全 文 ：第 49 卷 第 11 期
2 0 1 3 年 11 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 11
Nov．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20131123
收稿日期: 2013 － 04 － 03; 修回日期: 2013 － 06 － 29。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31070603) ; 中南林业科技大学青年基金重点项目(QJ2011008A)。
* 谭晓风为通讯作者。
油茶果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶基因(CoFBA4)的分子特征与表达分析*
曾艳玲 谭晓风 蒋 瑶 刘 敏 王建勇 周俊琴
(中南林业科技大学 森林培养与保护教育部重点实验室 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 长沙 410004)
关键词: 油茶; 果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶; 基因克隆; 基因表达; 亚细胞定位
中图分类号: S718． 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)11 － 0164 － 07
Molecular Characterization and Expression Analysis of
Fructose-1，6-Diphosphate Aldolase Gene (CoFBA4) from Camellia oleifera
Zeng Yanling Tan Xiaofeng Jiang Yao Liu Min Wang Jianyong Zhou Junqin
(Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Ministry of Education Key Laboratory of Non-Wood
Forest Products of State Forestry Administration Central South University of Forestry and Technology Changsha 410004)
Abstract: Fructose-1，6-diphosphate aldolase (FBA) in plants is not only one of the key regulatory enzyme in glycolysis
pathway but also provide substrate source for two key components of oil synthesis． In this paper，a new FBA full-length
cDNA of Camellia oleifera seed was isolated and cloned by RACE technology，and was named CoFBA4 ( GenBank
number: JX914590) ． CoFBA4 had an open reading frame with 1 185 base pairs encoding 394 amino acids． Sequence
analysis showed that CoFBA4 had nearest genetic distance with FBA of Arabidopsis thaliana，and belonged to subfamily A．
CoFBA4 contained glycosylation and fructose-1，6-diphosphate aldolase activity site，but had no transmembrane domain．
CoFBA4 belonged to hydrophilic protein． Subcellular localization analysis showed that CoFBA4 acted out of cell． There
was a positive relationship between expression abundance of CoFBA4 gene and oil yield from different superior clones
during the same maturity period．
Key words: Camellia oleifera; fructose-1，6-diphosphate aldolase; gene cloning; gene expression; subcellular
localization
果糖 － 1，6 － 二磷酸醛缩酶 ( fructose-1，6-
diphosphate aldolase，FBA，EC4． 1． 2． 13)，简称醛缩
酶，是糖酵解代谢途径中第 4 步关键酶，催化果糖 －
1，6 －二磷酸( Fru-1，6-BP)可逆地裂解为磷酸二羟
丙酮(DHAP)和 3 － 磷酸甘油醛 ( G-3-P) ( Rutter，
1964)。其中，DHAP 经甘油磷酸脱氢酶的催化，还
原生成 3 － 磷酸甘油，然后在脂酰转移酶的作用下
生成磷脂酸，再经磷脂酸磷酸酶水解，形成油脂合成
必需的酯化甘油骨架(Vigeolas et al．，2007); G-3-P
则经过多步反应最终形成丙酮酸，产生乙酰辅酶 A，
经乙酰辅酶 A 羧化酶作用形成脂肪酸合成的底物
丙二酸单酰辅酶 A，经过一系列聚合反应形成油脂
合成的另一必需元素脂肪酸(Thelen et al．，2002)。
油茶(Camellia oleifera)是我国大力推广的优良
食用油料树种，但产油率低是制约油茶产业快速发
展的主要原因。为了从根本上提高油茶产油率，近
年来关于油茶油脂合成代谢途径调控基因的研究较
多(谭晓风等，2008a; 2008b; 张党权等，2008)，但
是大部分都集中在脂肪酸方面，对于调控甘油三磷
酸的基因研究甚少。油茶果糖 － 1，6 － 二磷酸醛缩
酶不仅影响脂肪酸的合成，而且为油脂骨架的构建
提供原料。因此，本文根据本实验室构建的油茶种
仁转录组数字化文库分析，从油茶种仁中分离克隆
了 CoFBA4 的全长 cDNA，采用生物信息学方法对其
进行了较为系统的分析，并在此基础上开展了亚细
胞定位研究及表达差异检测。
1 材料与方法
1. 1 材料 油茶优良品种‘华硕’(‘HS’) (谭晓风
等，2011)采自湖南省长沙市望城县东城镇中南林
第 11 期 曾艳玲等: 油茶果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶基因(CoFBA4)的分子特征与表达分析
业科技大学油茶基地，‘华鑫’(‘HX’)、‘华金’
(‘HJ’)、‘衡 东 65’ (‘HD65’)、‘衡 东 17’
(‘HD17’)、‘茶陵 78’(‘CL78’)、‘茶陵二仙 268’
(‘CLEX268’)、‘茶陵二仙 343’(‘CLEX343’)等
品种采自株洲马家河油茶基地，采样后迅速存于
－ 80 ℃ 超 低 温 冰 箱 备 用。本 生 烟 ( Nicotiana
benthamiana)、载体 pEGAD 和农杆菌( Agrobacterium
tumefaciens)菌株 GV3103 为湖南大学生物学院生物
能源与材料研究中心惠赠，大肠杆菌 ( Escherichia
coli)菌株 DH5 为本实验室保藏。
1. 2 酶与试剂 TransStartTM FastPfu DNA Polymerase
和 pEASY-Blunt Simple Cloning Kit 购自北京全式金
生物技术有限公司，2 × Taq PCR MasterMix、质粒提
取试剂盒和 DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科
技(北京)有限公司，RNA 提取和反转录试剂盒购自
Invitrogen 公司，QuantiFast SYBR Green PCR Kit 购
自 QIAGEN 公司。
1. 3 方法 1) 总 RNA 提取与 cDNA 合成 取油
茶近成熟种仁，根据 RNA 提取和反转录试剂盒说明
书提供的方法提取总 RNA，电泳检测之后，逆转录
成 cDNA 第 1 链，用 RNaseH 消化 cDNA 产物。
2) 全长 cDNA 克隆 根据本实验室构建的‘华
硕’油茶转录组数据库得到的 CoFBA4 基因序列设
计特异引物，分别为 CoFBA4F: GTCCTCCTCCTGC
CGATTCGCCACT; CoFBA4R: AATCGGCAGGAGGA
GGACGATCCAG，由北京华大生物技术有限公司合
成。PCR 反应体系(50 μL)为 5’× Trans Start Fast
Pfu Buffer (Mg2 + plus) 10. 0 μL，2. 5 mmol·L － 1
dNTPs 5. 0 μL，cDNA 1. 0 μL，Trans Start Fast Pfu
DNA Polymerase 1. 0 μL，CoFBA4F(10 μmol·L － 1 )
1 μL，CoFBA4R(10 μmol·L － 1 ) 1 μL，超纯水 31. 0
μL。PCR 扩增条件为 95 ℃ 预变性 5 min; 95 ℃ 变
性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循
环; 72 ℃延伸 8 min; 4 ℃保温。采用 1. 2%的琼脂
糖凝胶电泳，根据试剂盒说明进行回收连接，转化大
肠杆菌 DH 5 菌株，抗生素筛选后提取阳性克隆质
粒，委托上海博尚生物技术有限公司测序。
3) 序列生物信息学分析 利用 NCBI 的
BLAST 功能 ( http: ∥ www． ncbi． nlm． nih． gov /
BLAST)搜索同源的核苷酸序列及氨基酸序列; 利
用 MEGA 4. 0 ( http:∥ www． bio-soft． net ) 程序的
UPGMA 算法构建 FBA 蛋白的系统进化树; 利用软
件 AnthePro 5. 0(http:∥www． bio-soft． net)进行蛋白
跨膜结构预测，http:∥cello． life． nctu． edu． tw 在线进
行亚细胞定位; http:∥ expasy． org / tools / protscale．
html 在 线 分 析 蛋 白 亲 疏 水 性; https: ∥ www．
predictprotein． org 在线分析蛋白二级结构。
4) 不同无性系特异表达与出油率检测 取不
同无性系油茶种仁提取 RNA，逆转录为 cDNA，采用
实时荧光 PCR 技术确定 CoFBA4 基因的相对表达
量，每样做 3 个平行重复检测。PCR 引物分别为
qCoFBA4F: GAGATTCTTCTTGATGGGGAT; qCoFB
A4R: CATAGTGAGCGTGTATTTGGC。PCR 反应体
系为 2 × QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix
12. 5 μL，qCoFBA4F ( 10 μmol · L － 1 ) 0. 5 μL，
qCoFBA4R(10 μmol·L － 1)0. 5 μL，cDNA 1. 0 μL，超
纯水9. 5 μL。PCR 扩增条件为 95 ℃预变性 5 min;
95 ℃变性 10 s，55 ℃退火 30 s，共 40 个循环。油脂
提取采用索氏提取法 (谢鹏等，2010)，出油率 =
(提取油茶种仁的油脂质量 /油茶种仁干粉质量) ×
100%。利用软件 SPSS Statistics 17. 0( http:∥www．
stathome． cn)进行统计学分析。
5) 表达载体构建 根据载体 pEGAD 多克隆位
点设计 5端添加 EcoRⅠ酶切位点的上游引物
CoFBA4ZF: 5-CCGGAATTCATGGCGTGTTCGAG TT-
3; 5 端 添 加 Sam Ⅰ 酶 切 位 点 的 下 游 引 物
CoFBA4ZR: 5-TCCCCCGGGTTAGTAGGTATA GCC-
3。以阳性质粒为模板 PCR 扩增，回收连接至
pEASY-Blunt 载体上，经测序正确后采用EcoRⅠ和
SamⅠ双酶切连接至载体 pEGAD 多克隆位点，构建
包含 CoFBA4 和 eGFP 融合植物表达载体。
6) 亚细胞定位观察 将融合植物载体转化农
杆菌，挑取阳性克隆单菌落接种于 3 mL 含有利福平
(Rif，50 μg·mL － 1 ) 和卡那霉素 ( Kan，100 μg·
mL － 1)的 LB 液体培养基中，28 ℃，180 r·min － 1培
养 16 ～ 24 h。取 1 mL 活化后菌液于 50 mL 同样的
LB 培养基中，28 ℃，200 r· min － 1培养至 OD600为
0. 8 ～ 1. 0。3 000 r·min － 1，离心 20 min，收集菌体
细胞，用终浓度为 10 mmol·L － 1 MgCl2、10 mmol·L
－ 1
MES(调节 pH 至 5. 7)、200 μmol·L － 1乙酰丁香酮的
无菌水溶液重悬至 OD600为 1. 0。室温放置 3 h 后，
用去掉针头的无菌 1 mL 针筒浸润生长 1 个月左右
烟草植株中部完全伸长的 3 个叶片。接种后的烟草
植株置于 28 ℃、光 /暗周期(16 h /8 h)培养 36 h，将
浸润部位剪成 0. 5 ～ 1. 0 cm2小块，叶背面朝上，在激
光共聚焦显微镜下观察 eGFP 的荧光信号，分析
CoFBA4 蛋白的亚细胞定位。同时，采用基因枪法
将重组质粒转化洋葱( Allium cepa)表皮细胞，观察
eGFP 的荧光信号(Hiei et al．，1994) 。
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林 业 科 学 49 卷
2 结果与分析
2. 1 CoFBA4 基因全长 cDNA 克隆 根据油茶种子
转录组数据设计特异引物，结合 RACE 技术，获得
1 643 bp左右的目的片段，测序结果表明，其中包含
193 bp的 5’端非编码区、265 bp 的 3’非编码区和1 个
1 185 bp的完整开放阅读框，编码 394 个氨基酸，分子
质量为 42 740. 4 Da，等电点理论值为 7. 55，即生理中
性下该蛋白为碱性。带负电荷残基(Asp + Glu)数为
40，带正电荷残 基 ( Arg + Lys ) 数 41，分子 式为
C1884H2988N524O582 S14。估算的半寿期( half-life)分别
为: 30 h(哺乳动物网状细胞，体外)、＞ 20 h (酵母，
体内)、＞ 10 h(大肠杆菌，体内); 稳定指数( II)为
42. 28，属于不稳定蛋白。含有果糖 － 1，6 －二磷酸醛
缩酶中的底物特异结合位点: R91，K181，K263 (图 1)。
将该油茶果糖 － 1，6 － 二磷酸醛缩酶基因命名为
CoFBA4，GenBank 登录号为 JX914590。
图 1 CoFBA4 基因编码区核酸序列及推导氨基酸序列
Fig． 1 Nucleotide and predicted amino acid sequence of CoFBA4
方框区为底物特异结合位点，下划线部分为果糖二磷酸醛缩酶活性位点。
Specificity binding sites in box，fructose-1，6-diphosphate aldolase activity site with underline．
2． 2 CoFBA4 系统进化树分析 自然界中存在 2
种机制的果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶: Ⅰ型和Ⅱ型。
高等真核生物中主要存在的是Ⅰ型果糖 － 1，6 － 二
磷 酸 醛 缩 酶，特 别 是 动 物 和 高 等 植 物
(Schnarrenberger et al．，1990 )。根据进化树结果
(图 2)，来源不同的 20 条 FBA 蛋白家族可分为 A，
B 2 个亚族。A 亚族支系庞大，既包含藻类也含有
草本和林木类 FBA，一方面说明该亚族分化较早，
另一方面本文所选 2 种藻类［盐藻 ( Dunaliella
salina)和衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)］均属于
A 亚族原始分支，说明藻类 FBA 进化较慢，且 A 亚
族植物 FBA 可能较 B 亚族的植物 FBA 构型或酶活
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第 11 期 曾艳玲等: 油茶果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶基因(CoFBA4)的分子特征与表达分析
性等方面更接近Ⅱ型醛缩酶; B 亚族较 A 亚族分化
晚些，且主要包含植物类 FBA，说明该分支可能均
为Ⅰ型醛缩酶，与 A 亚族醛缩酶行使的功能有较大
差异。CoFBA4 归为 A 亚族，与拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana)遗传距离最近为 0. 043，与葡萄遗传距离
最远为 0. 677，这说明 CoFBA4 可能是油茶果糖 － 1，
6 －二磷酸醛缩酶基因家族中分化早期的成员之一。
图 2 CoFBA4 基因编码蛋白的系统进化树分析
Fig． 2 Phylogenetic tree analysis of CoFBA4 protein
2． 3 CoFBA4 氨基酸序列分析及结构预测 采用
生物信息学方法分析，CoFBA4 推测 5—10，38，42—
44，54—56，61—69，78—83，85，97， 100—102，
107—116，139—141，144—151，161—163，166，
183—201，204—208，213，216—224，228，235，
239—240，242—243，245—248，253—254，257—
266，285—287，297—305 (最大疏水值位于第 301
个残基，赋值 1. 800 )，315—317，330，332—333，
338，340，356—359，361—364，367，369，371—372，
390 等区段的计 119 个残基具疏水性，占全部残基
总数的 30. 20%，由此可以推测油茶 CoFBA4 为亲水
性的蛋白。
蛋白质二级结构预测结果显示，CoFBA4 蛋白
的二级结构中 －螺旋(用 H 表示)占 43. 65%，β －
折叠(用 E 表示)占 12. 18%，无规则卷曲(用 L 表
示)占 44. 16%。包含了 1 个果糖二磷酸醛缩酶活
性位点，位于第 225—265 位氨基酸外，还包括 N －
糖基化位点 3 个 ( 10—13，72—75，155—158 )，
cAMP 和 cGMP 依赖的蛋白激酶磷酸化位点 1 个
(37—40)，蛋白激酶磷酸化位点 3 个(31—33，36—
38，54—56)，酪蛋白激酶磷酸化位点 5 个(46—49，
121—124，153—156，309—312，375—378)，酪氨酸
激酶磷酸化位点 1 个(241—249)，N － 豆蔻酰化位
点 5 个 ( 27—32，83—88， 176—181，347—352，
372—377)，酰胺化位点 2 个 (75—78，124—127)。
经分析，CoFBA4 蛋白不含跨膜区(图 3)。
图 3 CoFBA4 基因编码蛋白的跨膜结构预测
Fig． 3 Transmembrane domains prediction of CoFBA4 protein
分值大于 1. 0 时说明该区域为跨膜结构，分值小于 1. 0 时说明该区域无跨膜结构。
Region with transmembrane structure if scores ＞ 1． 0，region without transmembrane structure if scores ＜ 1. 0．
761
林 业 科 学 49 卷
2． 4 不同无性系种仁出油率及CoFBA4 基因表达
差异 以油茶 GAPDH 基因作为内参 (王保明，
2012)，采用实时荧光定量 PCR 的方法对油茶不同
无性系 10 月 18 日采收的种仁中 CoFBA4 基因进行
相对表达丰度分析。结果(图 4)显示，花期不同的
无性系之间比较，存在表达量低出油率高、表达量高
出油率低的现象，采用双变量相关性统计分析，结果
显示显著性为 0. 488 ，说明相关性不强。但是，根据
采摘时花期分为 3 组: 花后约 365 天采摘、花后约
350 天采摘以及花后约 335 天采摘。取组员最多的
进行统计学分析(表 1)，结果显示 Pearson 相关性为
0. 967，显著性为 0. 033，不仅说明二者显著相关，而
且表现为花期接近的无性系种仁 CoFBA4 基因表达
丰度与出油率基本呈正相关关系。
2． 5 亚细胞定位观察 将 CoFBA4 推导氨基酸序
列在线进行亚细胞定位预测，结果显示排在前 3 位
的为外膜、细胞外和周质，可靠性分别为 2. 100，
1. 488 和 0. 685。采用基因枪法将带有绿色荧光蛋
白基因( eGFP)的目的融合表达载体转化至洋葱表
皮细胞，同时通过注射烟草法将融合表达载体转化
烟草叶片，获得高效瞬时表达; 在激光共聚焦显微
镜下观察 eGFP 荧光信号，从烟草亚细胞定位观察
看，CoFBA4可能定位于细胞膜或细胞膜与细胞壁
之间，而结合洋葱表皮亚细胞定位，发现 CoFBA4 融
合蛋白主要在细胞壁与细胞膜之间的位置表达，说
明 CoFBA4 可能定位于细胞外(图 5)，这与 CoFBA4
亚细胞定位预测结果基本一致。
图 4 油茶无性系种仁 CoFBA4 基因表达丰度及出油率
Fig． 4 Expression abundance of CoFBA4 gene and
oil yield from different superior clones
出油率来自参考文献(谢鹏等，2010)。
Oil yield of different superior clones came
from reference (谢鹏等，2010)
表 1 CoFBA4 相对表达量与出油率相关性
Tab． 1 Correlation between CoFBA4 relative expression level and oil yield
油茶无性系
Superior clones
CoFBA4 相对表达量
Relative quantity of CoFBA4
出油率
Oil yield (% )
采摘期
Picking period
Pearson 相关性
Pearson correlation
‘茶陵二仙 268’‘CLEX268’ 0． 211 20 41． 35 花后约 350 天 0． 967 *
‘华硕’‘HS’ 0． 211 32 41． 71 About 350 days
‘衡东 17’‘HD17’ 0． 032 47 37． 69 after blossom
‘华鑫’‘HX’ 0． 095 63 39． 97
3 结论与讨论
油茶常规育种周期长，且常规杂交育种可能伴
有遗传累赘。采用基因工程新方法改良油茶，可实
现单一性状或多个性状的定向改良，大大缩短育种
周期，而且不会带有遗传累赘。20 世纪 90 年代，我
国开始启动油茶分子生物学方面的研究，近年来更
是研究的热点，构建了油茶近成熟种子 EST 文库
(谭晓风等，2006)、油茶种仁转录组和表达谱数据
库(林萍等，2011; 陈英等，2011)，挖掘出大量与油
茶油脂合成相关基因。糖酵解途径是油脂合成代谢
途径的上游代谢途径，该途径各调控酶的作用不仅
影响糖酵解的速率和产物而且影响油脂合成的效
率，譬如，Focks 等(1998)曾得到一个丙酮酸激酶基
因缺失的皱叶拟南芥突变体，研究发现其 80%的种
子表现出随糖酵解活性降低而含油量下降的特性。
果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶是糖酵解代谢途径中枢
调控酶，其酶促产物为油脂合成所需脂肪酸和甘油
同时 提 供 不 可 或 缺 的 原 料。在 植 物 细 胞 中，
果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶至少存在 2 种异构形式，
它们有部分同源的基因编码，但结构不同且分别定
位于细胞质或叶绿体( Tsutsumi et al．，1994)。本研
究亚细胞定位结果显示 CoFBA4 定位于细胞外，且
系统进化分析将其归为支系庞大的 A 亚族，这说明
植物醛缩酶随着生物进化、基因家族成员的增加，各
自表达部位和行使功能也出现了更多分化。通常情
况下，人们认为分泌蛋白需要借助信号肽的疏水核
心穿过内质网(ER)膜，但 Hamman 等依据多肽转运
861
第 11 期 曾艳玲等: 油茶果糖 － 1，6 －二磷酸醛缩酶基因(CoFBA4)的分子特征与表达分析
图 5 CoFBA4 基因亚细胞定位
Fig． 5 Subcellular localization of CoFBA4 gene
A: 洋葱表皮细胞; B: 烟草。Ⅰ: 紫外激发的荧光信号; Ⅱ: 可见光的信号; Ⅲ: Ⅰ和Ⅱ叠加。
A: Epidermal cells of onion; B: Tobacco． Ⅰ: The fluorescence signal ultraviolet excitation; Ⅱ: Signal light; Ⅲ:Ⅰadd Ⅱ ．
过程处于亲水环境的现象提出了亲水转位子孔道的
转运模式，这种模式中由结合蛋白 BiP 调控 ER 膜
的选择通透性(刘丹如等，2006)，N － 糖基化修饰
可以使蛋白质打上不同标记，改变多肽构象，在高尔
基体上还可形成蛋白聚糖被分泌到细胞外形成细胞
外基质或黏液层(周蕾等，2011)，这些可能是促成
没有跨膜结构的 CoFBA4 定位于细胞外的原因，但
具体是否如此还需进一步证明。
虽然目前人们对植物果糖 － 1，6 － 二磷酸醛缩
酶基因家族的功能研究主要集中在激素调控、抗逆
性等方面 (吴耀荣等，2006; Rajjou et al．，2006;
Konishi et al．，2004; Osakabe et al．，2005; Jiang et
al．，2007)，但有研究表明，在烟草体内过量表达拟
南芥叶绿体醛缩酶，总生物量明显增加，尤其是在高
CO2浓度(1 375 mg·m
－ 3 )时，转基因植株生物量达
到野生型植株的 2. 2 倍，这说明过量表达醛缩酶能
促进 CO2的固定(Uematsu et al．，2012)，从而促进糖
类代谢和脂类代谢。本研究结果也显示，相近花期
的油茶种仁 CoFBA4 基因表达丰度与出油率基本呈
显著正相关关系，理论上初步证明通过分子设计育
种方法改良油茶果糖 － 1，6 － 二磷酸醛缩酶的表达
可以提高油茶产量或单位面积出油率。
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(责任编辑 徐 红)
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