全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 3) : 336 ～ 341
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 03-0336-06
利用深黄被孢霉发酵生产油脂的初步研究
耿青伟1, 2, 吴开云1* , 吴小芹2 , 李纪元1 , 刘明靖1, 平秀敏3
( 1 . 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 , 浙江 富阳 311400; 2. 南京林业大学森林资源与环境学院 ,
江苏 南京 210037; 3. 云南农业大学农业与生物技术学院 , 云南 昆明 650201)
摘要: 为提高微生物油脂产量, 以产油微生物深黄被孢霉为试验菌株, 采用单因素试验设计, 通过摇瓶培养, 研究了
产脂培养基中碳源、氮源种类及其浓度、接种量、初始 pH 值、无机盐离子对菌体生长和油脂积累的影响, 确定了深
黄被孢霉摇瓶发酵产油脂的优化培养条件为: 葡萄糖 100 g·L - 1 , 酵母粉 3. 0 g·L - 1 , 接种量为 20% , pH 值为
5.0 ～ 6. 0, 硫酸镁( MgSO4 ·7H2O) 0.5 g·L
- 1 , 磷酸二氢钾( KH2 PO4) 2. 0 g·L
- 1。在优化培养条件下菌体生物量
为 20. 62 g·L - 1 , 油脂含量为 43.02% , 油脂产量为 8. 87 g·L - 1 。
关键词: 深黄被孢霉; 发酵; 油脂
中图分类号: Q939. 9 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-01-09
基金项目 : 浙江省科技计划重大项目 ( 2006C12030)
作者简介 : 耿青伟 ( 1984— ) , 男 , 山东临沂人 , 硕士研究生 , 主要从事产油微生物方面研究 .
* 通讯作者 : 吴开云 ( 1963— ) , 男 , 副研究员 , 主要从事微生物学方面研究 . E-mail: wukaiyun@ yahoo. com
Preliminary Study on the Mortierella isabellina
Fermentating to Produce Lipid
GENG Qing-wei1, 2 , WU Kai-yun1, WU Xiao-qin2, LI Ji-yuan1, LIU Ming-jing1, PING Xiu-min3
( 1. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China;
2. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;
3. Faculty of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China)
Abstract: To improve the yield of microbial lipids, the lipids production was studied by using the fungus Mortierella
isabellina. On the basis of the single factor experiment, the effect of various carbon and nitrogen sources and their
concentrations, inoculum size, initial pH and inorganic ions on mycelium growth and accumulation of lipid yield in
shaker culture was studied. The results showed that the optimal culture condition were as follows: glucose 100 g·
L
- 1
, yeast extract 3. 0 g·L - 1 , inoculum size 20% , initial pH 5. 0 ～ 6. 0, MgSO4·7H2 O 0. 5 g·L - 1 , KH2PO4
2. 0 g·L - 1 . Under the optimum culture condition, the biomass yield was 20. 62 g· L - 1, lipid content was
43. 02% , the lipid yield was 8. 87 g·L - 1 .
Key words: Mortierella isabellina; ferment; lipid
微生物油脂是人类继植物油脂、动物油脂之后
开发出的又一食用油脂新资源。近半个世纪以来,
世界上许多国家和地区如美国、英国和荷兰等都在
这方面取得了较大成果 [ 1 - 3] 。在欧洲、中东、南亚和
澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到保健食品
中 [ 4] 。而日本、德国、美国等目前已有商品菌油面
市, 其 中 日 本 O. Hiruta 等 利 用 拉 曼 被 孢 霉
( Mortierella ramanniana ( M?ller ) Linnem. ) IFO
( NBRC) 8l87 的诱变株, γ-亚麻酸 ( GLA) 的终产量
能达 5. 1 g·L- 1 [ 5 - 6 ] 。S. Papanikolaou 等 [ 3 ] 利用深
黄被孢霉( Mortierella isabellina Oudem. et Koning) 在
以葡萄糖为碳源的培养基中生产单细胞油脂, 油脂
第 3 期 耿青伟等: 利用深黄被孢霉发酵生产油脂的初步研究
得率和生物量得率分别为 17% 和 34% , 油脂含量为
50% 。在国内, 深黄被孢霉是发酵生产 GLA 的主要
菌株, 且 M. isabellina AS3. 3410 作为最适宜工业化
生产的出发菌株 [ 7 - 8 ] ; 吴思国等 [ 9 ] 在利用甲壳素解
聚产物 N-乙酰-D-葡糖胺 ( NAG) 为碳源的培养基
中, 浅白隐球酵母( Cryptococcus albidus ( Saito) Skin-
ner) ATCC56298 和发酵性丝孢酵母( Trichosporon fer-
mentans Diddens & Lodder. ) CICC1368 的菌体油脂
含量可达 67% 和 48% 。随着石油资源日趋紧缺, 石
油价格不断上涨, 微生物油脂已被作为生物柴油的
重要资源 [ 10 - 1 2] 。
由于产油微生物资源丰富、油脂含量高、能在多
种培养条件下生长的特点, 可利用和转化废弃木质
纤维素资源, 进行工业化规模生产和开发有着巨大
的潜力 [ 1 3] 。我国林业生物质资源总量巨大, 若利用
微生物转化技术, 木质原料经水解获得廉价的碳源,
利用纤维素发酵得到微生物油脂, 再经酯化可用于
制备生物柴油, 产量十分可观。目前国内有关产油
微生物的研究主要是从生物化工的角度考察一些生
产多不饱和脂肪酸的产油霉菌 [ 1 4] 。国际上对产油
微生物甘油三酯生物合成和代谢调控机制的研究已
取得了重要进展, 如已初步阐明了 AMP 脱氨酶、柠
檬酸裂解酶、苹果酸酶等的活性变化与甘油三酯积
累活动的关系 [ 15] , 但尚未见通过基因调控手段增加
细胞内油脂贮存含量成功的例子。随着微生物基因
工程改造技术不断进步, 以及林产化工上木质纤维
素降解技术的成熟, 发酵成本会不断下降, 将加速微
生物油脂规模化生产进程, 有利于更好地开发和利
用林业生物质能源。
据文献报道, 在氮源限制型培养基中, 深黄被孢
霉在表现正常生长活性的同时也表现出了显著的高
糖摄入量, 即使培养基的初始浓度很高也如此。待
氮源耗尽后, 真菌菌体中将会继续积累脂肪, 从而获
得可观的油脂产量 [ 3] 。由于深黄被孢霉具有较高的
产油潜力, 为进一步提高其油脂产量, 本研究以深黄
被孢霉为出发菌株, 在摇瓶培养条件下通过单因素
试验初步考察了碳源、氮源、碳氮比( C /N) 、接种量、
pH 值以及无机盐离子等对菌株生物量及油脂产量
的影响, 从而为获得较好的可以规模化生产的培养
条件打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试菌株深黄被孢霉( M. isabellina) , 由中国科
学院微生物研究所菌种保藏中心提供。
1.2 试验方法
1. 2. 1 菌株培养
斜面培养: 深黄被孢霉通过 PDA 斜面培养 3 ～
5 天, 直至菌丝长出大量孢子。
种子液培养: 用无菌水冲洗斜面上的孢子, 移液
枪吸 取 50 μL 接 种于 20 mL 液体 种 子 培 养基
( YEPD) 培养 24 h。
YEPD 配方: 葡萄糖 20 g·L - 1 , 酵母粉 10 g·
L
- 1
, 蛋白胨 10 g·L - 1 , pH值 6. 0。
发酵培养: 菌株按 20% 接种比例接种到限氮发
酵培养基, 于 28 ℃、160 r·min - 1摇床培养 7 天。
初始发酵培养基配方: 葡萄糖 80 g·L - 1 , 硫酸
铵 ( ( NH4 ) 2 SO4 ) 3. 0 g· L - 1 , 硫 酸镁 ( MgSO4 ·
7H2O) 0. 5 g· L- 1, 磷酸二氢钾 ( KH2 PO4 ) 2. 0 g·
L
- 1
, pH 值 6. 0, 1 ×105 Pa灭菌 25 min。
1. 2. 2 脂肪颗粒染色 染色方法: 苏丹黑染色
法 [ 1 6] 。培养好的菌体按常规方法涂片, 热固定, 用
苏丹黑 B 染色 15 min。倾去染料, 二甲苯脱色至载
玻片透明, 自然干燥后用显微镜观察, 脂肪粒呈蓝
黑色。
1. 2. 3 菌体生物量的测定 细胞干质量法 [ 17] : 发
酵液离心集菌, 60 ℃烘干至恒质量, 测定生物量。
生物量 ( g·L - 1 ) = 干菌体( g)发酵液( L)
1. 2. 4 菌体油脂含量测定 油脂提取方法: 酸热法提
取油脂[ 18] 。发酵液离心集菌, 菌体沉淀按每克菌 6 mL
的比例加人 4 mol·L- 1 盐酸, 振荡混匀, 室温放置
30 min后,沸水浴 10 min, - 20 ℃速冷, 加人 2 倍体积氯
仿∶甲醇( 1∶1) 提取液, 充分振荡后, 6 000 r·min- 1离心
5 min, 取氯仿层, 加等体积 0. 1% 氯化钠溶液, 混匀,
6 000 r·min - 1 离心 5 min, 取氯仿层, 100 r· min - 1
55 ℃真空旋转蒸发,除去氯仿即得油脂。
菌株油脂含量 =菌株油脂产量( g)菌体干质量( g) ×100%
1. 2. 5 油脂脂肪酸组成及含量的测定 气相色谱
法测定 [ 1 9] 。
2 结果与分析
2.1 深黄被孢霉菌体细胞脂肪颗粒的观察
采用苏丹黑染色法对发酵前后的深黄被孢霉菌
体进行染色观察。苏丹黑为脂溶性染色剂, 对菌体
染色后, 脂肪粒呈蓝紫色或蓝灰色。根据脂肪粒的
大小可以初步判断脂肪含量的多少。图 1-A 为摇瓶
733
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
发酵前菌体形态, 几乎观察不到脂肪颗粒。从图 1-
B 可以看出, 经过摇瓶发酵后深黄被孢霉菌体内已
积累了丰富的油脂, 图中菌体着色部位均为脂肪颗
粒( 如图中 a、b、c 所示) , 且分布均匀。
A: 发酵前菌体形态 ; B: 发酵后菌体形态 ; a, b, c: 脂肪颗粒
图 1 发酵前后深黄被孢霉菌体形态 ( 10 ×40, 苏丹黑染色 )
2. 2 不同碳源对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
在基础限氮培养基中分别以 80 g·L - 1 的葡萄
糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖作为碳源, 其他条件不变, 摇
瓶发酵结果如图 2 所示。结果表明, 以葡萄糖为碳
源时, 菌体生物量最大, 与蔗糖、麦芽糖两个处理间
差异达显著水平; 碳源为葡萄糖、蔗糖的两个处理间
菌体油脂产量差异不显著, 但显著高于麦芽糖、乳糖
两个处理, 且以葡萄糖为碳源时深黄被孢霉的油脂
产量、油脂含量及脂肪系数均高于其他处理, 可见该
菌株对葡萄糖的利用率最高。
图 2 不同碳源对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
2. 3 不同氮源对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
以葡萄糖为碳源, 分别以 3. 0 g·L- 1的硫酸铵
( ( NH4 ) 2 SO4) 、硝酸铵 ( NH4NO3 ) 、尿素、酵母粉、蛋
白胨作为氮源, 其他条件不变, 摇瓶发酵结果如图 3
所示。由图可知, 以酵母粉为氮源时, 深黄被孢霉的
生物量、油脂产量、脂肪系数均高于其他几种氮源,
油脂含量最高可达 41. 27% 。而以尿素为氮源的发
酵液中菌株的油脂产量仅为 0. 96 g·L - 1 , 明显低于
其他氮源。因此选择以酵母粉为该菌株摇瓶发酵培
养的氮源。
图 3 不同氮源对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
2.4 碳氮比 ( C /N) 对深黄被孢霉发酵产油脂的
影响
据文献报道 [ 2 0] , 适当提高碳氮比( C/N) 则有利
于提高微生物的油脂产量。一般而言, 细胞生长需
要充足的氮源, 而油脂合成一般是在氮源匮乏的条
件下才开始, 且油脂积累的最适碳氮比 ( C/ N) 会随
着菌株的不同而有所不同 [ 21 ] 。因此, 需要在基础培
养基的基础上系统调整氮源浓度以改变碳氮比 ( C /
N) , 考察菌体内油脂积累情况。
试验分别以碳氮比 ( C/ N) 为 95、120、160、200、
240 进行摇瓶发酵培养, 结果见图 4。由图 4 可知,
不同碳氮比( C/ N) 处理间, 菌体生物量差异显著, 随
着碳氮比的升高, 氮源浓度降低, 菌体生物量也降
低, 由此也表明氮源浓度对菌体生物量的显著影响。
油脂产量则在碳氮比 ( C/ N) 为 160 时达到最大, 且
较其他处理差异显著。因此, 确定发酵培养基的碳
氮比( C/ N) 以 160 为宜。
2.5 碳源浓度对深黄被孢霉生长及油脂合成的影响
在优化条件下, 以碳氮比( C/N) 为 160, 选取培养
833
第 3 期 耿青伟等: 利用深黄被孢霉发酵生产油脂的初步研究
图 4 碳氮比 ( C /N) 对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
基在葡萄糖浓度分别为 40、60、80、100、120、140 g·
L- 1下摇瓶发酵, 考察不同葡萄糖浓度对菌株产油量
的影响, 试验结果如图 5 所示。微生物合成油脂过程
中需要充足的碳源, 图中显示, 由于葡萄糖浓度较低,
直接影响油脂的积累, 致使油脂产量较低。随碳源浓
度的升高, 菌体的生物量、油脂产量以及油脂含量都
随糖浓度的增加而增加。但过高的糖浓度又会影响
菌体的生长和油脂的积累, 底物利用率降低。当葡萄
糖浓度为 100 g·L - 1时, 菌体生物量及油脂产量均达
最高水平, 脂肪系数较高, 为培养基的最适添加浓度。
图 5 不同葡萄糖浓度对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
2. 6 接种量对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
菌株于斜面培养后, 将孢子用无菌水洗脱并接
种于种子培养基培养 24 h, 分别按 5% 、10% 、15% 、
20% 、25% 、30% 接种量接种到发酵培养基中, 7 天
后测定其生物量和油脂含量, 试验结果如图 6 所示。
图中表明, 接种量 10% ～ 30% 各处理间生物量
差异均未达显著水平, 油脂产量以接种量为 20% 时
最高, 其次为 25% , 脂肪系数则以接种量为 20% 时
最高。由于培养基中营养成分一定, 高接种量并不
能有效提高深黄被孢霉的生物量及油脂产量, 反而
由于接种量过高, 导致培养基中营养匮乏, 使菌体细
胞增殖受到限制, 从而直接影响到油脂的积累。因
此以接种量为 20% 作为摇瓶发酵的最佳接种浓度。
图 6 接种量对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
2.7 pH 值对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
优化条件下, 设定发酵培养基不同 pH 值梯度
4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5 进行摇瓶发酵培养, 结
果如图 7 所示。分析表明, 深黄被孢霉可以在一个
较广泛的范围内生长和积累油脂, 生物量及油脂产
量在 pH 值 5. 0 ～ 6. 0 之间均较高。由于发酵过程
中菌体代谢旺盛, 会产生大量的有机酸, 使 pH 值下
降, 影响油脂产量 [ 22] 。试验发现培养基中 pH 值最
终会降至 2. 5 左右, 因此可以通过后期调节 pH值以
增加油脂的产量。
图 7 pH 值对菌株发酵产油脂的影响
2.8 无机盐离子对深黄被孢霉生长及油脂合成的影响
考虑到深黄被孢霉发酵产油脂过程中菌体生长
繁殖和代谢可能会需要无机盐离子的参与, 本试验
过程中适量添加硫酸镁 ( MgSO4·7H2 O) 、磷酸二氢
钾( KH2 PO4 ) , 以促进菌体生长及油脂的合成, 试验
结果如表 1、2 所示。
表 1 硫酸镁不同添加浓度对深黄被孢霉发酵产油脂的影响
硫酸镁 /
( g·L - 1 )
生物量 /
( g·L - 1 )
油脂产量 /
( g·L - 1 )
油脂
含量 /%
脂肪系数
0 18 . 35 b 7. 13c 38. 86 9. 38b
0. 5 20 . 62 a 8. 87a 43. 02 11. 08a
1. 0 18 . 64 b 7. 63b 40. 93 9. 65b
1. 5 18 . 49 b 7. 17c 38. 78 9. 41b
2. 0 18 . 15 b 7. 24c 39. 89 9. 66b
注 : 同一列数据中字母不同表示差异显著 ( p < 0. 05) , 下同。
933
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
表 2 磷酸二氢钾不同添加浓度对深黄被孢霉
发酵产油脂的影响
磷酸二氢钾 /
( g·L - 1 )
生物量 /
( g·L - 1 )
油脂产量 /
( g· L - 1 )
油脂
含量 /%
脂肪系数
0 17. 39 d 7 . 21c 41 . 46 10. 35b
1. 0 18. 88 c 8 . 24b 43 . 64 10. 86a
2. 0 20. 62 b 8 . 87a 43 . 06 11. 08a
3. 0 21. 32 a 8 . 44ab 39 . 59 10. 49ab
4. 0 20. 44 b 7 . 48bc 36 . 59 10. 33b
单因素试验表明, Mg2 + 对油脂产量影响较大,
而 K + 对油脂产量影响不明显, 但适当添加对菌体生
物量增加有明显影响, 同时由于发酵过程中会产生
大量有机酸, 磷酸二氢钾 ( KH2 PO4 ) 可以作为缓冲
剂, 有利菌体生长及油脂合成。由表 1、2 可知, 为获
得较高的油脂产量, 本试验可采用的无机盐浓度分
别为硫酸镁( MgSO4·7H2 O) 0. 5 g·L - 1 , 磷酸二氢
钾( KH2 PO4 ) 2. 0 g·L
- 1。
2. 9 油脂脂肪酸组成分析
生物柴油的主要成分是软脂酸、硬脂酸、油酸、
亚油酸等长链饱和与不饱和脂及酸同甲醇或乙醇所
形成的酯类化合物 [ 23 ] 。酸热法提取的油脂经甲酯
化后通过气相色谱对其脂肪酸成分进行分析, 其主
要脂肪酸成分及含量如表 3 所示。
结果显示, 深黄被孢霉产油脂中 C16 ～ C18 的
脂肪酸含量约为 95. 23% , 其中饱和脂肪酸的含量
约为 21. 43% , 不饱和脂肪酸含量约为 73. 79% 。
表 3 深黄被孢霉主要脂肪酸组分及含量
脂肪酸 含量 /%
十四酸 C14∶0 1. 588 75
十五酸 C15∶0 0. 106 28
软脂酸 C16∶0 20. 311 60
棕榈烯酸 C16∶1w9, 顺式 4. 233 29
十七酸 C17∶0 0. 070 66
硬脂酸 C18∶0 1. 049 38
油酸 C18∶1w9 61. 447 55
亚油酸 C18∶2w9, 12, 顺式 8. 110 40
花生酸 C20∶0 0. 114 11
顺 -11-二十碳烯酸 C20∶1w11, 顺式 0. 509 1
3 讨论
为提高微生物油脂产量, 本试验以深黄被孢霉
为出发菌株, 采用单因素方法分别从培养基的组成
及培养条件对菌株的发酵条件进行了优化, 优化条
件为: 葡萄糖 100 g·L - 1 , 酵母粉 3. 0 g·L - 1 , 接种
量为 20% , 初始 pH 值为 5. 0 ～ 6. 0, 硫酸镁( MgSO4
·7H2O) 0. 5 g·L- 1, 磷酸二氢钾( KH2 PO4 ) 2. 0 g·
L - 1。优化条件下深黄被孢霉菌体生物量为 20. 62 g
·L - 1 , 油脂含量为 43. 02% , 油脂产量为 8. 87 g·
L
- 1
, 较优化前生物量提高了 55. 98% , 油脂产量提
高了 143. 68% , 表现出较高的产油潜力。气相色谱
分析表明, 深黄被孢霉油脂的脂肪酸组成与植物油
脂的组成相似, 可用作生物柴油行业的新油源。
据新近文献报道 [ 2 4] , 在深黄被孢霉突变菌株的
优化培养过程中, 发酵生物量为 51. 308 g·L - 1 , 产
油量最高可达 20. 291 g·L - 1。由于本试验所用菌
株为野生型菌株, 并且采用的是合成培养基, 试验结
果与文献报道仍有一定差距。因此, 通过筛选诱变
菌株和构建基因工程菌株以提高油脂产量和特定脂
肪酸组分的含量则显得尤为重要, 目前本研究组正
在从事这方面的研究。同时, 结合林业上木质纤维
素水解技术, 合理利用农林废弃物等可再生资源, 可
为微生物提供丰富的碳源, 可以有效降低发酵成本,
具有广阔的工业化应用前景。
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