全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (2) : 176～180
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0220176205
胞外多糖和脂多糖在青枯菌对尾巨桉根部
吸附和侵入过程中的作用研究
王胜坤 1 , 王　军 2 , 徐大平 13
(1. 中国林业科学研究院热带林业研究所 ,广东 广州　510520; 2. 华南农业大学林学院 ,广东 广州　510640)
摘要 :通过测定青枯菌的根表吸附量和根部侵入量 ,研究了胞外多糖 ( EPS)和脂多糖 (LPS)在青枯菌对尾巨桉根部
吸附和侵入过程中的作用。结果表明 :在接种青枯菌的 6 h内 , EPS处理后尾巨桉根部青枯菌 GN1和 93B的吸附量
和侵入量明显升高 ,而 LPS处理后尾巨桉根部 GN1和 93B的吸附量和侵入量都明显下降 ;无 EPS菌株的根表吸附
量和根部侵入量都明显降低 ,无 EPS及 LPS菌株的根表吸附量和根部侵入量亦有所下降 ,但没有无 EPS菌株下降
明显 ; EPS具有促进青枯菌对尾巨桉根部吸附和侵入的作用 , LPS则具有抑制作用。
关键词 :青枯菌 ;胞外多糖 ;脂多糖 ;尾巨桉 ;吸附 ;侵入
中图分类号 : S792. 39 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006209222
基金项目 : 国家科技攻关项目“南方主要速生阔叶树种新品种选育及栽培技术 ( 2004BA515B02) ”;科技部成果转化项目“南方主要速
生阔叶树种新品种及高效培育技术中试”;国家自然科学基金“青枯菌对桉树的识别侵染及其生化机制研究 (30471395) ”
作者简介 : 王胜坤 (1976—) ,男 ,中国林业科学研究院博士生 ,主要从事植物病理学研究.3 通讯作者 :徐大平 ,男 ,研究员 ,博士生导师.
Study on the Role of EPS and L PS of R a lston ia so lanacea rum in Euca lyptus
u rophylla ×E. grandis Root Adsorption and Ingression
WANG Sheng2kun1 , WANG Jun2 , XU Da2ping1
(1. Research Institute of Trop ical Forestry, CAF, Guangzhou　510520, Guangdong, China;
2. College of Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou　510640, Guangdong, China)
Abstract: In this experiment, the role of extracellular polysaccharides ( EPS) and lipopolysaccharides (LPS) were
studied by detecting the number of R alston ia solanacearum in Euca lyptus urophy lla ×E. grand is root adsorp tion and
ingression. The results showed that the number of GN1 and 93B in adsorp tion and ingression increased obviously
when the roots were treated with EPS, while decreased evidently with LPS in 6 h after inoculation. The number of
bacteria washed off EPS decreased evidently in adsorp tion and ingression to the roots. In comparison, the number of
bacteria washed off both EPS and LPS had the same decreasing tendency, but not so evident as the former. These
results demonstrated that EPS p layed a role in enhancing the adsorp tion and ingression of R. solanacea rum to the
roots of Euca lyptus urophy lla ×E. grand is, while LPS had inhibitory effect.
Key words: R alston ia solanacearum ; EPS; LPS; Euca lyptus u rophy lla ×E. grand is; adsorp tion; ingression
桉树青枯病是由青枯劳尔氏菌 ( R alston ia so2
lanacearum ( E. F. Sm ith) Yabuuchi et a l. )引起的
一种系统性土壤传染病害 ,给桉树生产带来很大危
害。青枯菌主要从根部侵入 ,其中 ,对寄主根部的吸
附侵入和根内定殖扩散是其侵染过程的两个重要环
节 ,吸附侵入是其成功侵染的必要条件。前人曾就
第 2期 王胜坤等 :胞外多糖和脂多糖在青枯菌对尾巨桉根部吸附和侵入过程中的作用研究
青枯菌对番茄 (L ycopersicon escu len tum M ill. ) [ 1, 2 ]和
木麻黄 (Casua rina spp. ) [ 3 ]的吸附识别与侵入机制
进行了研究 ,认为胞外多糖 ( Extracellular Polysaccha2
rides, EPS)和脂多糖 (L ipopolysaccharides, LPS)等
致病因子在病菌与寄主吸附识别过程中发挥着一定
的作用 ,在其它病原与寄主相互识别过程中的作用
也有相关报道 [ 3, 4 ] ;而对桉树青枯病的研究 ,目前主
要集中在病害的发生规律和防治方面 [ 5～7 ] ,对病菌
的吸附识别和侵染机制及致病因子的作用还少有涉
及 [ 8 ]。本文通过测定青枯菌强弱两个菌株接种 EPS
和 LPS处理尾巨桉苗后的吸附量和侵入量 ,以及无
EPS和无 EPS及 LPS菌株接种尾巨桉苗的吸附量和
侵入量 ,探讨了 EPS和 LPS在青枯菌根部吸附侵入
中的作用。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
1. 1. 1　菌种 　选用从桉树分离的强弱两青枯菌菌
株 GN1 (强毒菌株 )和 93B (弱毒菌株 ) ,由华南农业
大学林学院提供。
1. 1. 2　试验用苗 　由中国林业科学研究院热带林
业研究所组培中心提供的尾巨桉 196 ( Euca lyptus
urophy lla S. T. B lake ×E. grand isW. H ill exMaiden,
感病品种 )组培苗 ,高度约 15～25 cm,除去袋土 ,水
培 15～20 d,待新根长出后使用。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　菌种制备　将供试菌株 GN1和 93B在 TTC培
养基 [ 9 ]上 30 ℃培养 36～48 h,用无菌水配制成 3 ×108
个·mL - 1的细菌悬浮液 ,血球计数板计数 ,备用。
1. 2. 2　胞外多糖 ( EPS)和脂多糖 (LPS)提取 　利用
培养后的 GN1和 93B菌株分别进行 EPS和 LPS提
取 ,方法如下 :
EPS提取 :从 TTC平板上挑取单菌落 ,用无菌水
配成浓度为 3 ×108个 ·mL - 1的菌悬液 ,取 5 mL加
入 1 L营养肉汤中 , 30 ℃、150 r·m in - 1振荡培养 48
h后 ,按酒精沉淀法进行 EPS提取 [ 10 ] ,收集沉淀物
冻干得 EPS粗提物。使用时将粗提取的 EPS溶于
50 mL蒸馏水中 , 5 000 r·m in - 1离心除去不溶物 ,取
上清液备用。
LPS提取 :从 TTC平板上挑取单菌落 ,用无菌水
配成浓度为 3 ×108个 ·mL - 1的菌悬液 ,取 5 mL加
入 1 L营养肉汤中 , 30 ℃、150 r·m in - 1振荡培养 48
h后 ,按酚 —水法进行 LPS提取 [ 11 ] ,收集沉淀物冻
干得 LPS粗提物。使用时将粗提取的 LPS溶于 50
mL蒸馏水中 , 5 000 r·m in - 1离心除去不溶物 ,取上
清液备用。
1. 2. 3　无 EPS和无 EPS及 LPS菌体悬浮液制备
无 EPS菌体悬浮液制备 :参考董汉松等 [ 4 ]人的方
法。用 0. 02 mmol, pH值 7. 5的磷酸缓冲液 ( PB)洗脱
菌苔制成细菌悬浮液 , 6 000 r·m in - 1离心 30 m in,清
洗 3次 ,最后 1次沉降的菌体按等体积加 PB缓冲液 ,
经旋涡混合器 ,充分混合后用灭菌玻棒蘸少许浓菌液
涂于灭菌滤纸上 ,滴少许茴香醛—硫酸试剂 [ 12 ] ,直到
浸润圈内无颜色表明菌体不含 EPS为止 ,用 PB悬浮
并调节含菌量至 3 ×108个·mL - 1 ,备用。
无 EPS及 LPS菌体悬浮液制备 :将洗去 EPS的菌
体沉降物用 LPS清洗液 (内含 Tris2HCl 10 mmol, EDTA2
2Na 1 mmol,NaCl 5 g·L - 1 ) [13 ]浸泡 15 min,反复 3次 ,
用 PB制成浓菌液 ,按上述方法测定颜色反应 ,直到涂
抹处不显色表示菌体无 LPS为止 ,洗去 EPS及 LPS的
菌体最后用 PB悬浮并调节含菌量至 3 ×108个·mL - 1 ,
备用 ,同时经平板生长测定证明菌体存活。
1. 2. 4　接种处理和测定
EPS和 LPS处理尾巨桉苗 :取尾巨桉水培苗 ,分
别用 EPS和 LPS处理尾巨桉根部 0. 5 h,以无菌水处
理根部作对照 ,然后用浓度为 3 ×108个 ·mL - 1的相
应青枯菌悬浮液浸根接种。
无 EPS和无 EPS及 LPS菌体处理尾巨桉苗 :取
尾巨桉水培苗 ,分别用浓度为 3 ×108个 ·mL - 1的无
EPS和无 EPS及 LPS青枯菌悬浮液浸根接种 ,以浓度
为 3 ×108个·mL - 1的未做处理菌株直接接种做对照。
以上处理分别于接种开始后 0. 5、1. 0、2. 0、4. 0、
6. 0 h取样 ,同一处理的植株取 5株 ,每株取 1条根 ,
截取 2 cm左右根尖 ,测定细菌的根表吸附量和根部
侵入量 , 3次重复 ,结果取平均值。
根表吸附量测定 :将截取的根尖浸入 10 mL无
菌水中 ,涤荡 1 m in后 ,取出根尖 ,用血球计数板计
数悬浮液中的细菌数量 ,即为青枯菌的根表吸附量。
根部侵入量测定 :将吸附悬浮液中取出的根尖 ,
灭菌滤纸吸干 ,称质量 ,放入 10 mL无菌水中 ,磨碎 ,
用血球计数板计数悬浮液中的细菌数量 ,即为青枯
菌的根部侵入量。
细菌浓度 (个 ·mL - 1 ) = 80小格内细菌总数
(个 ) /80 ×400 ×10 000 ×稀释倍数 (mL)
吸附或侵入量 (个 ·g- 1 ) =细菌总数 (个 ·
mL - 1 ) ×分离用水量 (mL) /根质量 ( g)
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
2　结果与分析
2. 1　EPS对青枯菌根表吸附量和根部侵入量的
影响
由图 1、2可看出 :两菌株直接接种尾巨桉苗后 ,
93B与 GN1的根表吸附量没有明显差异 , 93B的根
部侵入量略高于 GN1; EPS处理的尾巨桉苗 ,随着接
种时间的延长 , 93B和 GN1的根表吸附量和侵入量
总体都呈上升趋势 , 93B的吸附量和侵入量与 GN1
的无太大差异 ;在整个测定过程中 ,无论强毒弱毒菌
株 , EPS处理的尾巨桉苗 ,其吸附量和侵入量都高于
未经 EPS处理的尾巨桉苗 ,但作用效果有所不同 ,
93B + EPS处理的尾巨桉苗 ,其吸附量和侵入量略高
于对照组 ,而 GN1 + EPS处理的尾巨桉苗 ,其吸附量
和侵入量都明显高于对照组。由此可见 : EPS可促
进青枯菌对根部的吸附和侵入 ,而且促进程度会因
菌株的不同而有一定差异 ,强毒菌株 GN1的 EPS对
该菌株的吸附、侵入有明显的促进作用 ,弱毒菌株
93B的 EPS促进作用不及 GN1的明显。
图 1　EPS对青枯菌的根表吸附量的影响
图 2　 EPS对青枯菌的根部侵入量的影响
2. 2 　LPS对青枯菌根表吸附量和根部侵入量的
影响
由图 3、4可看出 :两菌株直接接种尾巨桉苗后 ,
在接种的 6. 0 h内 93B的根表吸附量和根部侵入量
基本都高于 GN1的 ,而在 2. 0 h时其吸附量和侵入
量略低于 GN1; GN1 +LPS处理的尾巨桉苗 ,吸附量
和侵入量明显低于对照 , 93B + LPS的测定结果与
GN1的相似 ; LPS处理后 , 93B的根表吸附量降低程
度大于 GN1的 ,而根部侵入量降低程度不及 GN1的
明显。由此可见 : LPS对青枯菌的根表吸附和根部
侵入都有一定的抑制作用 ,使其根表吸附量和根部
侵入量都有不同程度的下降 ,而对不同毒性菌株吸
附和侵入的影响有所不同。
图 3　LPS对青枯菌的根表吸附量的影响
图 4　LPS对青枯菌的根部侵入量的影响
2. 3　无 EPS菌株的根表吸附量和根部侵入量
由图 5、6可看出 :洗去 EPS的青枯菌菌株接种
尾巨桉根部后 ,与对照相比 , 93B和 GN1的吸附量和
侵入量都有所下降 ,而吸附量下降更明显 ;强弱两菌
株相比 , 93B的根表吸附量下降程度比 GN1的明显 ,
而根部侵入量的下降程度与 GN1的没有明显区别。
可见 ,洗去 EPS后 ,青枯菌对尾巨桉根部的吸附和侵
入能力都受到一定程度的抑制。
图 5　无 EPS菌株的根表吸附量
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第 2期 王胜坤等 :胞外多糖和脂多糖在青枯菌对尾巨桉根部吸附和侵入过程中的作用研究
图 6　无 EPS菌株的根部侵入量
2. 4　无 EPS和 LPS菌株根表吸附量和根部侵入量
由图 7、8可看出 :无 EPS和 LPS菌株接种尾巨
桉根部后 ,与对照相比 ,强毒菌株 GN1的根表吸附
量略有降低 ,弱毒菌株 93B在接种的 2. 0 h前和 4. 0
h后吸附量明显低于对照 ,在 2. 0 h到 4. 0 h时间内
吸附量下降不明显 ;两菌株的根部侵入量在接种时
间内变化不大。结果表明 ,洗去 EPS及 LPS后 ,强
毒菌株 GN1的吸附和侵入能力略有降低 ,弱毒菌株
93B的吸附能力降低较多 ,侵入能力基本没有影响。
图 7　无 EPS和 LPS菌株的根表吸附量
图 8　无 EPS和 LPS菌株的根部侵入量
3　结论与讨论
EPS是植物病原细菌产生的多种高分子物质 ,包
被在细菌细胞表面或以可流动的粘液形式存在于细
菌周围 ,它能够促进植物病原细菌对植物细胞表面的
吸附 ,有利于细菌在植物组织中运动 ;掩盖细菌的
LPS和鞭毛等表面结构免受寄主防卫机制的识别和
进攻 [ 14～16 ]。本研究表明 , EPS可增强青枯菌对尾巨
桉的根表吸附和根部侵入能力 ,尤其是强毒菌株表现
更明显 , GN1无论是在平板还是在液体培养基中都能
产生比 93B更多的 EPS,因此 EPS处理尾巨桉根部
后 ,对 GN1的吸附和侵入促进作用更为明显 ;而洗去
EPS后 ,强弱毒株的根表吸附量和根部侵入量都有不
同程度的下降 ,进一步验证了 EPS在青枯菌对尾巨桉
根部吸附和侵入过程中的作用。有研究表明 ,青枯菌
EPS缺失突变体菌株在番茄根部侵染时 ,基本失去致
病力和侵染力 ,同时诱导番茄根部组织产生抗病反
应 ;相反 ,致病力菌株则产生大量的酸性 EPS,既可侵
染又可增殖 [ 16 ]。在细菌侵入定殖和系统扩散过程
中 ,青枯菌产生的 EPS可保护和促进细菌成功侵入 ,
并在寄主组织内大量繁殖 ,而弱致病力菌株可能是由
于 EPS产生量少而影响了其在寄主组织内侵入和扩
展的能力 ,本试验结果也印证了这一点。
LPS作为革兰氏阴性细菌外膜不可或缺的一部
分 ,处理植物后 ,可能占据了植物细胞上的某些结合位
点 ,抑制了再接种的含 LPS菌体对植物细胞的吸附识
别 ,导致吸附量显著降低 [ 17 ] ;也可能是诱导桉树根部组
织产生抗性 ,激发寄主的防卫反应 ,从而抑制病菌的吸
附和扩散。Newman等 [18 ]认为 LPS能够使细菌避开植
物产生的抗菌物质的作用而有利于植物病原细菌对寄
主的侵染 ,相反 ,LPS亦可被植物识别而直接引起一些
防卫反应 ,使植物组织对后续植物病原细菌的侵染产
生更为敏感或更强的防卫反应 [19 ] ,使得细菌的吸附和
定殖更为困难。本试验结果显示 ,LPS处理尾巨桉根部
后再接种青枯菌 ,可明显抑制青枯菌的吸附和侵入 ,可
能是由于 LPS引起的植物防卫反应造成的 ;在接种后
期 ,LPS处理的抑制作用逐渐减弱 ,强致病性菌株的这
种作用减弱更快 ,可能是细菌本身具有的能够克服因
LPS被寄主识别而产生防卫反应的机制开始发挥作用 ,
更多的细菌成功吸附和定殖在寄主细胞表面 ,从而使
其成功地侵染寄主成为可能。
用洗去 EPS的菌株接种尾巨桉苗 ,强毒和弱毒菌
株的根表吸附量和根部侵入量都明显降低 ,吸附量下
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降更明显 ,其原因可能是由于细菌表面的 EPS被洗
去 ,失去对菌体的保护作用 , LPS外露而直接与根表
细胞发生作用 ,激发了寄主的防卫反应 ,使得青枯菌
的吸附量和侵入量都明显下降。 Schouten[ 20 ]认为
EPS可以保护细菌免遭植物的抗病反应 ,因此 ,洗去
EPS的菌株对根部的吸附和侵入能力都受到影响。
用洗去 EPS和 LPS的菌株接种尾巨桉苗 ,弱毒
菌株的根表吸附量在接种时间内都有不同程度的降
低 ,强毒菌株变化较小 ,两菌株的根部侵入量变化都
不明显 ,而洗去 EPS的菌株的根表吸附量和根部侵
入量的降低程度更大 ,弱毒菌株根表吸附的降低程
度比强毒菌株的大 ,这可能是由于 EPS和 LPS在青
枯菌侵入寄主过程中二者作用的差异造成的 , EPS
可增强致病力 ,促进其对寄主的吸附和侵入 , LPS则
诱导寄主防卫反应 ,使得植物组织对细菌的侵入更
为敏感 [ 18 ] ,提高抗病性 (反而削弱致病力 ) ,洗去
LPS后 ,寄主的防卫反应没有产生或产生较微弱 ,因
此 ,无 EPS和 LPS的菌株其吸附量和侵入量的变化
反而小于无 EPS菌株。
本研究中 , EPS和 LPS的存在与否在青枯菌对
桉树根部吸附作用的影响比对侵入作用的影响大 ,
洗去 EPS和洗去 EPS及 LPS的菌株对根部吸附量
都有所下降 ,而侵入量变化相对较小 ,说明在青枯菌
对桉树根部的吸附和侵入过程中 , EPS和 LPS在吸
附过程中发挥着比侵入过程中更为重要的作用 ,青
枯菌一旦侵入根部组织 ,病菌将与寄主组织发生更
为复杂的相互作用 ,更多的物质参与其中 ,因此 EPS
和 LPS的作用就会相对削弱 ,这种作用的发生机制
需要进一步研究。
在桉树—青枯菌这一病理系统中 ,青枯菌与桉树
最初的相互作用决定了其是否能成功侵染 ,在相互作
用的过程中 , EPS和 LPS两个致病因子发挥着重要的
作用 , EPS可以保护细菌逃避寄主的识别 ,增强细菌的
运动能力 ,促进青枯菌对桉树的吸附和侵入 ; LPS可诱
导寄主的防卫反应 ,增强了寄主对细菌的防御能力 ,使
得细菌难以与寄主细胞表面发生作用 ,抑制了细菌吸
附到细胞表面进而侵入组织内部的过程。
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