全 文 ：第 51 卷 第 6 期
2 0 1 5 年 6 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 6
Jun．，2 0 1 5
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20150612
收稿日期: 2014 － 01 － 17; 修回日期: 2014 － 06 － 08。
基金项目:国家高技术研究发展计划课题(2012AA101503)。
* 朱天辉为通讯作者。
一种适于 PCＲ和 LAMP检测的松木中松材线虫
DNA快速提取方法*
苟大平1，2 王曦茁2 汪来发2 田国忠2 朱天辉1 郭民伟2
(1． 四川农业大学林学院 雅安 625014; 2．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所
国家林业局森林保护学重点实验室 北京 100091)
摘 要: 【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫 DNA 的方法。【方法】运用 Chelex-
100 结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫 DNA 的方法，并通过普通 PCＲ 与环
介导等温扩增(LAMP)对提取的 DNA 进行检测验证。【结果】建立了提取线虫 DNA 的新方法 Chelex-100 法，并对
影响提取效率的 Chelex-100 浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100 法最适 Chelex-100 终浓度为 1. 5%
( W /V)，最适冻融时间为 5 min，最适煮沸时间为 8 min。与传统的 CTAB 法和蛋白酶 K 法比较，Chelex-100 法提取
的 DNA 得率高，相同条件下，该方法提取的 DNA 浓度远远大于常规方法。3 种方法的 OD260 /280比值从大到小依次
为 CTAB 法 ＞蛋白酶 K 法≥Chelex-100 法，Chelex-100 法的 OD260 /280值显著低于 CTAB 法，而略低于或等同于蛋白酶
K 法，但这并不影响对提取的 DNA 进行 PCＲ 扩增。采用 Chelex-100 法提取松木中松材线虫的 DNA，结合常规的
PCＲ 和 LAMP 检测，检测灵敏度高，特异性强，稳定性好;提取的松材线虫 DNA 的 75 倍稀释液再稀释 32 倍后进行
PCＲ 扩增，扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的 DNA 后进行检测，所有带病松木样品的
检测结果均呈阳性，而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外，该提取方法简便
快速，20 min 内即可完成整个 DNA 的提取; 经济方便，试剂保藏无特殊要求，单个样品提取耗费低于 3. 5 元。【结
论】Chelex-100 法是一种快速有效的提取松木中松材线虫 DNA 的方法，此方法结合 PCＲ 和 LAMP 检测技术将进一
步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性，可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。
关键词: 松材线虫; DNA 提取; Chelex-100
中图分类号:S763 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2015)06 － 0100 － 11
A Method for Ｒapidly Extracting DNA of Bursaphelenchus xylophilus from the
Infested Pine Wood for PCＲ and LAMP Detection
Gou Daping1，2 Wang Xizhuo2 Wang Laifa2 Tian Guozhong2 Zhu Tianhui1 Guo Minwei2
(1 ． College of Forestry，Sichuan Agricultural University Ya’an 625014; 2 ． Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry
Administration Ｒesearch Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，CAF Beijing 100091)
Abstract: 【Objective】It is crucial for detection of the pine wood nematode ( PWN) to develop a rapid and economic
method of DNA extraction from the infested wood samples by Bursaphelenchus xylophilus． This study aims at developing a
method for rapidly extracting DNA of Bursaphelenchus xylophilus from the infested pine wood．【Method】In this study，a
new method was developed to directly extract the nematode DNA from the infested wood chips by using Chelex-100
combined with alkaline guanidine thiocyanate． The extracted DNA was amplified by polymerase chain reaction (PCＲ) and
loop-mediated isothermal amplification ( LAMP) ． 【Ｒesult】The Chelex-100 was used to extract the nematode DNA and
the factors， including Chelex-100 concentration， freezing and boiling time， affecting the extraction efficiency were
optimized． The result showed that the optimum Chelex-100 final concentration was 1． 5% (W /V)，the optimum thawing
time was 5 min，and the optimum boiling time was 8 min． The DNA concentration extracted by the Chelex-100 method was
significantly higher than that extracted by CTAB and Proteinase K method under the same condition． The ratios of
OD260 / 280 of the three methods was in a descending order of CTAB method ＞ Proteinase K ≥Chelex-100 method． The
第 6 期 苟大平等: 一种适于 PCＲ 和 LAMP 检测的松木中松材线虫 DNA 快速提取方法
OD260 / 280 value of extraction with Chelex-100 method was significantly lower than that with the CTAB method，but slightly
lower than，or equal to that with the Proteinase K method，however the low OD260 / 280 value did not affect the extracted
DNA used for PCＲ amplification． The electrophoresis strip of the specific PCＲ amplification of the 75 × 32 times dilution
of the nematode DNA extracted by Chelex-100 method was still clear． The results of PCＲ and LAMP indicated that the
detection of PWN using the Chelex-100-extracted-DNA was sensitive，specific，and stable． With the method the entire
infested wood samples by PWN were detected positive，however，the healthy pine samples，including Pinus thunbergii，
P． massoniana，P． tabuliformis and Pestalotiopsis microspore，were detected negative． Furthermore，the new method is
simple and rapid，with which only 20 minutes are needed without any other special requirements，and the cost was only
3. 5 yuan per sample．【Conclusion】The Chelex-100 method is a rapid and valuable method for DNA extraction from
PWN-infested wood samples，it can further improve the efficiency，sensitivity and accuracy of the PWN detection together
with PCＲ and LAMP techniques for PWN detection under field conditions．
Key words: Bursaphelenchus xylophilus; DNA extraction; Chelex-100
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)发病迅
速，传播范围广，是一种毁灭性的森林病害，被多个
国家列为重要森林植物检疫对象。松材线虫的检测
和鉴定是松材线虫检疫的重要手段。近年来，基于
PCＲ 的分子生物学技术(王明旭，2004; 陈凤毛等，
2012; 夏彦飞等，2009)的实时荧光定量 PCＲ(葛建
军等，2005; 王明旭等，2005; 陈凤毛等，2007;
Franois et al．，2007; 郭立新等，2011; Ye et al．，
2013)、环介导等温扩增技术 ( LAMP) ( Kikuchi et
al．，2009)等被越来越广泛地运用于松材线虫的检
测和鉴定。获得一定数量和质量的线虫基因组是进
行准确高效分子检测的前提条件。传统的方法是经
贝尔曼漏斗法从感染松材线虫的木片中分离出线
虫，再通过 SDS 法、CTAB 法或蛋白酶 K 法提取线虫
DNA(张奇等，2008; 王姝颖，2009; Francois et al．，
2007)，然而，这些方法较为耗时，不适于野外检测。
因此，建立一种直接从病木中高效提取线虫 DNA 的
方法极为必要。Takeuchi 等(2005; 2009)、王新荣
等(2009)、胡月清(2006)和 Kanetani 等(2011)分别
运用 CTAB 法、SDS 酚仿抽提法和蛋白酶 K 法直接
从感病木块或松褐天牛体内提取松材线虫 DNA。
这些方法虽然省去了收集线虫的步骤，但仍存在一
些问题:CTAB 法和 SDS 法需要经过反复的酚仿抽
提，步骤繁琐，并且 DNA 在转移过程中有损失并伴
有大片段破碎; 而蛋白酶 K 法虽然避免了这一问
题，却同样需要 1 h 以上的温育反应，比较耗时，或
者需要借助昂贵的试剂盒。
Chelex-100 是一种可与多价金属离子结合的螯
合型离子交换树脂，其悬液在碱性环境( pH = 8. 0 ～
11)和 100 ℃的条件下，可导致细胞膜破裂和 DNA
变性并释放出来(步嵘等，1999)。Chelex-100 还能
够结合影响下一步分析的其他外源物质，并能通过
结合金属离子而防止 DNA 降解(陈辉等，2004)，被
广泛运用于血痕 ( 周月琴等，2003; 巴华杰等，
2007; 杨电等，2008)、细菌(钱雪琴等，2008; 胡晓
红等，2008 )、真菌 (陈吉良等，2011; 兰茗清等，
2012)和放线菌(周双清等，2010)等微生物和微小
动物(Musapa et al．，2013)DNA 的提取。用 Chelex-
100 法提取线虫基因组 DNA，尤其直接从木块中提
取松材线虫 DNA 尚未见报道。本文以 Chelex-100
法提取或直接从病木中提取松材线虫 DNA，作为
rDNA-ITS 序列 PCＲ 扩增和 LAMP 扩增的模板，以
期得到特异性强、明亮清晰的 PCＲ 检测条带或肉眼
可直接观察的试验结果，旨在探索建立一种高效、快
速的提取松材线虫 DNA 的方法。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 生物材料 采集 18 个地点松材线虫感病
植株木样 (表 1)。选取当年死亡的松树，在伐倒
树干的基部、中部和树冠基部 3 个部位截取 5cm
左右厚度的圆盘放入采样袋中，带回实验室。样
品经贝尔曼漏斗于室温(25 ℃ )条件下分离 24 h，
进行显微镜下的形态鉴定和 ITS 区、18S 基因测序
鉴 定。人 工 挑 取 纯 化 后 接 种 到 盘 多 毛 孢
(Pestalotiopsis microspora) 马铃薯葡萄糖琼脂培养
基上，4 ℃冰箱保藏。选取木样树皮以内心材以外
3 ～ 5 cm 的圆环 10 g，用斧头劈成 1 ～ 2 mm 厚度的
木片，作为试验的木块。取 6 g 木块置于室温下采
用贝尔曼漏斗法分离，24 h 后，线虫悬液用线虫计
数皿进行计数，每个样品重复 3 次，取平均值。剩
余 4 g 木块用于 DNA 提取。
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林 业 科 学 51 卷
表 1 松材线虫病木样本来源
Tab． 1 The sources of the pinewood nematode disease samples
编码
Code
种名
Species
来源
Geographical origin
寄主
Original host
GD 松材线虫 B． xylophilus 安徽广德 Guangde，Anhui 马尾松 Pinus massoniana
HF 松材线虫 B． xylophilus 安徽合肥 Hefei，Anhui 黑松 P． thunbergii
CZ 松材线虫 B． xylophilus 安徽滁州 Chuzhou，Anhui 马尾松 P． massoniana
AQ 松材线虫 B． xylophilus 安徽安庆 Anqing，Anhui 马尾松 P． massoniana
YX 松材线虫 B． xylophilus 安徽安庆宜秀区 Yixiu，Anging，Anhui 马尾松 P． massoniana
YC 松材线虫 B． xylophilus 湖北宜昌 Yichang，Hubei 马尾松 P． massoniana
ES 松材线虫 B． xylophilus 湖北恩施 Enshi，Hubei 马尾松 P． massoniana
LG 松材线虫 B． xylophilus 广州萝岗 Luogang，Guangzhou 马尾松 P． massoniana
CP 松材线虫 B． xylophilus 四川宜宾 Yibin，Sichuan 马尾松 P． massoniana
LD 松材线虫 B． xylophilus 四川泸定 Luding，Sichuan 马尾松 P． massoniana
YY 松材线虫 B． xylophilus 重庆云阳 Yunyang，Chongqing 马尾松 P． massoniana
WZ 松材线虫 B． xylophilus 重庆万州 Wanzhou，Chongqing 马尾松 P． massoniana
AL 松材线虫 B． xylophilus 贵州安龙 Anlong，Guizhou 云南松 P． yunnanensis
ZS 松材线虫 B． xylophilus 浙江舟山 Zhoushan，Zhejiang 黑松 P． thunbergii
FY 松材线虫 B． xylophilus 浙江富阳 Fuyang，Zhejiang 马尾松 P． massoniana
TM 松材线虫 B． xylophilus 江苏溧阳 Liyang，Jiangsu 马尾松 P． massoniana
GY1 拟松材线虫 B． mucronatus 四川广元 Guangyuan，Sichuan 马尾松 P． massoniana
GY2 拟松材线虫 B． mucronatus 四川广元米仓山 Michangshan，Guangyuan，Sichuan 马尾松 P． massoniana
1. 1. 2 化学试剂 5% (W /V) Chelex-100; 异硫氰
酸胍 碱 性 缓冲 液: 3 mmol·L － 1 CH5N3·HSCN，
50 mmol·L － 1 Tris-HCl ( pH 8. 0 )， 20 mmol·L － 1
EDTA (pH 8. 0)，1% Triton X-100; CTAB 提取缓冲
液:2. 0% ( W /V ) CTAB，1. 4 mmol·L － 1 NaCl，100
mmol·L － 1 Tris-HCl ( pH 8. 0)，20 mmol·L － 1 EDTA
(pH 8. 0)，1% (V /V) β －巯基乙醇; ISOHAIＲ DNA
提取试剂盒，购自日本 Nippon gene。
1. 2 Chelex-100 法的初步建立
吸取 5 μL 的松材线虫悬浮液(约含线虫 50 头，
分离于安徽合肥病死马尾松)，放入 1. 5 mL 离心管
中，加 入 异 硫 氰 酸 胍 提 取 缓 冲 液 (3 mmol·L － 1
CH5N3·HSCN，50 mmol·L
－ 1 Tris-HCl ( pH 8. 0)，20
mmol·L － 1 EDTA ( pH 8. 0 )，1% Triton X-100 ) 40
μL，枪头搅拌混匀，冰上放置 10 min，沸水煮 10
min，然后加入 5% (W /V)Chelex-100 40 μL，枪头搅
拌混匀，沸水煮 10 min，吸取上清液用于 PCＲ 检测，
重复 3 次。
1. 3 Chelex-100 法的优化
1. 3. 1 Chelex-100 浓度对 DNA 提取的影响 在
1. 2 节的基础上，在其他条件不变的情况下，用终浓
度分别为 1. 0%，1. 5%，2. 0% 和 2. 5% (W /V) 的
Chelex-100 提取线虫 DNA。DNA 提取液分别进行
10，100 和 1 000 倍的梯度稀释，稀释液进行 PCＲ 检
测以确定最适的 Chelex-100 浓度。
1. 3. 2 冻融时间对 DNA 提取的影响 采用 1. 3. 1
节中筛选出的 Chelex-100 最适浓度，设置不同的冻
融时间，即 3，4，5 和 6 min(冰煮时间相同)，提取线
虫 DNA。DNA 提取液分别进行 10，100 和1 000倍
的梯度稀释，稀释液进行 PCＲ 检测以确定最佳冻融
时间。
1. 3. 3 煮沸时间对 DNA 提取的影响 采用之前确
定的 Chelex-100 最适浓度、最佳冻融时间，设置不同
的煮沸时间，即 4，6，8 和 10 min，提取线虫 DNA。
DNA 提取液分别进行 10，100 和1 000倍的梯度稀
释，稀释液进行 PCＲ 检测以确定最佳煮沸时间。
1. 4 Chelex-100 法与 CTAB 法和蛋白酶 K 法的
比较
1. 4. 1 提取方法 1 ) CTAB 法 参照 Yuko
Takeuchi 等(2005; 2009)的方法。称取含有松材线
虫的木块 50 mg，置于 2 mL 离心管中，加入 600 μL
预热的 CTAB 提取缓冲液［2. 0% ( W /V ) CTAB，
1. 4 mol·L － 1 NaCl，100 mmol· L － 1 Tris-HCl ( pH
8. 0)，20 mmol·L － 1 EDTA ( pH 8. 0 )，1% ( V /V )
β －巯基乙醇］漩涡混匀，60 ℃温育 30 min，加入等
体积的酚氯仿异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1)抽提，然后 4 ℃下
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第 6 期 苟大平等: 一种适于 PCＲ 和 LAMP 检测的松木中松材线虫 DNA 快速提取方法
14 400 r·min － 1离心 15 min，吸取上清，再加入 3 /4
体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，室温静置 20 min，4
℃下 14 400 r·min － 1 离心 15 min，倒掉上清，再用
70%的乙醇洗涤 2 次，待彻底干燥后用 1 /10 倍的
TE 溶解 DNA，每个样品重复 3 次。
2) 蛋白酶 K 法 参照日本 ISOHAIＲ DNA 提取
试剂盒(购自 Nippon gene)说明书以及 Kanetani 等
(2011)的方法:首先在 2 mL 离心管中加入 1 mL 的
DNA 提取缓冲液［100 mmol·L － 1 NaCl、10 mmol·L － 1
Tris-HCl (pH8. 0)、1 mmol·L － 1 EDTA］; 再添加 40
μL 含有蛋白酶 K 的 Lysis buffer 和 50 μL Enzyme
solution( ISOHAIＲ Nippon gene)，充分搅拌混匀; 在
离心管溶液中加入收集的 50 mg 含有松材线虫的木
片，55 ℃孵育 20 min，然后 94 ℃孵育 10 min，吸取
上清液用于 PCＲ 检测，每个样品重复 3 次。
3) Chelex-100 法 称取 50 mg 含有线虫的木
块，放入 2 mL 离心管中，加入异硫氰酸胍提取缓冲
液［3 mol·L － 1 CH5N3·HSCN，50 mmol·L
－ 1 Tris-HCl
(pH 8. 0 )，20 mmol·L － 1 EDTA ( pH 8. 0 )，1%
Triton X － 100］400 μL，枪头搅拌混匀，冰上放置 5
min，沸水煮 5 min，然后加入 5% (W /V) Chelex-100
200 μL，枪头搅拌混匀，沸水煮 8 min，吸取上清液用
于 PCＲ 检测，每个样品重复 3 次。
1. 4. 2 DNA 含量测定和统计分析 应用核酸测定
仪(紫外分光光度仪)在 260 和 280 nm 下测定 DNA
样本的 OD260、OD280吸光度值，计算所提取样本的纯
度和含量。DNA 纯度以 OD260 /OD280 值为依据;
DNA 含量(ng·μL － 1 ) = OD260 × 50 × 稀释倍数。使
用 SPSS 软件(SPSS19. 0)对数据进行统计分析。数
据采用平均值 ±标准差表示，组间差异采用方差分
析检验，并采用 t 检验进行两两比较，P ＜ 0. 05 为差
异显著。
1. 5 PCＲ 与 LAMP 验证
1. 5. 1 验证方法 1 ) PCＲ 扩增 提取的样品
DNA 通过普通 PCＲ 扩增进行验证。引物选用胡月
清等(2006)、王姝颖(2009)设计的松材线虫特异引
物，上 游 引 物 P155 ( 5-CTACGTGCTGTTGTTGA
GTTGGC-3)，下 游 引 物 P538 ( 5-TGGTGCCT
AACATTGCGCGA-3) (由北京赛百盛公司合成 )。
25 μL 的 PCＲ 反应体系为: 12. 5 μL 的 PCＲ MIX
(购自天根)，上下游引物各 1 μL，1 μL 的 DNA 模
板以及 9. 5 μL 的 ddH2O。PCＲ 反应程序为: 94 ℃
预变性 3 min; 94 ℃ 变性 1 min，53 ℃ 退火 30 s，
72 ℃延伸 45 s，35 个循环; 72 ℃再延伸 10 min。取
4 μL PCＲ 扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶中 140 V 电
泳 30 min，紫外灯下观察并拍照。
2) LAMP 扩增 采用 Chelex-100 法 (步骤见
1. 4. 1 节)提取病木块中的松材线虫 DNA，DNA 提
取液稀释 10 倍后，取 2 μL 直接用于 LAMP 反应。
引物选用 Kikuchi 等(2009)设计的 ITS 区 LAMP 引
物组，LAMP 反应方法参照荣研 loopamp DNA 扩增
试剂盒。建立一个 25 μL 的反应体系，包含 2. 5
μL10 × 扩增缓冲液，2 μL dNTP (2. 5 mmol·L － 1 )，
1 μL Taq 酶(5U·μL － 1 )，2 μL Genome DNA，引物
F3 和 B3 各 5 pmol，引物 FIP 和 BIP 各 40 pmol，引物
LoopF 20 pmol，DNA 链置换酶 1 μL 和 1 μL 的荧光
检测试剂(Eiken Chemical)。反应混合液 63 ℃水浴
60 min，最后 80 ℃下温育 5 min。LAMP 扩增产物的
检测通过反应溶液颜色变化(是否发出荧光)肉眼
观察判断。
1. 5. 2 灵敏性、特异性和稳定性验证 1) 灵敏
性验证 采用 Chelex-100 法、CTAB 法和蛋白酶 K
法提取的 DNA 样品通过梯度稀释 DNA 提取液后，
再进行 PCＲ 来分析 DNA 提取质量和灵敏性。称取
50 mg 不含松材线虫的马尾松木块，放入挑有 10 条
松材线虫的 2 mL 离心管中，涡旋搅拌混匀，采用 3
种提取方法提取线虫 DNA。提取的 DNA 经核酸测
定仪测定后稀释到相同浓度，然后进行 2 n倍梯度稀
释，分别稀释了 2，4，8，16，32 和 64 倍的 DNA 提取
液作为 PCＲ 扩增模板进行 PCＲ 检测。
2) 特异性验证 采用 Chelex-100 法提取松材
线虫和拟松材线虫的感病木块(表 1)、健康马尾松
(采自安徽合肥)、健康黑松(采自北京)、健康油松
(采自中国林业科学研究院)木块和盘多毛孢(源自
中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)
的 DNA，DNA 提取液分别进行 PCＲ 扩增验证和
LAMP 扩增，重复 3 次。
3) 稳定性验证 分别称取 50 mg 健康马尾松、
黑松和油松木块，放入挑有 10 条松材线虫的 2 mL
离心管中，涡旋搅拌混匀，采用 Chelex-100 法提取松
材线 DNA，DNA 提取液分别通过 PCＲ 检测验证和
LAMP 扩增，重复 10 次。不含松材线虫的健康马尾
松、黑松和油松木块 DNA 提取液作为阴性对照。
2 结果与分析
2. 1 Chelex-100 法的建立
采用 Chelex-100 法(1. 2 节)提取松材线虫悬液
中线虫 DNA，吸取 0. 5 μL DNA 提取液作为模板进
行 PCＲ 扩增，扩增产物进行 1%的琼脂糖凝胶电泳。
采用 CTAB 法 (同 1. 4. 1 节)提取 20 μL (约2 000
301
林 业 科 学 51 卷
头)松材线虫 DNA 进行 PCＲ 扩增，扩增结果作阳性
对照。电泳结果显示，用 Chelex-100 提取的线虫
DNA 经 PCＲ 扩增后得到单一、特异的目的条带，并
且电泳谱带清晰、均一，扩增效果稳定，而 Chelex-
100 提取的拟松材线虫(GY1)、黑松、油松、马尾松
和盘多毛孢的 DNA，特异引物 PCＲ 扩增没有条带
(图 1)，由此表明:新方法 Chelex-100 法可用于松材
线虫 DNA 的提取。
图 1 Chelex-100 法提取松材线虫
DNA 特异引物扩增结果
Fig． 1 The results of the specific PCＲ amplification of
B． xylophilus DNA extracted by
Chelex-100 method
M: DNA marker III; 1: 阴性对照 Negative control ( ddH2 O ) ;
2: CTAB法提取的松材线虫(HF) DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果
The specific PCＲ amplification of B． xylophilus(HF) DNA extracted
by CTAB method; 3 － 5: Chelex-100 法提取的松材线虫(HF)DNA
特异 引 物 PCＲ 扩 增 结 果 ( 3 个 重 复 ) The specific PCＲ
amplification of B． xylophilus (HF) DNA extracted by Chelex-100
method( n = 3) ; 6: Chelex-100 法提取拟松材线虫(GY1) DNA 特
异引 物 PCＲ 扩 增 结 果 The specific PCＲ amplification of B．
mucronatus ( GY1 ) DNA extracted by Chelex-100 method;
7: Chelex-100法提取盘多毛孢 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The
specific PCＲ amplification of P． microspora DNA extracted by
Chelex-100 method; 8 － 10: Chelex-100 法提取健康黑松、马尾松、
油松 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification
of healthy pine(P． thunbergii，P． massoniana and P． tabulaeformis)
DNA extracted by Chelex-100 method．
2. 2 Chelex-100 法的优化
2. 2. 1 Chelex-100 的含量对 DNA 提取的影响 如
图 2 所示，随着 Chelex-100 浓度的增加，DNA 提取
的质量随之提高，并且当 Chelex-100 的浓度为
1. 5%，2. 0%和 2. 5% (W /V)时，DNA 提取液稀释
10，100 和1 000倍后均可扩增出条带，并且由图可
见，当 Chelex-100 的浓度达到 1. 5% 时即可很好的
提取出线虫 DNA，提取出的 DNA 溶液稀释 10 倍和
100 倍后条带明亮清晰，在稀释1 000倍的情况下也
能扩增出较为清晰的条带，虽亮度不及浓度为
2. 5% (W /V)时的，但已能满足 PCＲ 扩增需求，此
外，从试剂耗费经济的角度考虑，选择 Chelex-100 的
最适浓度为 1. 5% (W /V)。
图 2 不同 Chelex-100 浓度下 DNA
提取液梯度稀释 PCＲ 检测结果
Fig． 2 The results of PCＲ amplification of DNA extraction
dilution under the different Chelex-100 concentration
M:BM2000 + 1. 5K; CK:阴性对照 Negative control( ddH2 O) ; A，B，
C，D: Chelex-100 浓 度 依 次 为 1%，1. 5%，2. 0% 和 2. 5% The
concentration of Chelex-100 was 1. 0%，1. 5%，2. 0% and 2. 5%，
respectively; 1，2，3:线虫 DNA 提取液依次稀释 10，100 和1 000倍
后特 异 引 物 PCＲ 扩 增 结 果 The results of the specific PCＲ
amplification of serial 10-fold dilutions(10，100，and 1 000 times) of
the nematode DNA．
2. 2. 2 冻融时间对 DNA 提取的影响 冻融时间依
次为 3，4，5 和 6 min，随着时间的增加，DNA 提取含
量相应的提高，扩增谱带清晰度增加。当时间达到
5 min 时，采用 Chelex-100 法提取的线虫 DNA 经过
10，100 和1 000倍梯度稀释后均能扩增出单一的条
带，并且稀释1 000倍的扩增条带亮度仅次于冻融 6
min 提取液的扩增条带 (图 3)，说明冻融时间为 5
min 时即可提取出高质量的线虫 DNA 作为普通
PCＲ 扩增的模板。因此，最佳冻融时间为 5 min。
图 3 不同冻融时间的 DNA 提取液
梯度稀释 PCＲ 检测结果
Fig． 3 The results of PCＲ amplification of DNA
extraction dilution in different freezing time
M:BM2000 + 1. 5K; CK:阴性对照 Negative control( ddH2 O) ; A，B，C，
D:冻融时间依次为 3，4，5 和 6 min The freezing time respectively was 3，
4，5 and 6 min; 1，2，3:线虫 DNA 提取液依次稀释 10，100 和 1 000 倍
后特异引物 PCＲ 扩增结果 The results of the specific PCＲ amplification
of serial 10-fold dilutions ( 10，100， and 1000 times ) of the nematode
DNA．
2. 2. 3 煮沸时间对 DNA 提取的影响 加入
Chelex-100 后，随着煮沸时间的增加，DNA 提取质量
相应提高，当煮沸时间达到 8 min 中时，DNA 提取液
梯度稀释(10，100 和1 000倍)后即可扩增出均一条
401
第 6 期 苟大平等: 一种适于 PCＲ 和 LAMP 检测的松木中松材线虫 DNA 快速提取方法
带，而当煮沸时间达到 10 min 时，虽然 DNA 提取液
梯度稀释(10，100 和1 000倍)后也能扩增出特异条
带，但条带亮度却反而不如冻融 8min 的(图 4)。因
此，对于 5 μL 的线虫悬液，线虫 DNA 的提取最经济
便捷的提取方法为: 5 μL的线虫悬浮液(约含线虫
50 头)中，加入异硫氰酸胍提取缓冲液 40 μL，枪头
搅拌混匀，冰上放置 5 min，沸水煮 5 min，然后加入
5% (W /V) Chelex-100 20μL(即 Chelex-100 终浓度
为 1. 5% )，枪头搅拌混匀，沸水煮沸 8 min，吸取上
清液用于 PCＲ 检测。
2. 3 Chelex-100 法、CTAB 法和蛋白酶 K 法提取
DNA 含量的比较
来源 18 个不同地区的木样(表 1)，木块里线虫
含量不同(木块含线虫量为每 10 mg 1 ～ 8 头)，因此
提取到的 DNA 含量有很大的差异，但是统计分析比
较后(表 2)发现，对于同一样品，新方法 Chelex-100
法提取的 DNA 产量显著高于传统的 CTAB 法和蛋
白酶 K 法 ( P ＜ 0. 05 )，并且 Chelex-100 法提取的
DNA 产量与 CTAB 法提取的 DNA 产量差异极显著
(P ＜ 0. 01)。而 3 种方法的 OD260 /OD280比值从大到
小依次为 CTAB 法 ＞ 蛋白酶 K 法≥Chelex-100 法，
Chelex-100 法的 OD260 /OD280显著低于 CTAB 法的，
而略低于或等同于蛋白酶 K 法，但这并不影响对提
取的 DNA 进行 PCＲ 扩增。
以 3 种方法所提取的木块中线虫 DNA 为模板，
采用松材线虫 ITS 区特异引物对 P155 /P538 进行
PCＲ 扩增，其扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，在
紫外光下均可见到清晰的 DNA 条带(图 5，6)。
图 4 不同煮沸时间的 DNA 提取液梯度
稀释 PCＲ 检测结果
Fig． 4 The results of PCＲ amplification of DNA extraction
dilution in different boiling time
M:BM2000 + 1. 5K; CK:阴性对照 Negative control( ddH2 O) ;
A，B，C，D:煮沸时间依次为 4，6，8 和 10 min The boiling time
respectively was 4，6，8 and 10 min; 1，2，3:线虫 DNA 提取液
依次稀释 10，100 和1 000倍后特异引物 PCＲ 扩增结果 The
results of the specific PCＲ amplification of serial 10-fold dilutions
(10，100，and 1 000 times) of the nematode DNA。
表 2 3 种方法提取的木块中线虫 DNA 含量和纯度①
Tab． 2 The content and purity of DNA extracted directly from the infested wood samples using three DNA extraction methods
编码 含量 Content /( ng·μL － 1 ) OD260 /OD280
Code Chelex-100 蛋白酶 K Proteinase K CTAB Chelex-100 蛋白酶 K Proteinase K CTAB
GD 700. 62 ± 46． 19a 249. 45 ± 11． 31b 76. 45 ± 7． 69c 1. 16 ± 0． 11b 1. 24 ± 0． 05b 1. 67 ± 0． 04a
HF 682. 46 ± 19． 84a 216. 32 ± 12． 82b 49. 71 ± 6． 85c 1. 10 ± 0． 01b 1. 42 ± 0． 15b 1. 97 ± 0． 42a
CZ 317. 82 ± 10． 02a 169. 71 ± 25． 24b 24. 87 ± 3． 69c 1. 30 ± 0． 14b 1. 60 ± 0． 03a 1. 75 ± 0． 08a
AQ 1 429. 32 ± 143． 38a 449. 96 ± 16． 03b 21. 15 ± 7． 44c 0. 97 ± 0． 07c 1. 66 ± 0． 04b 2. 02 ± 0． 09a
YX 1 854. 56 ± 254． 38a 582. 61 ± 38． 90b 68. 00 ± 15． 43c 1. 12 ± 0． 10b 1. 10 ± 0． 03b 1. 85 ± 0． 12a
YC 410. 32 ± 15． 75a 249. 68 ± 6． 79b 31. 04 ± 0． 18c 1. 33 ± 0． 18b 1. 26 ± 0． 01b 1. 71 ± 0． 12a
ES 421. 42 ± 39． 99a 190. 27 ± 9． 43b 28. 62 ± 2． 42c 1. 31 ± 0． 08c 1. 55 ± 0． 08b 1. 71 ± 0． 04a
LG 1 286. 65 ± 165． 81a 273. 90 ± 9． 23b 48. 52 ± 21． 02c 0. 83 ± 0． 01c 0. 99 ± 0． 06b 1. 97 ± 0． 06a
CP 669. 80 ± 25． 80a 184. 62 ± 12． 69b 51. 03 ± 7． 20c 1. 14 ± 0． 02c 1. 52 ± 0． 21b 2. 34 ± 0． 16a
LD 343. 69 ± 28． 66a 168. 03 ± 31． 95b 20. 11 ± 1． 62c 1. 19 ± 0． 19b 1. 54 ± 0． 16a 1. 77 ± 0． 10a
YY 222. 46 ± 20． 67a 37. 11 ± 5． 75b 6. 53 ± 1． 24c 1. 27 ± 0． 16b 1. 65 ± 0． 06a 1. 80 ± 0． 12a
AL 1 354. 90 ± 269． 61a 478. 85 ± 3． 83b 40. 92 ± 13． 56c 0. 91 ± 0． 05c 0. 99 ± 0． 02b 2. 02 ± 0． 02a
ZS 1 181. 56 ± 63． 57a 415. 43 ± 4． 83b 8. 51 ± 0． 95c 0. 87 ± 0． 01b 1. 54 ± 0． 06a 1. 72 ± 0． 29a
FY 439. 16 ± 52． 22a 157. 10 ± 12． 07b 15. 83 ± 4． 23c 1. 36 ± 0． 02b 1. 40 ± 0． 02b 2. 21 ± 0． 16a
①相同字母代表差异不显著(P≥0. 05)。The same letters represent no significant difference (P≥0. 05) ．
2. 4 PCＲ 与 LAMP 验证
2. 4. 1 灵敏性验证 在 50 mg 健康马尾松木样中
人工挑取混入 10 头松材线虫，分别用 Chelex-100
法、蛋白酶 K 法和 CTAB 法提取线虫 DNA，经核酸
测定仪测定 DNA 含量分别为:1 516. 96，514. 59，
20. 4 ng·μL － 1。分别将 Chelex-100 法和蛋白酶 K 法
提取的 DNA 原液稀释 75 倍和 25 倍，所得稀释液与
CTAB 法提取液分别经 2 ～ 64 倍梯度稀释后进行
501
林 业 科 学 51 卷
PCＲ 检测，均有 430 bp 的特异性条带出现(图 5)。
图 5 3 种方法提取的 DNA 梯度稀释后特异引物 PCＲ 扩增结果
Fig． 5 The results of specific PCＲ amplification of DNA extraction serial 2-fold dilution under three extraction methods
M: DNA marker III; CK:阴性对照 Negative control( ddH2 O) ; A:Chelex-100 法提取松材线虫 DNA 75 倍稀释液依次稀释 2，4，8，16，32 和 64 倍
后特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of the serial 2-fold dilutions (2，4，8，16，32 and 64) of the 75 times dilution nematode
DNA extracted by Chelex-100 method; B:蛋白酶 K 法提取松材线虫 DNA 25 倍稀释液依次稀释 2，4，8，16，32 和 64 倍后特异引物 PCＲ 扩增结
果 The specific PCＲ amplification of the serial 2-fold dilutions (2，4，8，16，32 and 64) of the 25 times dilution nematode DNA extracted by Protein
K method; C:CTAB 法提取松材线虫 DNA 依次稀释 2，4，8，16，32 和 64 倍后特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of the serial
2-fold dilutions (2，4，8，16，32 and 64) of the nematode DNA extracted by CTAB method．
由图 5 可见，Chelex-100 法提取的松材线虫
DNA 的 75 倍稀释液再稀释 32 倍后依然有清晰的
条带，64 倍时模糊，而蛋白酶 K 法提取的松材线虫
DNA 的 25 倍稀释液再稀释 32 倍时就明显变暗，而
CTAB 法提取的松材线虫 DNA 在稀释到 64 倍时仍
有较为明亮的条带。由此表明，Chelex-100 法从木
块中提取的 DNA 质量次于 CTAB 法，但略优于蛋白
酶 K 法。此外，这也说明新方法具有极好的灵敏
性，提取的 DNA 在稀释了接近5 000倍(75 × 64)时
检测结果依旧呈阳性，这远远优于传统的 CTAB 法。
2. 4. 2 特异性验证 采用 Chelex-100 法提取松材
线虫和拟松材线虫的感病木块，健康马尾松、黑松、
油松木块和盘多毛孢 DNA，对 DNA 提取液进行
PCＲ 检测验证。结果表明松材线虫感病木块均能
扩增出 400 bp 左右单一的目的条带，而拟松材线虫
感病木块、健康马尾松、黑松、油松木块和盘多毛孢
DNA 提取液均未扩增出条带 (图 6 )，由此表明
Chelex-100 法提取的木块中松材线虫 DNA 用于
PCＲ 扩增时具有良好的特异性。
采用 Chelex-100 法提取的感病木块中的松材线
虫 DNA 提取液稀释 10 倍后，用于 LAMP 反应。含有
松材线虫的病木的 LAMP 结果呈阳性(图 7A 1 － 9，
B 5 － 8)，而含有拟松材线虫的木块(图 7 B 1 － 2)、不
含有松材线虫的健康黑松木块(图 7 B 3)和盘多毛
孢(图 7 B 4) DNA 提取液稀释 10 倍后进行 LAMP
反应，结果均呈阴性。新方法 Chelex-100 法提取的
感病木中松材线虫 DNA 能够满足 LAMP 检测，且具
有良好的特异性。
2. 4. 3 稳定性验证 分别称取 50 mg 健康马尾松、
黑松和油松木块，放入挑有 10 条松材线虫的 2 mL
离心管中，涡旋搅拌混匀，采用 Chelex-100 法提取松
图 6 松材线虫 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果
Fig． 6 The results of the specific PCＲ amplification of
B． xylophilus DNA
M: DNA marker III; CK:阴性对照 Negative control( ddH2 O) ; 1 － 9:
Chelex-100 法提取 AQ，YX，HF，LG，AL，ZS，CP，FY 和 YY 木片中松
材线虫 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification
of B． xylophilus DNA extracted by Chelex-100 method directly from the
infested wood sample ( AQ，YX，HF，LG，AL，ZS，CP，FY and
YY) ; 10:Chelex-100 法提取 GY2 木片中拟松材线虫 DNA 特异引
物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of B． mucronatus
DNA extracted by Chelex-100 method directly from the infested wood
sample(GY2) ; 11 － 13:Chelex-100 法提取健康黑松、马尾松、油松
木块 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of
healthy pine ( P． thunbergii，P． massoniana and P． tabulaeformis )
DNA extracted by Chelex-100 method; 14:Chelex-100 法提取盘多毛
孢 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of
Pestalotiopsis microspora DNA extracted by Chelex-100 method．
材线虫 DNA，DNA 提取液分别用于 PCＲ 检测验证
和 LAMP 扩增。结果显示，Chelex-100 法提取线虫
木块混合物中线虫 DNA，经 PCＲ 和 LAMP 扩增均为
阳性，而不含松材线虫的健康马尾松、黑松和油松木
块 DNA 提取液经 PCＲ 和 LAMP 扩增均显示为阴性
(图 8，9)。此外，采用 Chelex-100 法提取新鲜木样
(表 1)中松材线虫 DNA 进行特异引物 PCＲ 扩增，
检出率为 100% (表 3)。因此，Chelex-100 法提取木
601
第 6 期 苟大平等: 一种适于 PCＲ 和 LAMP 检测的松木中松材线虫 DNA 快速提取方法
图 7 Chelex-100 法提取的木块中线虫 DNA 10 倍稀释液 ITS 区 LAMP 扩增结果
Fig． 7 The results of loop-mediated isothermal amplification of the 10 time dilution of the nematode DNA
extracted directly from infested wood sample by Chelex-100 method
A:1 － 9 依次为 Chelex-100 法提取 AQ，YX，HF，LG，AL，ZS，CP，FY 和 YY 木片中松材线虫 DNA 10 倍稀释液 ITS 区 LAMP 扩增结果;CK( － )
(CK 阴性):DNA 模板为 ddH2 O; CK( + ) (CK 阳性):DNA 模板为连有 ITS 靶序列的质粒。The loop-mediated isothermal amplification of the 10
times dilution of the B． xylophilus DNA extracted by Chelex-100 method directly from infested wood sample(AQ，YX，HF，LG，AL，ZS，CP，FY and
YY) ;CK( － ) (Negative control) : The DNA sample is ddH2 O;CK( + ) ( Positive control) : The DNA sample is plasmid DNA containing the target
sequence．
B:1 － 2 依次为 Chelex-100 法提取 GY1 和 GY2 木片中拟松材线虫 DNA 10 倍稀释液 ITS 区 LAMP 扩增结果 The loop-mediated isothermal
amplification of the 10 times dilution of the B． mucronatus DNA extracted by Chelex-100 method directly from infected wood sample(GY1 and GY2) ;
3 － 4:依次为 Chelex-100 法提取健康黑松、盘多毛孢 DNA 10 倍稀释液 ITS 区 LAMP 扩增结果 The loop-mediated isothermal amplification of the
10 times dilution of the healthy P． thunbergii and Pestalotiopsis microspora DNA extracted by Chelex-100 method; 5 － 8:依次为 Chelex-100 法提取 TM，
WZ，YC 和 LD 木片中松材线虫 DNA 10 倍稀释液 ITS 区 LAMP 扩增结果 The loop-mediated isothermal amplification of the 10 times dilution of the
B． xylophilus DNA extracted by Chelex-100 method directly from infested wood samples (TM，WZ，YC and LD) ．
块中线虫 DNA 具有良好的稳定性。
表 3 Chelex-100 法提取木块中松材线虫
DNA PCＲ 检测结果
Tab． 3 Detection of B． xylophilus
DNA extracted from wood samples by Chelex-100
method using PCＲ
样本
Sample
name
每 100 mg 木块线虫数
Number of nematodes
per 100 mg wood
检出率
Detection
rate (% )
GD 78 100
HF 75 100
CZ 27 100
AQ 82 100
YX 65 100
YC 16 100
ES 18 100
LG 62 100
CP 30 100
WC 15 100
YY 10 100
AL 80 100
ZS 76 100
FY 50 100
GY1 60 0
GY2 52 0
3 讨论
Chelex-100 是一种由交联聚苯乙烯凝胶和亚胺
基乙酰乙酸等组成的螯合型离子交换树脂，其成对
的亚氨基二乙酸盐离子可作为螯合集团，与多价金
属离子结合，阻止金属离子在高温和低离子强度条
件下作为催化剂使 DNA 降解。Chelex-100 颗粒可
通过离心去除或静置沉淀，使与 Chelex-100 结合的
物质与 DNA 分离，能防止结合到 Chelex-100 中的抑
制剂或杂质带到 PCＲ 反应中而影响下游试验的
DNA 分析。异硫氰酸胍是一种强蛋白变性剂，能破
坏蛋白质二级结构，降解核膜蛋白，并促使核蛋白与
核酸分离，此外，它还能抑制核酸酶的活性，减少提
取过程中核酸的降解(罗心静，2003)，被广泛运用
于 ＲNA 的提取分离(付月君，2003; 李想等，2004)
和哺乳动物细胞中核酸的分离(Pert et al．，2000)。
本文采用异硫氰酸胍 ( pH 8. 0)碱性蛋白质变
性缓冲液结合 Chelex-100，通过冻煮法建立了一个
全新的从木块中快速提取松材线虫 DNA 的方法。
首先，通过异硫氰酸胍的强变性作用，结合冻煮快速
的冷热变化，使得线虫细胞破裂，释放出 DNA。其
次，通过加入 Chelex-100 后再次煮沸，进一步使
701
林 业 科 学 51 卷
图 8 Chelex-100 法提取木块中松材线虫 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果
Fig． 8 The results of the specific PCＲ amplification of B． xylophilus DNA extracted from wood sample by Chelex-100 method
M: DNA marker III; CK( － ) :阴性对照 Negative control( ddH2 O) ; CK( + ) :Chelex-100 法提取线虫悬液(HF)中线虫 DNA 特异引物 PCＲ 扩
增结果 The specific PCＲ amplification of B． xylophilus(HF) DNA extracted by Chelex-100 method; 1 － 5:Chelex-100 法提取健康木屑中混入的松
材线虫 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of B． xylophilus DNA extracted from wood tissues by Chelex-100 method; 6:
Chelex-100 法提取健康木屑 DNA 特异引物 PCＲ 扩增结果 The specific PCＲ amplification of the healthy pine wood DNA extracted by Chelex-100
method; A，B，C:黑松 P． thunbergii，马尾松 P． massoniana，油松 P． tabulaeformis．
图 9 Chelex-100 法提取木块中松材线虫 DNA ITS 区 LAMP 扩增结果
Fig． 9 The results of loop-mediated isothermal amplification of B． xylophilus DNA extracted from wood sample by Chelex-100 method
1 － 5:Chelex-100 法提取健康木块中混入的松材线虫 DNA ITS 区 LAMP 扩增结果 The loop-mediated isothermal amplification of the B． xylophilus
DNA extracted from wood sample by Chelex-100 method; 6:Chelex-100 法提取健康木块 DNA ITS 区 LAMP 扩增结果 The loop-mediated isothermal
amplification of the healthy pine wood DNA extracted by Chelex-100 method; CK( + ) :含有 ITS 靶序列的质粒 LAMP 扩增结果 The loop-mediated
isothermal amplification of plasmids containing the target sequence ITS; CK( － ) :阴性对照 Negative control( ddH2 O) ; A，B，C:黑松 P． thunbergii，马
尾松 P． massoniana，油松 P． tabulaeformis．
DNA 与蛋白质分离释放，同时，纯化提取到 DNA。
最后，由 Chelex-100 特性决定，杂质随 Chelex-100 沉
淀去除，从而得到较好质量的 DNA 模板，完成 DNA
的提取。
新建立的 Chelex-100 DNA 提取法与传统的
CTAB 法和蛋白酶 K 法比较，具有以下优点:1) 提
取产量高、质量好。新方法通过胍盐的化学破壁结
合冻煮机械破壁充分释放了细胞中的 DNA，再经 2
次蛋白变性纯化，使得相同条件下提取的 DNA 含量
能够达到 1 516. 96 ng·μL － 1，远远大于常规的 CTAB
法和蛋白酶 K 法提取的 20. 40，514. 59 ng·μL － 1;同
时 DNA 质量与 CTAB 法无显著差异，相同含量下，
稀释 32 倍后仍能扩增出清晰均一的条带 (图 5)。
2) 步骤简单，耗时少。Chelex-100 法将线虫 DNA
的提取和纯化同时进行，免去了反复的酚仿抽提，整
个提取仅需 3 个步骤即可完成，大大减少了提取步
骤和提取耗时。3) 仪器设备简单，成本低。整个
DNA 提取过程只需要水浴锅、移液器等最基本的试
验设备，平均一个样品的 DNA 提取耗费 ( Chelex-
100、异硫氰酸胍及其余试剂 1. 5 元 + 离心管、枪头
耗材及水电费 2. 0 元)约为 3. 5 元。4) 稳定性强，
特异性高。多个地区的样品多次重复试验检验证
明，新方法提取的 DNA 用于 PCＲ 检测和 LAMP 检
测，检测结果的灵敏性高(图 5)，特异性强(图 6，7)
801
第 6 期 苟大平等: 一种适于 PCＲ 和 LAMP 检测的松木中松材线虫 DNA 快速提取方法
且结果稳定(图 8，9; 表 3)。
DNA 提取是许多分子检测技术的第一步，许多
试验失败的原因可追溯到该步骤，该阶段提取的
DNA 产量不足、DNA 质量差、干扰物质多或 DNA 部
分降解等可直接影响检测的结果 ( Yaxsier et al．，
2011)。因此，本文探索建立了一种简便高效的提
取松材线虫悬液和木块中线虫 DNA 的方法即
Chelex-100 法，运用该方法提取的线虫 DNA 用于
PCＲ 和 LAMP 等检测时灵敏度高，特异性强，结果
稳定可靠，充分满足普通 PCＲ 和 LAMP 等分子检测
需求。此外，本方法所需实验设备简单，试剂药品的
保藏使用对温度也无特殊要求，无需操作人员具有
特别的专业知识，极适合于现场检测以及基层检测
推广。
参 考 文 献
巴华杰，刘冰泉，马 骏，等 ． 2007． Chelex-100 法提取滤纸血痕
DNA 影响因素的比较 ． 法医学杂志，23(5) : 347 － 348．
(Ba H J，Liu B Q，Ma J，et al． 2007． Comparative research of the
influence factors of DNA extraction of bloodstain on the filter paper
with Chelex-100 method． Journal of Forensic Medicine，23 ( 5 ) :
347 － 348．［in Chinese］)
步 嵘，王耀平，叶元康 ． 1999． 以 Chelex 100 为介质抽提 DNA． 中
华病理学杂志，28(5) : 379 － 380．
(Bu Ｒ，Wang Y P，Ye Y K． 1999． Extraction of DNA by Chelex-100
method． Chinese Journal of Pathology，28 ( 5 ) : 379 － 380． ［in
Chinese］)
陈凤毛，叶建仁，吴小芹 ． 2007． 松材线虫实时 PCＲ 检测技术 ． 南
京林业大学学报:自然科学版，31(4) : 121 － 124．
(Chen F M， Ye J Ｒ， Wu X Q． 2007． Detection technique of
Bursaphelenchus xylophilus using real time PCＲ． Journal of Nanjing
Forestry University:Natural Sciences Edition，31 (4 ) : 121 － 124．
［in Chinese］)
陈凤毛，叶建仁，吴小芹，等 ． 2012． 松材线虫 SCAＲ 标记与检测技
术 ． 林业科学，48(3) : 88 － 94．
(Chen F M，Ye J Ｒ，Wu X Q， et al． 2012． SCAＲ Marker and
Detection Technique of Bursaphelenchus xylophilus． Scientia Silvae
Sinicae，48(3) : 88 － 94． ［in Chinese］)
陈 辉，刘永波，谢庆瑞，等 ． 2004． 有机酚法和 Chelex 100 法提取
不同组织微量 DNA 效果比较 ． 郑州大学学报:医学版，39(6) :
988 － 991．
(Chen H，Liu Y B，Xie Q Ｒ，et al． 2004． Comparison the effect of
phenol / chloro form method and Chelex-100 method on micro DNA
extraction using different tissues． Journal of Zhengzhou University:
Medical Sciences，39(6) : 988 － 991． ［in Chinese］)
陈吉良，黄小龙，吴安迪，等 ． 2011． 一种快速高效提取病原真菌
DNA 作为 PCＲ 模板的方法 ． 菌物学报，30(1) : 147 － 149．
(Chen J L，Hang X L，Wu A D，et al． 2011． An efficient extraction
method of pathogenic fungus DNA for PCＲ． Mycosystema，30(1) :
147 － 149． ［in Chinese］)
付月君，张志云，柴宝峰 ． 2003． 从棉铃虫体中提取总 ＲNA 的一种
有效方法 ． 生物技术通报，(5) : 40 － 42．
( Fu Y J，Zhang Z Y，Chai B F． 2003． An efficient method of total ＲNA
isolation from Helicoverpa armigera． Biotechnology Bulletin，(5 ) :
40 － 42． ［in Chinese］)
葛建军，曹爱新，刘先宝，等 ． 2005． 应用 TaqMan-MGB 探针进行松
材线虫的实时荧光定量检测技术研究 ． 植物病理学报，35(6) :
52 － 58．
(Ge J J， Cao A X， Liu X B， et al． 2005． Quantity assay of
Bursaphelenchus xylophilus with TaqMan-MGB probe． Acta
Phytopathologica Sinica，35(6) : 52 － 58． ［in Chinese］)
郭立新，段维军，顾建锋 ． 2011． 木质包装中松材线虫的实时荧光
PCＲ 检测 ． 植物保护，37(5) : 129 － 134．
(Guo L X，Duan W J，Gu J F． 2011． Detection of Bursaphelenchus
xylophilus from woods packaging using real-time PCＲ． Plant
Protection，37(5) : 129 － 134． ［in Chinese］)
胡月清 ． 2006． 枯萎松树线虫种类鉴定及松材线虫检测技术 ． 广州:
华南农业大学硕士学位论文 ．
(Hu Y Q． 2006． Investigation and identification of nematodes in dead or
dying Pinus massoniana and the detection technique of
Bursaphelenchus xylophilus． Guangzhou:MS thesis of South China
Agricultural University． ［in Chinese］)
胡晓红，彭惠民，刘 昕，等 ． 2008． PCＲ 及 Ｒeal-time PCＲ 评价细
菌 DNA 提取方法 ． 重庆医科大学学报，33(2) : 155 － 159．
(Hu X H，Peng H M，Liu X，et al． 2008． Methods of DNA extraction
from bacteria for PCＲ and Ｒeal-time PCＲ． Journal of Chongqing
Medical University，33(2) : 155 － 159． ［in Chinese］)
兰茗清，刘 林，杨 静，等 ． 2012． 直接、快速地从罹病小麦叶片
中提取条锈菌基因组 DNA 的方法 ． 云南农业大学学报，27
(6) : 798 － 801，813．
(Lan M Q，Liu L，Yang J，et al． 2012． Direct DNA extraction method
of Puccinia striiformis f． sp． tritici from infected wheat leaves．
Journal of Yunnan Agricultural University，27(6) : 798 － 801，813．
［in Chinese］)
李 想，杨奇志，张飞雄 ． 2004． 一种小量提取植物总 ＲNA 的有效
方法 ． 生物技术通报，(2) : 49 － 51．
(Li X，Yang Q Z，Zhang F X． 2004． An effective method for plant total
ＲNA isolation． Biotechnology Bulletin， ( 2 ) : 49 － 51． ［in
Chinese］)
罗心静 ． 2003． 全血基因组 DNA 的快速提取及其应用 ． 长沙:中南
大学硕士学位论文 ．
(Luo X J． 2003． Ｒesearch on application of rapid extraction human
genomic DNA from whole blood． Changsha: MS thesis of Central
South University． ［in Chinese］)
钱雪琴，张 军，沈 芳 ． 2008． Chelex-100 法和碱性裂解法提取细
菌 DNA 的比较 ． 中国卫生检验杂志，18(8) : 1565 － 1566．
(Qian X Q， Zhang J， Shen F． 2008． Comparison of methods for
extraction of DNA by Chelex-100 and alkali split． Chinses Journal of
Health Laboratory Technology， 18 ( 8 ) : 1565 － 1566． ［ in
Chinese］)
王明旭 ． 2004． 松材线虫分子生物学检测技术研究进展 ． 湖南林业
科技，31(2) : 1 － 3．
(Wang M X． 2004． Study progress of identification techniques of
901
林 业 科 学 51 卷
molecular biology on pine wood nematode， Bursaphelenchus
xylophilus． Hunan Forestry Science ＆ Technology，31 (2) : 1 － 3．
［in Chinese］)
王明旭，朱水芳，罗 宽 ． 2005． 松材线虫 rDNA-ITS2 的 TaqMan 探
针实时荧光 PCＲ 检测 ． 林业科学，41(2) : 82 － 85．
(Wang M X，Zu S F，Luo K． 2005． Studies on real-time fluorescent
PCＲ with TaqMan probe for rDNA-ITS2 of Pine Wood Nematode
(Bursaphelenchus xylophilus ) ． Scientia Silvae Sinicae，41 ( 2 ) :
82 － 85． ［in Chinese］)
王 永，张 莉，兰青阔，等 ． 2008． Chelex-100 快速提取用于转基
因检测 DNA 模板的研究 ． 生物技术通报，(2) : 143 － 146．
(Wang Y，Zhang L，Lan Q K，et al． 2008． Study on rapid method for
extracting DNA from transgenic crops by Chelex-100． Biotechnology
Bulletin，(2) : 143 － 146． ［in Chinese］)
王姝颖 ． 2009． 几种松树寄生线虫的致病性及其 ITS 序列分析 ． 南
京:南京林业大学硕士学位论文 ．
(Wang S Y． 2009． Study on Pathogenicity of several pine parasitic
nematodes and their ITS sequence analysis． Nanjing:MS thesis of
Nanjing Forestry University． ［in Chinese］)
王新荣，朱孝伟，胡月清，等 ． 2009． 松墨天牛携带的松材线虫 PCＲ
检测技术 ． 林业科学，45(7) : 70 － 75．
(Wang X Ｒ，Zhu X W，Hu Y Q，et al． 2009． A PCＲ-based method for
detecting Bursaphelenchus xylophilus from Monochamus alternatus．
Scientia Silvae Sinicae，45(7) : 70 － 75． ［in English］)
夏彦飞，李红梅，王 暄，等 ． 2009． 病木样本松材线虫 DNA 检测
方法研究 ． 江苏农业科学，(1) : 35 － 38．
(Xia Y F，Li H M，Wang X，et al． 2009． PCＲ method for detection of
Bursaphelenchus xylophilus in disease pine wood samples． Jiangsu
Agricultural Sciences，(1) : 35 － 38． ［in Chinese］)
杨 电，刘 超，李 越，等 ． 2008． Chelex-100 提取生物检材 DNA
实时 PCＲ 定量研究 ． 中国法医学杂志，23(1) : 29 － 31．
(Yang D，Liu C，Li Y，et al． 2008． Ｒeal time PCＲ quantificational
study of DNA extracted by Chelex-100 method． Chinese Journal of
Forensic Medicine，23(1) : 29 － 31． ［in Chinese］)
张 奇，孙 丹，张楚菁，等 ． 2008． 松材线虫鉴定方法的研究与比
较 ． 南开大学学报:自然科学版，41(5) : 43 － 49．
( Zhang Q， Sun D， Zhang C J， et al． Comparative studies on
identification methods of Bursaphelenchu xylophilus． Acta
Scientiarum Naturalium University Nankaiensis: Natural Sciences
Edition，41(5) : 43 － 49． ［in Chinese］)
周月琴，朱 伟，刘志萍，等 ． 2003． 用 Chelex-100 快速提取微量血
痕中的 DNA． 复旦学报:医学版，30(4) : 379 － 380．
( Zhou Y Q，Zhu W，Liu Z P，et al． 2003． A quick method of extraction
of DNA by Chelex-100 from trace bloodstains． Fudan University
Journal of Medical Sciences，30(4) : 379 － 380． ［in Chinese］)
周双清，黄小龙，黄东益，等 ． 2010． Chelex-100 快速提取放线菌
DNA 作为 PCＲ 扩增模板 ． 生物技术通报，2: 123．
(Zhou S Q，Huang X L，Huang D Y，et al． 2010． A rapid method for
extracting DNA from actinomycetes by Chelex-100． Biotechnology
Bulletin，2: 123． ［in Chinese］)
Francois C，Castagnone C，Boonham N，et al． 2007． Satellite DNA as a
target for TaqMan real-time PCＲ detection of the pinewood
nematode，Bursaphelenchus xylophilus． Molecular Plant Pathology，
8(6) : 803 － 809．
Kanetani S， Kikuchi T， Akiba M， et al． 2011． Detection of
Bursaphelenchus xylophilus from old discs of dead Pinus armandii
var． amamiana trees using a new detection kit． Forest Pathology，
41(5) : 387 － 391．
Kikuchi T，Aikawa T，Oeda Y， et al． 2009． A rapid and precise
diagnostic method for detecting the pinewood nematode
Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal
amplification． Phytopatholog，99(12) : 1365 － 1369．
Musapa M，Kumwenda T，Mkulama M，et al． 2013． A simple chelex
protocol for DNA extraction from Anopheles spp． Journal of
Visualized Experiments，9(71) :3791 － 3281．
Pert B，Sekizawa A，Samura O，et al． 2000． Detection of male and
female fetal in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase
chain reaction amplification of short tandem repeat． Human
Genetics，106(1) : 45 － 49．
Takeuchi Y，Kanzaki N，Futai K． 2005． A nested PCＲ-based method
for detecting the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus，
from pine wood． Nematology，7(5) : 775 － 782．
Takeuchi Y，Futai K． 2009． Diagnosis and quantication of the pine
wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus ( Steiner ＆ Buhner)，in
wood of Pinus thunbergii with real-time PCＲ． Nematological
Ｒesearch，39(1) : 9 － 16．
Walsh P S，Metzger D A，Higuchi Ｒ． 1991． Chelex 100 as a medium for
simple extraction of DNA for PCＲ-based typing from forensic
material． Biotechniques，10(4) : 506 － 513．
Yaxsier D A，Virginia C，Ledy X L，et al． 2011． Comparison of three
methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues．
Biotecnología Aplicada，28(1) : 44 － 47．
Ye W M，Giblin-Davis Ｒ M． 2013． Molecular characterization and
development of real-time PCＲ assay for pine-wood nematode
Bursaphelenchus xylophilus ( Nematoda: Parasitaphelenchidae ) ．
Plos One，8(11) : e78804. 1 － 14．
(责任编辑 朱乾坤)
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