全 文 ：第 4 卷 第 4 期
1 9 9 1 年 8 月
林业 科学研 究
FO R E S T R ES EA R CH
V o l
.
4
,
N o
.
4
A u g
。 ,
1 9 9 1
用紫外分光光度法测定木腐菌
木素分解酶活力的研究 *
刘秀英 王 正
(中国林业科学研究院木材工业研究所 )
摘要 利用木素特有的紫外吸收波长 , 通过定量测定含木素溶液中酶作用前后木素 物 质 (底
物 )的变化量 , 测定木腐菌木素分解酶的活力 , 具有操作步骤简单 、 测定速度快等优点 , 为高木素
代谢能力菌株的筛选研究 , 提供了一个较好的测试方法 。
关抽词 木素酶 ; 紫外分光光度法 ; 木腐菌
木质素 (简称木素)是目前世界上未被较好利用的生物资源之一 。 我国每年有大量木素物
质作为制浆造纸的废弃物被排入江河 , 严重污染环境 。 因此 , 木素利用的研究已成为各国化
学及生物化学工作者致力解决的问题之一 。 在木质素利用的研究中, 把它作为 某 些 微 生物
(如各种木腐菌类)的碳源 , 进行木素的生物转化是一个重要方面 。 在此类研究中, 首先要做
的是高木素代谢能力菌株的筛选及菌株代谢调节控制等研究 , 其中测定菌株木素分解酶活力
则是不可缺少的手段之一 。
木腐菌木素降解酶活力 , 可以根据酶作用后底物减少量或产物生成量的测定结果来确定
(一般有 ’‘C标记法〔’l和官能团缺失测定法 f么一 ‘l)。 这些测定方法需要特殊的设备和 手 段 , 或
操作程序繁杂 , 测定周 期长。 本文采用紫外分光光度法测定木腐菌木素降解酶活力, 使操作
程序大为简化 , 所用仪器目前也基本普及 。 其原理是利用木素特有的紫外吸收波长 , 通过定
量测定含木素溶液中酶分解前后底物 (木素物质)的变化量来测定菌体中木素分解酶活力 。
1 材料和方法
1
。
1 仪器
7 51 G 型紫外分光光度计 , 上海分析仪器厂出品, 选用波长 203 n m 。
1. 2 菌种及其来源
彩绒革盖菌 Cor l’o lu : 毋 , : ico ioT (L . e x Fr . ) Q吐 1. 是一种白腐菌 , 简称 C . v 。 棉腐卧
孔菌 p o1 l’a 川ac 。”ta (Fr . ) Co o k e . 是一种褐腐菌 , 简称 P . p 。 菌种由中国林科院木材所 防
护室保藏。
将菌种接入麦芽糖琼脂培养基上 , 在温度 28 士 1 ℃时培养40 天后开始测定 。
本文于 1 99 1年 1 月 5 日收到 。
* 本项研究为中国林科院基金项 目“木腐菌三种主要 木材分解醉活力测定方法的研究和评价 ”部夯内容 .
4 2 4 林 业 科 学 研 究 4 卷
1
.
3 培养基制备
麦芽糖液(波梅氏 比重一 0 3 )1 o o o m l, 琼脂 2 0 9 , i . l k g / c m Z蒸汽灭菌 3 o m in , 在无菌
条件下制成琼脂平皿培养基 , 20 m l/ 皿 。
1
.
4 溶液配制
将 己知浓度的木素原液 (由中国林科院木材所人造板室化学组提供 )按一定比 例 加入 到
p H 值 5 . 5的磷酸盐缓冲液中制成测试液 。 配制后的测试液中木素浓度需要精确测定 。
1
.
5 标准曲线绘制
将已知浓度的木素原液 p H 值 5 . 5的磷酸盐缓冲液精确稀释 , 在 木 素 含 量 1 . 0 ~ 1 0 . 0
协g / m l范围内取 0 . 7 2 、 1 . 4 4 、 2 . 5 5 、 4 . 3 3 、 7 . 2 0 卜g / m l的 5 个浓度 , 以稀释剂为空白 对 照
分别测定上述不同浓度稀释液在 2 0 3 n m 处的 O D 值 , 绘制出 O刀一浓度曲线 。
1. 6 洲定步异
1
.
6
.
1 晦作用前后测定中木素浓度刚定 将配好的测试液用稀释剂(p H 值 5 . 5 磷酸 盐 缓 冲
液 )稀释到可测浓度范围 , 以稀释剂为空白测定测试液在 2 03 n m 处的 O D 值 , 从标准曲线中
查出稀释后测试液浓度 。
酶解前测试液中木素浓度按下式计算 : E 二 A . C
E : 酶解前测试液中木素浓度 (协g / m l) ; A : 稀释倍数 , C : 从标准曲线中查出的
木素溶液浓度(协g / m l) 。
本文中配制的测试液中木素浓度分别为3 4 . 0 0 、 6 6 . 。。、 1 3 0 . 0 、 3 65 . 0 p g / m lo
1
.
6
.
2 测试操作 精确称取定量培养的木腐菌菌丝体放入 2 0 m l摇瓶中 , 用移液管加入 25
m l测试液 , 另取一摇瓶加相同量的菌丝体与测试液量相同的稀释剂制成空白液 。 用12 层纱布
封 口 , 放入摇床中振荡培养 , 转数为 20 0 r pm , 培养温度为38 士 2 ℃ , 培养时间为48 h 。
1
.
6
.
3 晦作用后 测试液和空 白液木素浓度 用稀释液以相同的稀释倍数稀释 , 以 稀 释后的
空自液为空白 , 测定酶作用后 测试稀释液的 O D 值 , 按下式计算木素浓度 : E, = A, ·C, 。
厂 : 酶解后测试液中木素浓度 (协g / m l) ; A ‘: 稀释倍数 ; Cl : 稀释液木素浓度 (“g / m l) 。
1
.
7 蔺活力计算
计算公式为 : U “ (B E 一 刀‘五‘) /评S
U : 酶活力单位(协g / g ·h ) , 单位时间内每克干菌体分解木素的微克数 ,
E
、厂 : 酶作用前后测试中木素浓度印g / m l) ; B 、 B, : 酶作用前后测 试液量 (m l) ,
W
: 测试液中菌体干重(g ) ; S : 酶作用时间(h )o
2 试验结果
2. 1 实验条件的选择
2
.
1. 1 底物浓度 从表 l 看出 : 在酶 浓 度
一定的前提下 , 底物浓度越高 , 酶活力越高 ,
但到一定范围时酶活力即不再 提 高。 对 于
C
.
v 菌 测试液中 , 底物浓度在 13 0 卜g / m l时 ,
酶活力即达到恒定 , 而P . p 菌则需要更高一
咚的底物 鼠。 因此 , 在本文给定的条件一I: ,
裹 1 不同雇物浓度下的木索降解呜活力
(单位 : p g / g · h )
底 物 浓 度 (协9 1 m l)
3 4
.
0 0 6 6
.
00 13 0
。
0 0 3 6 5
.
0 0
2 0 3
.
5 0 2 2 3
.
0 0 78 4
.
5 0 7 4 6
.
0 0
8 8 0 0 2 9
.
0 0 15 2
.
0 0 4 79
.
0 0
之L : 酶作用时间 4 8 h 。
选用 3 0 协g / m l左右的底物浓度为木素酶活力测
4 期 刘秀英等: 用紧外分光光度法测定木腐菌木素分解酶活力的研究
试液。
2
。
l
。
2 反应温度 反应温度高 , 酶促反应速度加快 , 但较高的温度易导致酶的失活 , 测试用
酶促反应温度以不超过 40 ℃为宜。 因此 , 本文选用38 ℃ 为测试温度 。
2
。
1
。
3 p H 值 为了使不同批次间的酶促反应条件一致 , 数据有可 比性 , 在整个测试 过 程中
pH 值应保持恒定 。 因此 , 本文选用 p H 5 . 5磷酸盐缓冲溶液为测试介质 。
2
。
1
.
4 反应时间 从表 2 看出两种木腐菌在不同的反应时间内木素酶活力 的 变化 : C . v 菌
酶活力随着酶作用时间的延长下降得很快 , 而 P . p 菌则稍有下降。 出现 这 种 情 况 是 由 于
C
.
v 菌酶解速度较快 , 使测试液中底物消耗较多 , 从而导致酶活力不能充分发挥 , 随着振荡
反应时间的延长 , 酶发生失活等原因。 本文选用酶作用48 h 为活力测定时间。
表 2 醉作用反应时间对木衰醉活力的影晌
菌 种
侧 试 锥
底物含量
(件g )
12 0 h
底物分解
(卜g )
醉 活 力
(p g / g
·
h )
底物分解
(卜g )
酶 活 力
(协g / g · h )
底物分解
(协g )
酶 活 力
(卜g / g · h )
9 1 2 5 3 7 2 3 4 6 7 7
P
.
P 9 1 2 5
7 4 6
4 79 2 8 2 3
12 4
3 1 6 3 5 4 8
1 3 4
4 0 8
2
.
1
.
5 振荡与静止试验 木素降解过 程 为
一需氧过程, 介质中溶解氧含量的多少对木
素酶活力的影响较大 。
从表 3 看出除 P 。p 菌 (2) 外 , 其它三株
菌在静止条件下木素降解酶的活力都低于振
荡条件(本实验 选 用 20 0 m l摇瓶 , 加 液 量
2 5 m l
, 振荡转数 2 0 0 r p m ) 。
2
。
1
。
6 失活与未失活处理试验 从表 4 看
裹 3 介质在振荡与协止条件下
对木素降解眺活力的影晌
振 荡时醉活力
(卜g / g · h )
静止时酶活力
(协g / g · h )
C
.
C
出 , 经失活处理后C . v 菌的木素降解酶活力急剧下降 , 进一步证实了溶液木素含量减少为酶
分解所致。
表 4 失活与未失活对 C . 、菌木紊降解醉活力影晌
未 失 活
1 2 3 平 均
(p g / g
·
h )
4 7 0
.
7 3 2 3 5
.
4 4 35 1
.
0 9 1 0 8 0
.
3 0 1 1 4 1 4 3 9 7 8
.
5 7 1 0 6 6
‘
7 7
2. 2 浦试结果
两种木腐菌在上述固定的测试条件下木素酶对木素分解测试结果(见表 5 )表明: 在一定
的测试条件下 , 测试液被两种菌处理后木素的浓度及含量都有减少 , 其中 C . v 菌作 用 后 木
素减少量 比 P . p 菌更为明显 。 显示出白腐菌比褐腐菌有更强的木素酶活力 , 这一结 果 与 其
它文献 I。〕相一致 。 因此 , 该方法作为一种木腐菌木素降解酶活力测定方法是可行的。
42 6 林 业 科 学 研 究 4 卷
襄 5 两种木启, 木, 醉活力洲试给.
醉 作 用 前 醉 作 用 后 醉 活 力
菌 种 底物浓度
(协g lm l)
木素总量
(协g )
剪
L g 、
液
干 )/ 哄. 】1 1 底物浓度(卜g / m l) 木素剩余皿(卜g ) 木素分解蚤(p g ) (协g /g · h )
C
.
v
P
,
P
3 65
3 6 5
9 12 5
9 1 2 5
0
.
4 2
0
.
30
2 3 2
32 0
5 4 2 9 3 6 9 6 74 6
7 4 2 4 1 7 0 1 4 7 9
3 结论与讨论
木腐菌使木素分解的过程是一个较为复杂的代谢过程 , 目前还有一些环节没有搞清楚。
根据一些文献报道 , 认为漆酶 、 纤维二糖氧化还原酶 、 过氧化氢酶及其他一些加 氧 酶 等 酶
系都对木素的降解起作用 {一句 。 因此 , 从木腐菌中直接制备出可使木素降解的 酶 制 剂 是 比
较复杂的 , 而单一或某几种酶系的制取并不能体现整个生物体对木素分解的实际能力 (其 中
有些酶系不仅参与木素的分解 , 还参与木素的合成〔. } ) 。 本研究不追求某一种酶系对木 素 的
作用机理 , 而是测定被测生物体所产生的对木素分解的总体酶的结果。 因此 , 本文采用紫外
分光光度法用于木腐菌木素降解酶活力的测定 , 并具有操作步骤简单 、 测定速度快等优点 ,
此方法如用于高木素代谢能力菌种的筛选及菌种代谢条件的选择与控制等研究 , 可以节省经
费和时间 。
今 考 文 献
〔z 〕 K a d a m , K . 1 . e t a l. , z , 5 6 , S t u d y o f l』 ig n in s io tr a sfr o r m a t io n b y A s P e r g illu s F u m ig a tu s a n d
W h it
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[ a b e le d a n d U n la b e lo d K r a ft L ig n in s
,
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仁7 〕 T ie m , M . e t a l . , 1 9 . 3 , I ig n in 一 d e g r a d ; n g E n 乞y m e fro m t he H y m e n o m y ee t e Ph a n e ro c ha e te
Ch r y s o s to r iu m B u r d s
,
S e fe o c 口 . , 2 2 1(4 6 1 1 ) . ‘6 1 .
仁8 〕 1 ’i气m , 卜I · e t a l· , 19 8 4 , L ig n in 一 d e g r a d in g Fn z y rn e fr o m p h a n e r o e h a e te Ch r y s o s p o r iu m . p u r if -
e a t io n
,
C h a r a e te r iz a t io n a n d C a t ly t ie Pr o P e r t ie s o f a U n iq u e H : O :
一
R e q u ir in g O x yg e n a se
,
P r o c
.
N a tl
. 了e i . , 8 1 (s) : 2 2 8 0 ~ 2 2 8‘.
仁。〕 八lo y s 卜Iu tte r m a n n e t a l. , 1 0 80 , Po ly m e r i乞 a t io n o fw 立tr 一In so lu b le L ig n in s b y F o 阴尸s a 。,召。‘“s ,
H o l之fo s c 人u o g . , 5 4(z ): 6透~ 石6 .
4 期 刘秀英等 : 用紫外分光光度法侧定木腐菌木素分解酶活力的研究 427
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国 际 袖 木 会 议 简 讯
由林业部主持的中国/ 亚太经社会 / 粮农组织亚太区域袖木研究与发展研讨会于 19 9 1年 3 月 20 ~ 27 日 在
广州召开 。 出席会议的有中国 、 孟加拉国 、 丹麦、 法国 、 印度、 印度尼西亚 、 老挝 、 缅甸 、 菲律 宾 、 斯里
兰卡 、 泰国和越南共12 个国家的31 名代表与官员。 会议选出洪菊生教授(中国)为主席 , R at a n L al B a成k
先生(孟加拉国 )与 M e五n K o K o G y i 先生(缅甸)为副主席。 中国林业部外事司司长杨禹畴代表中国致欢
迎词 。 5 . Z . K 五a n 先生与 Y . 5 . R a 。 博士分别代表亚太经社会与亚太地区粮农组织致词 。 广东省林 业
厅厅长梁星权向会议代表致欢迎词 。 接着各国代表分别作了袖木研究与发展的报告和专题报 告 。 会议强调
要为发展提供遗传品质优良的 种子 , 干形圆满度与装饰花纹的改良, 对种子播种前的处理 、 育苗密度 、 菌
根 、 固氮、 混农作业、 装饰薄板和小规格原木加工技术等开展研究。 会议注意到世界市场对抽木异乎寻 常
需求的吸引力 , 大规模栽培的同时要发展小农户栽培或作庭院种植 , 以视作为一家一户在 20 年内外提供 一
笔可观现金以满足意外之需 。 会议通过接受 “建立亚太区域抽木研究与发展 网络 , 第一期秘书 处设在中国’
的建议 。 会后 , 代表们赴海南省对中国的抽木研究与发展基地进行考察。 热林所受林业部 委托正积极筹备
建立 “袖木研究与发展网络 ” 。这次会议的成功召开 , 将对亚太地区和我国抽木的研究发展产生重要的影响。
(邝炯朝)