In order to screen culture conditions of a bioreactor for multiplying blueberry (Vaccinium uliginosum), the raft culture method was used in an air-lift bioreactor to study effects of inoculation density, air volume, and light intensity on proliferation and growth of shoots. The results indicated that a mass of shoots were able to be produced by using raft culture in a bioreactor. Inoculation density affected multiplication of blueberry, 60 inoculates in a 5 L bioreactor were the most suitable inoculation density, which led 38.6 adventitious shoots per explant, and total 2 316 vigorous shoots per bioreactor were obtained. Air volume rate of 100 mL·min-1 had the best effect on proliferation, and it produced significantly higher growth of shoots, more shoot numbers, greater fresh and dry mass than did the air volume groups of 50 and 150 mL·min-1. Multiplication of shoots was also affected by light intensity, and 45 μmol·m-2s-1 was better than either 30 or 60 μmol·m-2s-1 for producing dark green and vigorous shoots in the bioreactor.
全 文 ：第 !" 卷 第 ## 期
$ % # $ 年 ## 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1##
*/23!$ % # $
收稿日期" $%#$ 4%$ 4$9# 修回日期" $%#$ 4%6 4$"$
基金项目" 国家自然科学基金项目%生物反应器内铁皮石斛圆球茎生长动力学及有效物质积累规律的研究& ’9##\%%56( $
!廉美兰为通讯作者$
利用生物反应器接触培养法增殖笃斯越橘丛生苗!
李铁军:朴炫春:廉家盛:廉美兰
’延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室:延吉 #99%%$(
关键词" :笃斯越橘# 组织培养# 生物反应器# 接种量# 通气量# 光强
中图分类号! &5#"1!\& &5$91#:::文献标识码! ,:::文章编号! #%%# 45!"""$%#$### 4%#9% 4%!
?&"3’*,&%1’")"*650,)1’1’"4(-B""1("*>"))+,+*#*1+0+,&/*#Q(’)C S%*1H’"&,%.1"&(
-A+ABWI>:YA=/UI=>R:-A=> jA=FH:-A=> [BA0=>
’#$%&’()*’+)*%),Y*2’109;841=+0)1’58’=+)*9),+>$3>’12(’0Q)41+’01 ),Q0109+*%),I/4=’+0)1:_’1(0’1 J106$*90+%:_’1@0#99%%$(
67(1&%.1" :(> /CQBCS/FRCBB> RI0SICBR/>QASA/>F/O=NA/CB=RS/CO/CDI0SAE0LA>HN0IBNBCCL’X’==0104;450201)94;(! S
/> EC/0AOBC=SA/> =>Q HC/TS< /OFQAR=SBQ S<=S=D=FF/OFHC=OS
RI0SICBA> =NA/CB=RS/C3(>/RI0=SA/> QB>FASL=OBRSBQ DI0SAE0AR=SA/> /ON0IBNBCCL! \% A>/RI0=SBFA> =; -NA/CB=RS/CTBCBS
FAH>AOAR=>S0L
BAS
0AH
::笃斯越橘 ’X’==0104; 450201)94;(又称蓝浆果!
属杜鹃花科 ’)CAR=RB=B( 越橘属’X’==0104;( ’李亚
东! $%%#(!广泛分布于北半球$ 中国野生笃斯越橘
资源主要分布在大兴安岭)小兴安岭地区 ’李亚东
等! $%%#($ 笃斯越橘果实具有营养保健作用’李亚
东等! $%%!(!包括消除眼睛疲劳)软化血管)增强人
体免疫等功效!是近几年世界上发展十分迅速的集
营养与保健于一身的果树!被国际粮农组织列为五
大健康食品之一!具有广泛的市场前景$
笃斯越橘的繁殖方法较多!但种子育苗)绿枝扦
插)硬枝扦插)根插)分株嫁接等繁殖方法存在繁殖
速度慢)品种易退化等问题!且苗木生长势)果实品
质较组培苗均有不足之处’,
一般利用固体培养基进行培养’马均等! $%%5(!这
种方法因培养基凝固剂的使用!成本较高!阻碍着组
培苗产业化的应用进程$ 利用液体培养基进行培养
是植物组培的另一种方法!此种方法因培养基处于
流动状态!培养物可充分利用培养基中养分!同时培
养物分泌的一些物质不是集中在培养物周围而是均
匀地分散到培养基中!对培养物的生长有利 ’罗丽
萍等! $%%#(# 此外!因不使用琼脂!还可降低组培
成本$ 因此!改善培养工艺!建立组培新的技术体
系!减少生产成本是实现商业生产的一种必然趋势$
早在 #6;6 年 +I0BRPB和 *ARPB0’#6;6(首次将微生
物培养用发酵工艺应用到高等植物的悬浮培养!而
且从 $% -玻璃瓶放大到 9% -和 #9! -不锈钢发酵
罐$ 自此之后生物反应器被广泛应用!不断普及!截
止目前!已经在人参 ’D’1’F2019$12 ( ’陈巍等!
$%%;() 甘 草 ’W5%=%**>0H’ 4*’5$1909( ’ 向 德 军 等!
$%%#()丹参’ 7’560’ ;05+0)**>0H’( ’邱德有等! $%%!(
等 !% 多种植物材料中优化了毛状根培养系统$ 生
物反应器不定根培养技术也得到迅速发展!目前其
外植体系基本得到确立!韩国 ’7*7A/SBR< 有限公
司已利用 #% S大型反应器大量培养人参不定根!作
为化妆品)保健品的原料!并有产品上市$ 生物反应
:第 ## 期 李铁军等" 利用生物反应器接触培养法增殖笃斯越橘丛生苗
器主要类型有搅拌式)气升式)鼓泡式和旋转式$ 其
中气升式生物反应器是以气体为动力!靠导流装置
的引导!形成气液固混合物的总体有序循环!具有混
合效果好)结构简单)无运动部件)易清洗)不易染菌
和传热传质效率高的特点’张明菊! $%%;($ 本研究
利用气升式生物反应器接触培养法进行笃斯越橘组
培苗的大量增殖!探讨了影响反应器内笃斯越橘组
培苗增殖的几种因素!旨在寻找适宜的反应器增殖
培养条件!为笃斯越橘种苗的规模工厂化生产提供
理论依据$
:<材料与方法
#1#: 材料 : 笃 斯 越橘 2美登 / ’XB450201)94;
270/DAQ/>/(品种经过茎段培养得到的组培苗!在增
殖培养基0[& q玉米素’G+($1% DH+-4# q蔗糖 !%
H+-4# q琼脂 5 H+-4#! EJ;151中培养 \% 天后!将
增殖的丛生组培苗切成单体植株!选用长势均一的
苗!将其切成约 #1; RD长’带 $ 片叶(!作为反应器
培养的外植体材料$
图 #:反应器接触培养系统
ZAH3#:+
关# H" 喷头# <" 支持网$
=" ,ACO0/TDBSBC# N" ZA0SBC# R" [BQAIDCBFBC2/AC# Q" &=DE0A>H
E/S# B! O" &TASR<# H" &E=CHBC# <" &IEE/CSBC>BS3
#1$:试验方法:#(生物反应器接触培养系统及培
养基:试验采用 ; -球型气升式反应器接触培养系
统’图 #(!培养时在距离反应器球型底部 " RD处架
支持网!每个反应器中注入 $ -培养基!使培养基面
与支持网持平# 培养到一定阶段当培养基量减少
时!打开图 # 中开关 O!补充培养基!保证接种于支持
网上的外植体始终与培养基接触$ 所用的培养基为
7;’K=DN/CH$+’5B! #6\"(培养基加入 $ DH+-
4#的
G+!!% H+-4#的蔗糖!将 EJ值调节为 ;1!$
$(试验处理:生物反应器内接种密度试验设
置 9 个处理!每个反应器分别接种 !;! \% 和 5; 个
生长一致的外植体!通入空气’#%% D-+DA> 4# (!在
光强为 9% (D/0+D4$F4#的条件下培养# 为了调查通
气量对丛生芽增殖生长的影响!在反应器中接种 \%
个外植体后!分别通入 ;%! #%% 和 #;% D-+DA> 4#的
空气!其他条件与接种密度试验相同# 在探讨光强
对增殖生长的影响时!在反应器内接种 \% 个外植
体!通入 #%% D-+DA> 4#气体后!将反应器分别置于
光强 9%!!; 和 \% (D/0+D4$F4#条件下培养$ 所有试
验处理均接种 9 个反应器作为重复$
9(反应器接触培养过程中培养基的动态变化
为了探明反应器培养期间培养基 EJ)电导率’)’(
和蔗糖的变化动态!在 ; -反应器中接入 \% 个外植
体!通气量设置为 #%% D-+DA> 4#!光强调节为 !;
(D/0+D4$F4#!其他方法与试验 #1$ 中%生物反应器
接触培养系统及培养基&中的试验方法相同$ 为了
取培养基样品!每 ; 天在超净工作台内将反应器培
养系统中开关 ’B(打开!取培养基约 #% D-!置入
4$% o冰箱中保存# 取样至第 \% 天后!将冷冻的
培养基样品从冰箱取出!在室温下化冻!并测定样品
的 EJ))’及糖含量$
!(培养基中 EJ)电导率及糖含量的测定:将培
养基样品用孔径为 %1!! (D的过滤器过滤!去掉杂
质后用于分析测定$ EJ和电导率’)’(分别用酸度
计’YJ&?9’!上海精密科学仪器有限公司!上海(和
电导率仪’88&?9%5!上海精密科学仪器有限公司!
上海(测定$ 糖含量参照李利军等’$%%9(的分光光
度法测定!取 %1; D-稀释好的培养基样品溶液和
;1% D-磷钼黄溶液!用蒸馏水定容到 #% D-!在水浴
锅’#%% o(中加热 9; DA> 后取出!用自来水冷却至
室温!利用紫外可见分光光度计’i.##%$!上海天美
科学仪器有限公司!上海(在 "$% >D波长处测其吸
光度值!由标准曲线线性方程计算培养基中糖含量$
;(培养条件及数据分析:所有试验处理均接
种 9 个反应器作为重复$ 培养温度为’$; t$( o!
每天用荧光灯光照 #\ 殖的丛生苗取出!随机取 $% 个苗擦去表面的水分后
称其质量并记录鲜质量# 然后将其再放入 ;; o的
烘干箱中! $ 天后待完全干燥!称干质量并记录$
所得数据用 &,& ’ &S=SAFSAR=0,>=0LFAF&LFSBD!’=CL!
*’!i&,( 软件处理!采用邓肯氏新复极差法进行分
析比较’显著水平 Ds%1%;($
=<结果与分析
$1#:接种密度对丛生芽增殖生长的影响:接种密
#9#
林 业 科 学 !" 卷:
度是反应器培养中重要的调控参数之一!反应器培
养的最终目的是在一个反应器中得到大量而健壮的
培养体$ 试验结果表明" 接种量为 \% 个时!每个外
植体平均可分化 9"1\ 个小苗!显著多于 !; ’分化
$915 个(和 5;’分化 9%1# 个(接种密度处理# 从一
个反应器中收获的总苗数来看!\% 和 5; 两种接种
密度处理获得的苗数多!超过 $ %%% 株!但两者中 5;
接种密度处理得到的增殖苗瘦弱!鲜质量和干质量
明显不如 \% 接种密度$ 故在 ; -反应器中加入 $ -
培养基进行笃斯越橘苗增殖培养时!接种量过多
’5% 个(过少’!% 个(均不利于丛生芽的增殖生长!
接种密度为 \% 较为适宜$
表 :<生物反应器培养中接种密度对笃斯越橘丛生苗增殖生长的影响!
+%7>:
接种量
(>/RI0=SA/> QB>FASLb
’F丛生苗数 &IDNBC 苗生物量 &S4# (
每个外植体
YBCBVE0=>SFb’FS4# (
每个反应器
YBC2BFFB0b’F鲜质量
ZCBF< D=FF
干质量
8CLD=FF
!; $915 R! # %\\1; N $\916 R 961" R
\% 9"1\ = $ 9#\1% = !\$1" = \51$ =
5; 9%1# N $ $;51# = 99"1! N ;#1\ N
::)不同字母表示在 %1%; 水平上差异显著$ +
+
通气量对笃斯越橘丛生芽在反应器中增殖生长的影
响!分别将通气量设置为 ;%!#%% 及 #;% D-+DA> 4#!
空气通入培养基培养 \% 天后发现" 通气量为 #%%
D-+DA> 4#时!每个外植体平均分化的苗数达到 !%1个!显著高于通气量为 ;% D-+DA> 4# ’$91\ 个(和
#;% D-+DA> 4# ’ 9#1$ 个 ( 时的处理# 且 #%% D-+
DA> 4#的通气量处理的反应器苗生长健壮!颜色鲜
绿!其鲜质量’!5\1# DH(和干质量’5#1\ DH(值在 9
种通气量处理中也达到最高$ 因此!利用反应器进
行笃斯越橘种苗扩繁时!在培养基中通入 #%% D-+
DA> 4#的空气为佳$
表 =<生物反应器培养中通气量对笃斯越橘
丛生苗增殖生长的影响
+%7>=
54&’)C 7’"&,%.1"&.4314&,
通气量
,AC2/0IDBb
’D-+DA> 4# (
丛生苗数
&IDNBCb
’FS4# (
鲜质量
ZCBF< D=FFb
’DH+BVE0=>S4# (
干质量
8CLD=FFb
’DH+BVE0=>S4# (
;% $91\ R! $"\1# R !%1" R
#%% !%1\ = !5\1# = 5#1\ =
#;% 9#1$ N 9\51; N ;91$ N
$19:光照强度对丛生芽增殖生长的影响:光照强
度可激活或抑制某些酶的活性!是诱导植物器官分
化的必要条件之一$ 将光照强度分别调节为 9%!!;
和 \% (D/0+D4$F4#后进行反应器培养!发现光照强
度不仅影响苗的分化对其生物量的增加也有影响!
光照强度越高!苗的颜色越深!但分化的苗数及苗的
鲜质量和干质量的增加则需要一个适宜的光照强
度$ 从表 9 可以看出!光强在 !; (D/0+D4$F4#时!
每个外植体不定芽分化数平均为 !$1; 个!苗的鲜质
量和干质量分别达到 !5$1! DH和 5%1; DH!显著高
于光照强度为 9%!\% (D/0+D4$F4#的光强处理$ 故
利用反应器进行笃斯越橘组培苗的增殖培养时!!;
(D/0+D4$F4#为较适宜的光照强度$
表 @<生物反应器培养中光照强度对笃斯越
橘丛生苗增殖生长的影响
+%7>@
54&’)C 7’"&,%.1"&.4314&,
光照强度
-AH
’(D/0+D4$F4# (
丛生苗数
&IDNBCb
’FS4# (
鲜质量
ZCBF< D=FFb
’DH+BVE0=>S4# (
干质量
8CLD=FFb
’DH+BVE0=>S4# (
9% 9$1! N! 95"1$ N ;!1$ N
!; !$1; = !5$1! = 5%1; =
\% $61\ N 9$!1\ N ;91\ N
$1!:反应器内丛生苗增殖生长过程中培养基中总
糖$EJ及电导率的变化:对反应器内笃斯越橘增殖
培养过程中培养基的变化进行分析测定!从结果
’图 $(可以看出" 培养基中总糖浓度在培养 % ‘#%
天缓慢下降!#; ‘9; 天则呈现急剧下降的趋势!由
#; 天的 $"1! H+-4#下降到 9; 天的 "1; H+-4#!9; 天
后总糖含量很低!并随培养天数的增加而减少!培养
结束时’;% 天(总糖含量仅为 $19 H+-4## 培养基中
EJ值在 % ‘9; 天呈下降趋势!由原来的 ;1; 一直降
至 !1;\’9; 天(!从第 9; 天后开始略有上升的趋势!
在培养末期 \% 天时基本回升到 ;19\!这表明培养
的外植体具有调节培养基 EJ的能力# 与此同时!随
着培养的进行!在 % ‘$; 天!电导率值逐渐降低!
$9#
:第 ## 期 李铁军等" 利用生物反应器接触培养法增殖笃斯越橘丛生苗
$; ‘;%天时!电导率急剧下降!;% 天时则达到了最
低 #19; D&+RD4#!;% 天以后电导率值出现上升的
趋势!这可能是在培养后期!细胞衰亡导致细胞内无
机离子释放的结果$
图 $:反应器笃斯越橘增殖培养过程中培养基中
糖)EJ及电导率’)’(的变化
ZAH3$:’<=>HBF/OS/S=0FIH=CFR/>RB>S! EJ! =>Q B0BRSCARR/>QIRSA2ASL
’)’( A> RI0SICBDBQAIDQICA>HNA/CB=RS/CRI0SICB/ON0IBNBCCL
@<讨论与结论
生物反应器培养过程中!接种密度是重要的调
控参数之一!利用生物反应器进行植物扩繁的最终
目的是得到最多量的健壮繁殖体!接种外植体不可
过多或过少$ 已有研究表明!植物组织培养过程中
外植体数b培养基量)外植体数b空气量和外植体数b
容器 容 积 等 比 值 直 接 影 响 器 官 形 成 与 发 育
’[R’0B0=>Q $+’5B! #66%(!在植物器官的培养过程
中适宜接种密度依据植物种类)培养方式等而不同
’Y=CP $+’5B! $%%$($ 依本研究结果!对笃斯越橘组
培苗的增殖培养!; -反应器中加入 $ -培养基的条
件下!接种 \% 个外植体较为适宜$ 利用气升式生物
反应器进行植物器官培养时!通入空气的多少是重
要的参数指标# 通气量与溶氧率有直接的关系!通
气量少使培养体在液态培养基中因溶氧量不足器官
分化及发育受到影响!通气量过多则因流体动力胁
迫使植物生长受到抑制影响生物反应器培养效果
’张春华等! $%%5($ 本研究中笃斯越橘反应器增殖
培养的适宜通气量为 #%% D-+DA> 4#!这与玉兰花
’3%;(0/4;106$)V;’201’+4;(’金花等! $%%5()人参
’李慧娟等! $%##()辰星草’ &0;)104;>%(*0/ 2[AFSL
70IB/(’廉美兰等! $%%!(等植物器官反应器培养的
结果相同$ 笃斯越橘组织培养过程中!光照强度影
响组培苗增殖和生长!本研究中笃斯越橘生物反应
器增殖培养适宜的光照强度为 !; (D/0+D4$F4#!这
与郝明明等 ’$%#%(在笃斯越橘组培快繁试验中提
出的适宜光照强度 ’!% (D/0+D4$F4# (相近$ 说明
笃斯越橘组培快繁!不论是生物反应器液体培养还
是利用传统组培法进行固体培养!对光照强度的要
求差异不大!大约为 !% ‘!; (D/0+D4$F4#$
参 考 文 献
陈:巍! 高文远! 贾:伟! 等3$%%;3人参属药用植物组织和细胞培
养的研究进展3中草药! 9\’!( " \#\ 4\$%3
郝明明! 杜小春! 周文婷! 等3$%#%3蓝莓的快速繁殖3安徽农业科
学! ’$$( " ##5;6 4##5\#3
金:花! 朴炫春! 廉美兰! 等3$%%53利用简易生物反应器大量生产
玉兰花根状茎及绿芽3东北林业大学学报! 9;’5( " !! 4!;3
李慧娟! 朴炫春! 代:月! 等3$%##3人参不定根生物反应器培养及
其动态学研究3延边大学农学学报! 99’$( " 6! 46"3
李利军! 孔红星! 何:云! 等3$%%93蔗汁中蔗糖含量的分光光度法
测定3分析测定学报! $$ ’!( " ;# 4;!3
李亚东3$%%#3越橘栽培与加工利用3长春" 吉林科学技术出版社!
# 4\3
李亚东! 姜惠铁! 张志东! 等3$%%#3中国笃斯越橘产业化发展的前
景3沈阳农业大学学报! ’9( " 96 4!$3
李亚东! 吴:林! 刘洪章! 等3$%%!3越橘果实中营养成分分析3北
方园艺! ’9( " $$ 4$93
廉美兰! 朴炫春! 王:颖! 等3$%%!3间歇浸没式生物反应器在辰星
草培养苗扩繁中的应用3园艺学报! 9#’!( " ;9$3
罗丽萍! 杨柏云! 章敏华! 等3$%%#3百合的组织培养3中草药! 9$
’5( " \!% 4\!$3
马:均! 马明东3$%%53曼地亚红豆杉的组织培养快繁技术3林业
科学! !9’5( " 9% 49!3
邱德有! 宋经元! 马小军! 等3$%%!3丹参毛状根生物反应器大规模
培养的研究3分子植物育种! $’;( " \66 45%93
向德军! 丁家宜! 刘:涤3$%%#3甘草毛状根培养系统的建立及化
学成分分析3植物资源与环境学报! #%’#( " 5 4#%3
张春华! 朴炫春! 廉美兰! 等3$%%53生物反应器在满天星快繁中的
应用3植物学报! ’!( " ;$\ 4;9#3
张明菊3$%%;3生物反应器产业概况3黄冈职业技术学院学报! 5
’9( " "5 46#3
,
EC/E=H=SA/> NLSAFFIBRI0SICB/CF/OST//Q FA>H0B?>/QBRISA>H/>
HC/TS< <=NAS! LAB0Q! =>Q NBCCLTBAHJ/CSFRAB>RB! #$#’$( " 996 49!$3
K=DN/CHc-! [A0BCh,! cWAD=g3#6\"3*ISCAB>SCBkIACBDB>SF/O
FIFEB>FA/> RI0SICBF/OF/LNB=> C//SRB0F3 )VEBCADB>S=0’B0
hBFB=CR[R’0B0=>Q [+! &DAS< [,-3#66%3.BFFB0SLEB! R0/FICB=>Q BVE0=>S
/CAB>S=SA/> A>O0IB>RBA> 2ASC/EBCO/CD=>RB/OOA2BT//QLFEBRABF3
J/CSFRAB>RB! $;’5( " 565 4"%%3
Y=CP & M! [ICS
/OEC/S/R/CD?0APBN/QABFIFA>HNA/CB=RS/CFLFSBD=>Q FINFBkIB>SE0=>S
CBHB>BC=SA/> A> D>’5’$1)E909BY0=>S’B0! +AFFIB=>Q cCH=> ’I0SICB!
\9’#( " \5 45$3
+I0BRPB@! *ARPB0-K3#6;63YC/QIRSA/> /O0=CHB=D/I>SF/OE0=>S
SAFFIBNLFINDBCHBQ RI0SICB3&RAB>RB! #9%’9956( " "\9 4"\!3
!责任编辑:徐:红"
99#