全 文 ：林业科学研究　1999, 12( 4) : 374～378
For es t R esear ch　　　　　　　　　　
　　* 本文属广东省林业厅项目“木麻黄根瘤菌——弗兰克氏菌应用研究”课题( 1993～1997 年)和中国林科院基金项目
“木麻黄根瘤菌——弗兰克氏菌的应用生态学研究”课题( 1993～1995年)的一部分。参加工作的还有热林所郑翠梅同志。
1998-08-15收稿。
木麻黄弗兰克氏菌的菌剂类型与
保藏方法对接种效果的影响*
康丽华1)　李素翠1)　彭耀强2)　刘玉粼2)　陈华成2)　罗成就2)
( 1)中国林业科学研究院热带林业研究所, 510520,广州; 2)广东省林业厅, 510173,广州;
第一作者 44岁,女,副研究员)
　　摘要　用弗兰克氏菌(Frankia) 9022菌株和287菌株的3种菌剂类型、2种保藏方法对木麻黄苗
木接种效果影响的研究结果表明: 9022菌株的3种菌剂类型以室温保藏6～9个月的蛭石菌剂的接种
效果最好, 287菌株则以4 ℃保藏6～9个月的干海藻酸钙菌剂的接种效果最好, 其苗高生长、生物
量、结瘤量和侵染率最高。室温保藏的9022菌株和287菌株的干海藻酸钙菌剂接种效果最差。应用
MPN 方法测定了经过24个月室温保藏的9022菌株蛭石菌剂的活菌数量为4. 8×103个
g - 1。
关键词　弗兰克氏菌剂; 保藏; 接种效果
分类号　S718. 81
　　当前, 世界上的人口、资源、环境已成为举世瞩目的问题,微生物制剂在持续发展的农、林
业中的应用无疑将占有愈益重要地位,因为它不但有利于产量和品质的提高,而且能够减缓环
境污染。目前研究和应用较多的有根瘤菌剂、固氮菌剂等[ 1] ,但对弗兰克氏菌( F rank ia)菌剂研
究较少。弗兰克氏菌与木麻黄共生固氮, 对提高木麻黄生长和林地土壤改良具有重要意义 [ 2]。
进行大面积的人工接种迫切需要应用简便、携带方便的优良菌剂。本文研究了弗兰克氏菌的 3
种菌剂类型、2种保藏温度及不同保藏时间对苗木接种效果的影响,旨在为弗兰克氏菌剂生产
提供科学依据。结果报道如下。
1　材料与方法
1. 1　弗兰克氏菌株来源及菌体的培养
供试菌株 JCT 287从澳大利亚细枝木麻黄( Casuarina cunninghamiana Miq)根瘤中分离
获得[ 3] ; 弗兰克氏 9022菌株从本所苗圃粗枝木麻黄( C. glauca Sieber)根瘤中分离获得 [ 2]。弗
兰克氏菌的大量培养采用 Bap [ 4]培养基和通气培养法 [ 5] , 25℃培养 14 d后用来制备菌剂。
1. 2　菌剂制备
1. 2. 1　海藻酸钙胶囊菌剂　将培养好的弗兰克氏菌用海藻酸钙溶液包埋,使之成为直径 0. 5
～0. 7 cm 的球形颗粒 [ 6] ,在 Bap培养液培养 10 d后, 自然风干成干菌剂备用。
1. 2. 2　草炭菌剂　草炭经 60号土壤筛(筛孔为 0. 25 mm) , 每个塑料袋装 8 g, 121 ℃高温灭
菌 1 h待冷却后加入上述培养的弗兰克氏菌悬液 8 mL, 混匀后封口,放室温培养 10 d备用。
1. 2. 3　蛭石菌剂　蛭石经 10号土壤筛(筛孔为 2 mm) ,每个塑料袋装 8 g , 121 ℃高温灭菌
1 h待冷却后加入上述培养的弗兰克氏菌悬液 8 mL,混匀后封口, 放室温培养 10 d 备用。
1. 3　菌剂保藏方法
将上述的海藻酸钙胶囊菌剂、草炭菌剂和蛭石菌剂分别于 4℃冰箱和室温条件下保藏,在
保藏 3、6、9、12、24个月时, 分别接种到木麻黄苗木根系。
1. 4　苗木培育方法
接种采用木麻黄无性系苗木,每次接种的无性系插条均采自本所苗圃同一株普通木麻黄
( C. equisetif olia M iq) ,生根方法用小枝水培法[ 7] , 待插条的根长至 2～3 cm 时移入装有经 121
℃高温灭菌的蛭石和沙(体积比为 1∶1)的塑料育苗容器,每个塑料育苗容器移 1株苗。
1. 5　菌剂的接种方法
分别取出经不同时间、不同方法保藏的草炭菌剂、蛭石菌剂 3袋,混匀后,每株苗木分别接
种草炭或蛭石菌剂 1 g 或接种海藻酸钙胶囊菌剂 20粒。每个处理重复接种 8株苗。6个月后
观察苗木高生长、生物量、根瘤数量及质量。
1. 6　菌剂弗兰克氏菌活菌计数
采用植物侵染试验的 MPN 方法(最大可能数法)测定在室温和冰箱保存 24个月菌剂的
弗兰克氏菌活菌数量[ 8]。
2　结果与讨论
2. 1　保藏方法对菌剂接种效果的影响
表 1是室温和 4 ℃保藏 12个月的 3种菌剂类型接种苗木的结果,表明不同的保藏方法影
响菌剂的接种效果。其中室温条件下保藏的 9022菌株的蛭石菌剂接种效果最好, 苗高生长、根
瘤数量和质量、结瘤率、地上部分和地下部分及总生物量最高;其次为草炭菌剂;而 287菌株则
是草炭菌剂的接种效果最好,其次为蛭石菌剂。9022和 287菌株的干海藻酸钙菌剂的接种效
果最差。4 ℃保藏的 9022和287菌株的干海藻酸钙菌剂其接种效果最好,其次为蛭石菌剂;草
炭菌剂的接种效果最差。试验结果说明蛭石和草炭菌剂较适合在室温条件下保藏,干海藻酸钙
菌剂则较适合在 4 ℃条件下保藏。弗兰克氏菌的蛭石和草炭菌剂的保藏特性与根瘤菌菌剂较
适合在低温保藏的特性有所不同,这可能与弗兰克氏菌具有孢子的形态特征有关,一般来说具
有孢子的微生物对不良环境的抵御能力较强。据报道用无氮培养基在室温条件下保藏 6 a 的
弗兰克氏菌仍然存活[ 9]。
表 1　菌剂保藏方法与接种效果
菌株 菌剂类型
菌高/
cm
4℃ 　室温
瘤数/
(个·株- 1)
4℃ 　室温
瘤重/
( m g·株- 1)
4℃ 　室温
地上部分/
( g·株- 1)
4℃ 　室温
地下部分/
( g·株- 1)
4℃ 　室温
总生物量/
( g·株- 1)
4℃ 　室温
结瘤率/
%
4℃ 　室温
蛭　　石 19. 4 18. 0 29 37 44. 9 63. 0 1. 08 1. 07 0. 19 0. 21 1. 27 1. 28 62. 5 75. 0
9022 草　　炭 17. 3 18. 4 20 31 42. 7 44. 8 0. 66 0. 83 0. 17 0. 17 0. 83 1. 00 42. 9 75. 0
干海藻酸钙 17. 8 16. 4 16 12 45. 8 41. 3 0. 91 0. 68 0. 27 0. 19 1. 18 0. 87 50. 0 37. 5
蛭　　石 17. 5 18. 9 28 33 27. 0 50. 8 0. 57 1. 00 0. 19 0. 20 0. 76 1. 20 33. 3 75. 0
287 草　　炭 19. 1 19. 6 46 29 31. 2 48. 6 1. 05 1. 14 0. 15 0. 17 1. 15 1. 31 62. 5 85. 7
干海藻酸钙 21. 7 17. 3 40 1. 5 63. 2 21. 3 1. 59 0. 60 0. 20 0. 21 1. 79 0. 81 85. 7 25. 0
对照 (不接菌) 14. 2 2 0 0. 56 0. 15 0. 71 0
375第 4 期　　　　　　康丽华等: 木麻黄弗兰克氏菌的菌剂类型与保藏方法对接种效果的影响　　　　　　
2. 2　保藏时间对菌剂接种效果的影响
图 1中 3种菌剂类型在室温和 4 ℃保藏 3个月时接种的苗木根瘤生物量很少; 9个月时
接种的苗木根瘤生物量最高;保藏 12个月时接种的苗木根瘤生物量已开始下降。根瘤生物量
说明了苗木的结瘤情况,同时也反映出不同菌剂类型弗兰克氏菌的存活情况,结果表明弗兰克
氏菌能够在草炭、蛭石和海藻酸钙载体中生长繁殖。
Z:室温保藏的蛭石菌剂;　　　　ZF: 4 ℃保藏的蛭石菌剂
C:室温保藏的草炭菌剂; CF: 4℃保藏的草炭菌剂
H:室温保藏的干海藻酸钙菌剂; HF: 4℃保藏的干海藻酸钙菌剂
图 1　不同保藏条件下的 F rankia菌剂对木麻黄苗木结瘤的影响
图 2　不同保藏条件下的 Fr ankia菌剂对苗木侵染率的影响
(图注同图 1)
　　从图 2可以看出, 除了 4℃保藏的干海藻酸钙菌剂在6个月后侵染率开始下降外,其余菌
剂在保藏 3个月后其侵染率就开始下降。随着保藏时间的延长,侵染率明显下降;其中室温保
藏的干海藻酸钙菌剂侵染率下降最为明显。图 2的结果表明菌剂随着保藏时间的延长,菌体活
376　　　　　　　　　　　　　　林　业　科　学　研　究　　　　　　　　　 　　　　　　第 12 卷
力下降致使侵染率明显下降。
2. 3　菌剂类型与保藏条件的关系
从图 1和图 2的结果看出: 菌剂类型与保藏条件关系密切。室温保藏的蛭石菌剂和草炭菌
剂接种木麻黄苗木其结瘤和侵染率较高;而干海藻酸钙菌剂不但结瘤量最低而且侵染率也是
最低,说明在相同的保藏条件下不同的菌剂类型影响其苗木的接种效果。287菌株的干海藻酸
钙菌剂 4 ℃保藏时其苗木结瘤量和侵染率最高, 而在室温保存时其苗木结瘤量和侵染率则是
最低,说明保藏方法影响菌剂的接种效果。以上结果表明不同菌株及不同的菌剂类型应当选择
各自合适的保藏方法。
2. 4　不同菌剂弗兰克氏菌活菌的数量
应用 MPN 方法对室温和冰箱保藏 24
个月的 9022菌株的菌剂进行活菌数量的检
测,结果见表 2, 从中看出经过 24 个月的室
温与4 ℃冰箱保藏的不同菌剂其活菌数量差
异很大。室温保藏的蛭石菌剂活菌数量最多,
每克菌剂含有 4. 8×103个活的弗兰克氏菌;
其次为 4 ℃冰箱保藏的蛭石菌剂,室温保藏
的干海藻酸钙菌剂活菌数量最少。
　表 2　保藏 24个月的 9022 菌株不同菌剂类型
活菌数量的分析
菌剂类型 保藏方式 活菌数量/ (个·g- 1)
蛭　石 室温
4℃
4. 8×103
2. 3×103
草　炭 室温
4℃
5. 8×102
2. 3×102
干海藻酸钙胶囊 室温
4℃
ND(数量极少)
3. 6×102
3　结　语
　　综上所述, 弗兰克氏菌 9022菌株的 3种菌剂类型以室温保藏 6～9个月的蛭石菌剂其接
种效果最好, 287菌株则以 4℃保藏 6～9个月的干海藻酸钙菌剂的接种效果最好。室温保藏
的 9022菌株和 287菌株的干海藻酸钙菌剂接种效果最差。
参　考　文　献
　　1　吴薇,葛诚.我国微生物肥料生产和应用现状的调查研究.微生物学通报, 1995, 22( 2) : 104～107.
2　康丽华.木麻黄苗期接种弗兰克氏菌效应及其与营养元素的关系.林业科学研究, 1994, 7( 2) : 129～132.
3　 Shipton W A, Burggr aaf A J P. Aspects of the cultural behaviour of F rankia and poss ible ecological implicat ion.
Can . J. Bot . , 1983, 61: 2783～2792.
4　Murry M A. Grow th kinet ics and n itr og enase indu ct ion in f rankia SP HFPPArI grow th in batch cu lture. Plant and
Soil, 1984, 78: 61～78.
5　康丽华.木麻黄根瘤中分离的三株弗兰克氏菌生长与培养方法的研究.林业科学研究, 1996, 9( 1) : 47～51.
6　Diem H G, Duhoux E, Simonet P, et al . Act inorh izal sym biosis biotechology: T he pres ent and the fu tu re. In :Durand
G, Bob ichon L, Flor ent J, eds, Proceedin g of the 8th Intern at ional Biotech nology Sympos ium, Volume 2, Paris: S oci-
ete Francaise d e Microbiologie. 1988, 984～995.
7　梁子超.木麻黄抗青枯病小枝水培繁殖法.林业科技通讯, 1986( 5) : 24～26.
8　伯杰森 F J 主编.生物固氮研究法.陈冠雄等译.北京:科学出版社, 1987. 222～227.
9　苏风岩. Frankia 菌种保藏.微生物学报, 1994, 43(2) : 148～151.
377第 4 期　　　　　　康丽华等: 木麻黄弗兰克氏菌的菌剂类型与保藏方法对接种效果的影响　　　　　　
Effect on Inculation of Forms and Storage Methods
of Casuarina Frankia inoculum
K ang L ihua
1)　Li S ucui1)　P eng Yaoqiang2)　L iu Yulin2)
Chen H uacheng
2)　L uo Chengj iu2)
( 1) T he Research Ins titute of Tropical Forest ry, CAF, 510520, Gu angzhou, Chin a;
2)Forest ry Depar tm ent of Guan gdong Province, 510173, Guangzhou, Ch ina)
　　Abstract　Signif icant advances have been made in the development of peat-based, vermi-
culite-based and alginate bead Frankia inoculum. Invest igat ions of stor ag e condit ions for
peat , verm icul ite and alginate Frankia inoculum show ed that the inoculant of Fr ankia 9022 in
vermiculite maintained high viability and infect ivity for up to 6 months w hen stored at ro om
temperature; the inoculant of F rankia 287 in alginate bead maintained high viability and in-
fect ivity fo r up to 6 months w hen sto red at 4℃. Determinat ion the number of po tentially in-
fect ive units for Frankia 9022 verm iculite inoculant of 24 months sto rage at ro om tempera-
ture w ere 4. 8×103 / g inoculant .
　　Key words　Frankia ino culum; storag e; effect of inoculat ion
378　　　　　　　　　　　　　　林　业　科　学　研　究　　　　　　　　　 　　　　　　第 12 卷