室温下自然干燥。
1. 2. 6　染色 　吉姆萨染液染 10～15 m in,流水冲
洗 ,风干镜检。
1. 2. 7　观察与分析 在油镜下选择 100个分散良
好的细胞 ,使用 IM50软件系统拍照保存 ;并利用测
微尺及电子计数器进行统计、分析。
2　结果与分析
2. 1 C6 /36
记数 100个中期分裂相 C6 /36细胞染色体 ,其
染色体数目变动范围为 6～26,细胞染色体数目主
要集中分布于 5个值 ,染色体数目为 6条的细胞占
观察细胞总数的 65% (图 1)。从染色体特征上看 ,
染色体染色后在显微镜下观察为深紫色 ,长杆状 ,缢
痕明显 ,相对长度一般为 2～10μm,在染色体中部
的上方能观察到缢痕 ,为亚中部着丝粒染色体 ,体现
出的常是早中期的染色体。在染色体数目为 6的细
胞中 ,其中的 4条染色体个体较大 ,相对长度在 8
μm左右 ,而另外 2条染色体较小 ,相对长度在 4μm
左右 (图版 1)。
根据温小军等 [ 9 ]的研究 ,同属的 3种伊蚊 A edes
m eigen的染色体数目均为 2n = 6。细胞系 C6 /36经
多次传代培养后 , 65%的细胞染色体数目为 6条 ,细
胞染色体中位数为 6,众数为 6,说明 C6 /36为二倍
体细胞系。
图 1　C6 /36细胞染色体数目分布
2. 2　SL2
记数 100个中期分裂相 SL2细胞染色体 ,其染
色体数目变动范围为 4～21,细胞染色体数目集中
分布于 10个值 ,染色体数目在 8～12条的细胞占观
255
第 4期 张 　欣等 :五种双翅目昆虫细胞系染色体分析
察细胞总数的 92% (图 2)。在显微镜下观察 , SL2
细胞染色体染色后为紫色 ,染色体个体较大 ,从染色
体特征上看 ,染色体形态呈杆状 ,呈现长细型和短粗
型 2种形态 ,能分清 2条姐妹染色体 ,缢痕明显。相
对长度一般为 3～9μm,在染色体中部能观察到缢
痕 ,为中部着丝粒染色体 ,体现出的常是中期的染色
体 ,染色体为 2条染色单体构成的叉状形状 (图版
2)。
据王转斌 [ 10 ]的研究 ,果蝇属 D rosoph ila的染色
体数目为 2n = 8,研究发现细胞系 SL2染色体中位
数为 10,众数为 8～12, 92%细胞染色体数目为 8～
12条 ;说明 SL2细胞系为超二倍体细胞系。观察发
现 ,个别细胞中的染色体大约只有正常染色体的一
半大 ,着丝粒在端部 ,有可能为 B染色体 [ 11 ] ,这种染
色体在果蝇的有丝分裂中期核型中也有出现 [ 12 ]。
结果说明 SL2细胞在成系后 ,染色体的数目没有发
生特别大的改变 ,但也存在着多倍化的现象。
图 2　SL2细胞染色体数目分布
2. 3　L 22 /M delta 223
记数 100个中期分裂相 L22 /M delta 223细胞系
染色体 ,其染色体数目变动范围为 5～22,细胞染色
体数目集中分布于 10个值 ;染色体数目在 8～20条
的细胞占观察细胞总数的 95% (图 3) ;在显微镜下
观察 , L22 /M delta 223细胞染色体染色后为兰紫色 ,
染色体个体较大 ,相对长度一般为 3～10μm,与 SL2
细胞系类似 , L22 /M delta 223染色体也出现长细型
和短粗型 2种形态 ,其中长细型占大多数。从染色
体特征上看 ,染色体形态呈杆状 ,能分清 2条姐妹染
色体 ,在染色体中部能观察到明显缢痕 ,为中部着丝
粒染色体 ,体现出的常是中期的染色体 ,染色体为 2
条染色单体构成的叉状形状 (图版 3)。
黑腹果蝇的染色体数目为 2n = 8[ 10 ] , L22 /M del2
ta 223细胞染色体中位数为 10,众数为 8～20;说明
L22 /M delta 223细胞系为超二倍体细胞系。在形态
方面也能观察到少数个体较小且着丝粒在端部的 V
字型 B染色体 ,说明该细胞在培养成系后核型也没
有完全改变。
图 3　L22 /M delta 223细胞染色体数目分布
2. 4　A edes a lbop ic tus Skuse
记数 100个中期分裂相 A edes a lbopictus Skuse
细胞染色体 ,其染色体数目变动范围为 6～12,细胞
染色体数目较恒定 ,集中分布于 4个值 ,染色体数目
6条的细胞占观察细胞总数的 95% (图 4)。在显微
镜下观察颜色较深 ,为深紫色。从染色体特征上看 ,
染色体形态呈长杆状 ,相对长度为 3～8μm,在染色
体中上部能观察到明显的缢痕 ,为亚中部着丝粒染
色体 (图版 4)。
张财兴 [ 13 ]等利用同种昆虫白纹伊蚊幼虫脑神
经节进行染色体研究 , 其染色体数目为 6 的占
81. 88%。该研究发现 A edes a lbopictus Skuse细胞系
的染色体中位数为 6,众数为 6, 2n = 6的细胞占观察
细胞总数的 95% ;说明该细胞在培养成系后核型几
乎没有改变 ,为二倍体细胞系。
图 4　Aedes albopictus Skuse细胞染色体数目分布
2. 5　N IH2SaPe24
记数 100个中期分裂相 N IH2SaPe24细胞染色
体 ,染色体数目变动范围为 10～20,细胞染色体数
目较恒定 ,主要集中分布于 3个值 ,染色体数目在 10
条的细胞占观察细胞总数的 86% (图 5)。在显微镜
下观察 N IH2SaPe24细胞染色体染色后为兰紫色 ,染
色体形态呈杆状 ,染色体个体较大 ,几乎为长杆状 ,
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
相对长度一般为 3～8μm;在染色体中部的上方能
观察到明显的缢痕 ,为亚中部着丝粒染色体 ;个别细
胞的染色体能分清其 2条染色单体 (图版 5)。
目前 ,未见麻蝇属昆虫染色体研究的报道 ,傅荣
典 [ 14 ]等对同科亚麻蝇属 Pa rasarcophaga7个种昆虫
的核型进行了研究 ,亚麻蝇属昆虫染色体数目为 2n
= 12,该研究发现 N IH2SaPe24细胞系的染色体大部
分为 10,部分染色体易成对分布 ,由此分析该细胞
系为亚二倍体或二倍体细胞系。 图 5　N IH2SaPe24细胞染色体数目分布
图版说明 : 1: C6 /36细胞染色体 ; 2: SL2细胞染色体 ;
3: L22 /M delta 223细胞染色体 ; 4: A edes albopictus Skuse细胞染色体 ; 5: NTH2Sape24细胞染色体。
3　讨论
细胞的增殖是建立在细胞分裂的基础上 ,在细
胞分裂过程中 ,染色体发生着一系列的变化 ,染色体
的组成和变化必然对细胞分裂产生或多或少的影
响。由于离体环境下不稳定的因素增加 ,使体外培
养的细胞突变率很高。在长期人工制造的生长条件
下 ,培养基、温度、氧气及 pH值的变化都可能使细
胞产生一些不规律的变异。所以经过离体培养的细
胞 ,染色体一定都存在变化 [ 15, 16 ] ,且细胞染色体的
变异率还随着传代次数的增加而增大 [ 17 ]。
研究表明 ,体外培养的昆虫细胞也存在染色体
的变异 ,并且长期离体培养的昆虫细胞往往易出现
异倍化的现象 [ 18 ] ,几乎所有的鳞翅目昆虫细胞染色
体也表现出变异程度很大的特征 ,而双翅目昆虫细
胞染色体的变异却不十分明显 [ 19 ]。据报道 ,白蚊伊
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第 4期 张 　欣等 :五种双翅目昆虫细胞系染色体分析
蚊细胞系 Aa2778中 74%以上的细胞为二倍体 ,中华
按蚊 A nophcles sinensis W iedemann细胞系 A s2684也
是以二倍体细胞为主 [ 19 ] ;潘李珍 [ 20 ]等对其建立的
中华按蚊细胞系进行 2个不同代细胞 (9代 , 21代 )
的核型分析 ,结果显示绝大部分细胞是二倍体 ;
Felio[ 21 ]等建立的 Psorophora confinn is Lynch2A rrib2
alzaga细胞系第 62代细胞也大部分为二倍体细胞 ,
Gloria[ 22 ]等对其建立的 L utaom yia long ipa lpis Lutz细
胞系从传代初期到成系后进行了多次核型分析 ,研
究显示 85%的细胞为二倍体细胞。
本文研究的 5种双翅目细胞系均经过了无限次
传代 ,细胞离体生长时间较长 ,染色体分析发现 ,其
染色体数目较为恒定 ,常集中分布于几个数目 ,且主
要分布大多数与其来源的昆虫染色体的数目保持一
致性 ,其大多数细胞的核型特征为二倍体 ,少数为三
倍体或四倍体 ,只有极少数的为异倍体或多倍体。
染色体缢痕也较为明显 ,多为杆状的中部着丝粒染
色体或亚中部着丝粒染色体。文中研究的 5个双翅
目细胞系和已报道的 5个细胞系染色体多为二倍
体 ,这些数量及形态特征说明双翅目昆虫细胞在长
期的离体培养环境中 ,遗传物质并没有发生根本性
的改变。由此分析 ,双翅目昆虫细胞系的核型特征
可以作为细胞系分类学特征之一。这与鳞翅目昆虫
细胞系的核型特征差异较大 ,鳞翅目昆虫细胞系染
色体变异大 ,异倍化严重 ,染色体多为点状和短杆
状 [ 23～25 ] ,因此其核型特征一般不能作为细胞系分类
学特征。为什么同是昆虫细胞系 ,在染色体变异上
却存在这么大的差异 ,还有待于进一步的研究 ;但双
翅目昆虫细胞系所表现出来的染色体特征可为研究
和应用双翅目昆虫细胞系及其来源昆虫提供有益的
参考。
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