全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
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3456，$ % & %
银杏营养贮藏蛋白质的分离鉴定
彭方仁7 郭红彦7 吴青霞
（南京林业大学森林资源与环境学院 7 南京 $&%%#8）
摘 7 要：7 采用光学和电子显微镜技术、’9’:;-<* 技术、间接免疫酶标光镜定位和胶体金免疫电镜定位技术对银
杏枝条中的营养贮藏蛋白质（/’;=）进行分离鉴定，并对其细胞学特性及动态变化规律进行初步研究。研究结果：
运用制备型 ’9’ >聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并制备银杏 #$ 和 #" ?@ $ 种营养贮藏蛋白质抗原，通过免疫新西兰大
白兔成功获得银杏 #$ 和 #" ?@ $ 种营养贮藏蛋白质的多克隆抗体。银杏 /’;= 主要分布于落叶期当年生枝条的次
生韧皮部细胞中，呈现出团块状、颗粒状和均一状 # 种形态。在新梢生长期，积累在枝条中的 /’;= 逐渐降解消失，
表现出明显的季节变化。
关键词：7 银杏；营养贮藏蛋白质；分离鉴定；免疫标记分析
中图分类号：’8&A2 !#7 7 7 文献标识码：-7 7 7 文章编号：&%%& > 8!AA（$%&%）%# > %%B$ > %!
收稿日期：$%%A > && > $&。
基金项目：国家自然科学基金项目（#%A8$%BB）和教育部高校博士点基金（$%%8%$CA%%A）。
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WLS50=S0QI 10S41LX4PL0E6 ,ND SIP010FLS41 SN454SPD5L=PLS 4EV VIE4WLS SN4EFD= 0T /’;= UD5D Q5D1LWLE45L1I =P@VLDV6 ,ND
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7 7 营养贮藏蛋白质（ ODFDP4PLOD =P054FD Q50PDLE=，
/’;=）是许多落叶树种季节性氮素贮藏的主要形
式。这种蛋白质通常在夏末秋初开始积累，越冬期
间维持较高含量，春季随着新梢的萌发，降解成可利
用的氨基酸，为新梢迅速生长提供充足的氮源（彭
方仁等，$%%&；$%%"）。营养贮藏蛋白质的存在不仅
能防止养分损失，而且能为树木在新生长季节的结
构伸长和生殖生长提供必需的养分储备。
近年来，国内外学者对树木营养贮藏蛋白质进
行了大量研究，肯定了它的氮素贮藏作用（(14@=DE
$* .#6，&CC&；JDPXD1 $* .#6，&CC&；(01DW4E $* .#6，&CC#；
&CC!；郭红彦等，$%%C；田维敏等，$%%&；$%%$；;DEF
$* .#6，$%%!），揭示了其细胞学和生物化学性质的多
样性和统一性（田维敏等，$%%%；$%%&；,L4E $* .#6，
$%%$；$%%8），并已从多种木本植物中分离鉴定出营
养贮藏蛋白质（ O4E (1DOD $* .#6，&CAA；JDPXD1 $* .#6，
&CC&；H45W= $* .#6，&CC$；,L4E $* .#6，$%%$；$%%8；王
旭初等，$%%!；潘瑞英，$%%!）。但有关银杏（93/:%"
;3#";.）营养贮藏蛋白质的生物化学性质及分离鉴定
等方面的研究还未见系统报道。本文在免疫新西兰
白兔后采集血样提取抗血清，制备银杏营养贮藏蛋
白质的抗体，应用 JD=PD5E R10P 方法鉴定其营养贮藏
蛋白质特性，结合胶体金免疫电镜细胞化学定位和
间接酶标免疫光镜细胞化学定位对 $ 种营养贮藏蛋
白质进行定位研究并对其细胞学特性及动态变化规
律进行初步研究，旨在从银杏中分离鉴定出主要的
营养贮藏蛋白质，为研究营养贮藏蛋白质的积累和
降解机制提供基础。
! 第 " 期 彭方仁等：银杏营养贮藏蛋白质的分离鉴定
#! 材料与方法
!" !# 试验材料
以南京林业大学树木园内成年健康的银杏雄株
为材料，采集树冠外围受光良好的当年生枝条进行
研究。采样时间为 $%%& 年 # 月—$%%’ 年 # 月，在春
季萌芽阶段（" 月和 ( 月初）和接近落叶期（#% 月）
每隔 ’ 天采样 # 次，其他月份每月各采样 # 次。全
年中所有样品均采于同一雄株。
!" $# 光学显微技术和电子显微技术
光镜及电镜样品制作参照郭红彦等（$%%)）。
!" %# &’& (聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用 *+,-./0 1232 垂直板电泳槽进行 404 5
聚丙烯酰胺凝胶电泳。上样量 $% !6。分离胶浓度
#78，浓缩胶浓度 (9 (8。样品提取液含 $8 404、
78 巯基乙醇、#%8 甘油、%9 %$8 溴酚蓝的 %9 %#
1:;·< 5 # =>2?-@A;，B@C9 %。用 %9 $78 的考马斯亮蓝
染色液染色 $9 7 D，脱色，直到背景脱干净为止。脱
色后的凝胶经清水冲洗后，用凝胶成像系统拍照记
录。试验在相同条件下重复 " 次。
!" )# 银杏 %$，%* +, 蛋白质的抗血清制备
免疫动物选择健康纯种新西兰白色雄兔，购于
江苏农业科学研究院种兔中心。# 只作为对照，$ 只
免疫 "$ EF 蛋白质，另 $ 只免疫 "& EF 蛋白质。抗血
清制备按田维敏等（#))C）的方法。抗血清效价用
琼脂免疫扩散法测定（王旭初等，$%%(）。本试验的
"&，"$ EF 蛋白质的抗血清效价为 #$C。
!" -# 免疫印迹（./01/23456711839）
使用 *+,-./0 半干式转印仪进行电印迹，将凝
胶上的蛋白质转印到 GH0I 膜上。免疫反应中使用
的一抗为制备的 "$ 或 "& EF 蛋白质的抗血清（稀释
体积比 #J #%%），二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗
兔 +6K（稀释体积比 # J ( %%%，购自博士德生物工程
有限公司），0/* 显色后拍照。
!" *# 间接免疫酶标定位
间接 免 疫 酶 标 光 镜 定 位 参 考 L2?DE23M 等
（#)C’）的方法，略有改动。样品用含 %9 78 戊二醛
和 (8 多聚甲醛的 %9 # 1:;·< 5 # 磷酸盐缓冲液
（B@’9 $）( N下固定 $( D，乙醇系列脱水，二甲苯透
明后包埋于石蜡中，/, 旋转切片机切片，切片厚度
( !1。切片经常规脱蜡、复水后用 "8 @$,$ 蚀刻处
理 C O #% 123，蒸馏水洗 " 次，每次 $ 123，再入 %9 %#
1:;·< 5 #柠檬酸盐缓冲液（ B@&9 %，# %%% 1<）中进行
微波抗原修复，蒸馏水冲洗 $ 次，再用 B@ ’9 7 的
=>2?-@A; 缓冲盐溶液（简称 =*4）冲洗 " 次，每次
7 123，之后进行免疫反应。对照为用正常血清代替
一抗处理的切片，其余步骤同上。
!" :# 胶体金免疫电镜定位
参考 L::>P 等（#)CC）的方法，略有改动。样品
在含 %9 78戊二醛和 (8多聚甲醛的 %9 # 1:;·< 5 #磷
酸缓冲液（ B@’9 $）中 ( N固定 $( D（不经锇酸后固
定），乙醇系列脱水，环氧丙烷过渡，&% N聚合后包
埋于 QB:3C#$ 树脂，室温干燥保存。片机切片，厚度 7% 31，切片捞于有 I:>1ST> 支持膜
的 #%% 目铜网上。之后进行如下步骤：#）载网先用
双蒸水浸润 #% 123，然后经 #%8 @$,$ 处理 #% 123，
=*4=（含 %9 %$8 =UPP3$% 的 =*4）洗 7 次，每次
7 123；$）%9 # 1:;·< 5 # @A; 处理 #% 123，=*4= 洗 7
次，每次 7 123；"）在含 %9 %$8 =UPP3$%、78脱脂奶
粉的 =*4 缓冲液中封闭 # D；(）与一抗（# J #% 体积
稀释）在室温下作用 # D；7）=*4=冲洗，然后浸洗 7
次，每次 7 123；&）与二抗（胶体金标记的羊抗兔
+6K，胶体金直径 #% 31，购自北京博奥森生物技术
有限公司）（# J (稀释）在室温下作用 # D；’）=*4=
洗 7 次，每次 7 123；蒸馏水洗 " 次，每次 7 123；C）
醋酸铀染色 #7 123，柠檬酸铅染色 & 123；)）@-&%%
型透射电镜观察拍照。对照为用正常血清代替一抗
处理的切片，其余步骤同上。
$! 结果与分析
$" !# 银杏贮藏蛋白质细胞学特点
汞 5 溴酚蓝染色后，光镜下观察处于落叶期的
银杏当年生枝条次生韧皮部、皮层和木质部，这些部
位的许多细胞中含有被染成鲜蓝色的蛋白质内含
物，以次生韧皮部细胞中居多，且这些鲜蓝色的蛋白
质内含物主要存在于近形成层的韧皮薄壁细胞和韧
皮射线细胞中，呈颗粒状（图版 + 5 #）。随着芽的萌
发和新梢的生长，枝条中的蛋白质内含物纷纷降解
消失（图版 + 5 $），具明显的季节变化。
电镜下观察发现，贮藏蛋白质细胞的液泡中含
有大量电子致密物，形态各异，呈现出颗粒状、团块
状和均一状（图版" 5 "，(）。这些不同形态的电子
致密物就是光镜下看到的液泡蛋白质内含物。
$" $# %*，%$ +, 蛋白质的分离纯化及抗体制备
404-G/KQ 分析表明，在落叶期的当年生枝条
树皮组织中有 $ 种高含量的蛋白质，分子质量为
"&，"$ EF。在 404-G/KQ 图谱上（图 #），它们呈显
著的蛋白质谱带。芽萌发和新梢生长期间，"&，
"$ EF蛋白质逐渐降解并消失。
以 #$ 月份的当年生枝条树皮为材料，采用制备
"7
林 业 科 学 !" 卷 #
图 $# 当年生枝条树皮可溶性蛋白 %&%’()*+ 图谱
,-./ $# %&%’()*+ 01230405-64 0718-249 18
912:;24 07154-< -< ;=7> 18 =<<:=2 ;7=$ A B 对应的日期分别为 CDD" A D$ A DE，CDD" A DC A CD，CDD"
A DF A $$，CDD" A DF A $G，CDD" A DF A C"，CDD" A DF A F$，CDD"
A D! A $!。箭头示 F"，FC >: 蛋白质。每槽蛋白上样体积
CD !H。I：标准蛋白质。
$ A B J4=< 5@4 9=J024 -< K=$G 5@，I=7/ C" 5@，I=7/ F$ 95，)07/ $! 5@ 18 CDD"/ )771L9 -<6-?=54
07154-<9 18 FC =<6 F" >:/ M15=223 CD !H 07154-< 9=J024 L=9 21=646
047 2=<4/ I/ %5=<6=76 07154-<9/
性 %&%’()*+ 技术分离并纯化出银杏 FC，F" >: C
种蛋白质用作抗原，分别免疫新西兰白兔后，获得了
F"，FC >: 蛋白质的多克隆抗体。采用 N49547<’
;2155-<. 技术，用 F"，FC >: 蛋白质的抗血清分别检
测落叶期当年生枝条树皮中的可溶性蛋白质（图
C），结果表明：F" >: 蛋白质的抗血清能够与 F" >:
蛋白质发生强的免疫反应，同时与 FC >: 蛋白质有
较强的免疫交叉反应，类似地，FC >: 蛋白质的抗血
清能够很好地识别 FC >: 蛋白质并与 F" >: 蛋白质
有较强的免疫交叉反应，说明 F" 与 FC >: 蛋白质具
有相同的抗原决定簇。
!" #$ 营养蛋白质的免疫细胞化学定位
间接免疫酶标定位结果表明，在分别用 F"，FC
>: 蛋白质的抗血清处理的组织切片中，具有被染成
棕黄色的物质，呈颗粒状（图版" A O，"）。汞 A 溴
酚蓝染色表明，这些颗粒状物质是贮藏蛋白质细胞
中的蛋白质内含物。用正常血清代替一抗处理的对
照切片中，除了一些单宁细胞自身呈现的棕黄色外，
没有观察到任何棕黄色颗粒存在（图版" A B）。
采用胶体金免疫细胞化学定位技术，进一步在
电镜水平对 F" >: 蛋白质进行亚细胞定位。结果表
明，液泡中的电子致密物特异性被胶体金颗粒标记
（图版" A G，E），用正常血清代替一抗处理的对照
切片中，没有任何胶体金颗粒分布（图版" A $D）。
F# 结论与讨论
依据 P2=:94< 等（$EE$）为树木营养贮藏蛋白质
图 C# 树皮可溶性蛋白 %&%’()*+ 及免疫印迹图谱
,-./ C# %&%’()*+ 18 912:;24 07154-< 871J ;=7> =<6
L49547< -JJ:<1;215 18 -59 6:02-?=5-1<
)/ 落叶期树皮可溶性蛋白 %&%’()*+ 图谱；Q，P/ 分别示 F"，
FC >: 蛋白质抗血清的免疫印迹图谱。蛋白上样体积为
CD !H。I：标准蛋白质。
)/ %&%’()*+ 01230405-64 0718-249 18 912:;24 07154-< -< ;=7>
6:7-<. 24=82499 95=.4/ Q，P/ &:02-?=5-1< 18 ) ;3 :9-<. 5L1
=<5-947:J =.=-<95 07154-<9 18 F" =<6 FC >:/ M15=223 CD !H 07154-<
9=J024 L=9 21=646 047 2=<4/ I/ %5=<6=76 07154-<9/
制订的 F 条标准，采用光学和电子显微镜技术、%&%’
()*+ 技术、N49547<’;2155-<. 以及间接免疫酶标定位
和胶体金免疫定位技术对银杏营养贮藏蛋白质进行
了分离鉴定，结果证明，F" 和 FC >: C 种蛋白质完全
符合上述标准：
$）用蛋白质专一性的染料汞 A 溴酚蓝染色的
光镜石蜡切片中，枝条次生韧皮部薄壁细胞中有许
多被染成鲜蓝色的颗粒状蛋白质内含物，说明这些
物质是蛋白质性质的。在电子显微镜下，这些细胞
中分布着很多大小不等的小液泡，小液泡里有大量
形态各异的电子致密物，其超微结构主要有 F 种形
状，呈颗粒状、团块状和均一状。不同形状的蛋白质
内含物分别存在于不同的贮藏蛋白质细胞中，它们
应当是光镜下的蛋白质内含物。
银杏营养贮藏蛋白质超微结构的差异与营养贮
藏蛋白质 R%(9 的种类不同有关。例如大叶桃花心木
（!"#$%$&#’ (’)*+,-.//’）与麻楝（0$/#’ ’1$2’*’)-）的
R%(9 的超微结构存在明显差异，两者的主要 R%(9 无
免疫相关性（田维敏等，CDDC）。杨树（3+,4/45）FC >:
蛋白质的抗体不能识别杨柳科（%=2-?=?4=4）以外的其
他科树木的 R%(9；不同科树木的 R%(9 缺乏免疫相关
性（N45S42 $% ’//，$EE$）。大叶桃花心木和非洲楝
（0$/#’ %++5$&2’&）的 R%(9 超微结构非常相似，两者的
主要 R%(9 的分子质量相近且高度同源；麻楝和毛麻
楝（ 67/’#’ +2+*’%’）的超微结构相同，它们的主要
R%(9 相同（M-=< $% ’//，CDDC）。这些现象表明：R%(9
生化性质的不同很可能是造成其形态多样性的主要
!O
! 第 " 期 彭方仁等：银杏营养贮藏蛋白质的分离鉴定
原因（田维敏等，#$$%）。
#）&’&()*+, 分析显示，落叶期的当年生枝条
树皮组织中，有 # 种含量相对较高的蛋白质，在图谱
上，这 # 种蛋白质的分子质量分别为 "- 和 "# ./。
在银杏萌芽和抽梢的过程中，枝条树皮组织中的 "-
和 "# ./ 蛋白质逐渐减少，具明显季节变化。
木本植物的 0&)1 通常被认为是一类为春季生长
提供氮素的贮藏物质（&2/345 !" #$%，%66$；%66#）。0&)1
贮藏功能的确定主要是根据这些蛋白质的含量具有明
显的 季 节 性 变 化。7/ 等（ %66%）对 几 种 楝 科
（849:2;424）树种末端小枝的显微观察发现，落叶期间
整个次生韧皮部的薄壁组织细胞中都充满了蛋白质颗
粒，而当抽新梢时这些蛋白质在次生韧皮部的里层消
失。<=1123= 等（#$$#）在芸苔（&’#(()*#）包围组织的外
皮层薄壁细胞中也发现了 % 种 #" ./ 的 0&)。杨树射
线细胞中蛋白质体的代谢与大量氨基酸进入导管是同
时进行的，这充分表明 0&)1 具有季节性氮贮藏功能，
用于树木生长发育（>=94?2@ !" #$%，%66"）。
"）间接免疫酶标定位表明，用 "- 和 "# ./ 蛋白
质的抗血清处理组织切片中，只有贮藏蛋白质细胞
的液泡蛋白质被染成棕黄色，光镜下，这些被染色的
棕黄色蛋白质呈颗粒状，它们和经汞 A 溴酚蓝染色
的深蓝色颗粒状液泡蛋白质完全一致。胶体金免疫
定位分析表明，在用 "- ./ 蛋白质的抗血清处理的
切片中，只有贮藏蛋白质细胞的液泡蛋白质被胶体
金颗粒标记。说明液泡蛋白质的主要成分是 "- ./
蛋白质。同时，因 "- ./ 蛋白质与 "# ./ 蛋白质具有
强的免疫相关性，间接表明 "# ./ 蛋白质也是液泡
蛋白质的一种主要成分。表明 "- 和 "# ./ # 种蛋白
质都是贮藏蛋白质细胞的液泡蛋白质内含物的主要
成分。上述结果充分表明 "- 和 "# ./ 蛋白质是银
杏的 # 种主要营养贮藏蛋白质。
参 考 文 献
郭红彦，吴青霞，彭方仁 B #$$6C 银杏枝条营养贮藏蛋白质的组分
及动态变化 B 林业科学，DE（"）：#E A #FC
潘瑞英 B #$$DC 荔枝营养贮藏蛋白质的分离鉴定及其与开花结实的
关系 B 华南热带农业大学硕士学位论文 B
彭方仁，郭 ! 娟，徐柏森 B #$$%C 木本植物营养贮藏蛋白质研究进
展 B 植物学通报，%F（D）：DDE A DE$C
彭方仁，王改萍，郭 ! 娟 B #$$-C 银杏营养贮藏蛋白质的细胞学及
生物化学分析 B 南京林业大学学报：自然科学版，"$（D）：%$6
A %%"C
田维敏，邱德勃，韩亚琴，等 B %66FC 热带树木免疫组织细胞化学研
究的抗血清制备 B 热带农业科学，（-）：E# A EEC
田维敏，吴继林，郝秉中，等 B #$$$C %E 科温带树木营养贮藏蛋白
质的细胞学研究 B 西北植物学报，#$（E）：F"E A FD%C
田维敏，高政权，孟春晓，等 B #$$%C 0&)1 在热带树木中分布的细
胞学研究 B 热带作物学报，##（D）：% A FC
田维敏，吴继林 B #$$#C 楝科树木营养贮藏蛋白质的研究 B 植物学
报，DD（#）：#D# A #DEC
王旭初，史敏晶，陈月异，等 B #$$DC 无患子科树木细子龙营养贮藏
蛋白质的分离鉴定 B 热带作物学报，#E（D）：GF A F"C
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（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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