免费文献传递   相关文献

Effects of Basic Media and Culture Conditions on Callus Growth and Secondary Metabolite Content of Tripterygium wilfordii

培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响


以MS,B5,NT,H,1/2MS,6,7-V及White为基本培养基,分别添加1.0 mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-1KT,分析不同类型培养基对雷公藤愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响,并以NT为基本培养基进行光照条件、pH值、接种量、不同外植体以及培养时间试验,探讨雷公藤愈伤组织生长及次生代谢产物含量的最佳培养条件。结果表明:6,7-V培养基有利于愈伤组织生长和继代保存,White培养基上雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱含量最高,NT培养基适合进一步继代培养。pH5.8时,最有利于愈伤组织生长,pH6.7时雷公藤内酯醇的含量最高,而雷公藤总生物碱含量在pH5.2时最高;光照处理中,暗光不仅有利于愈伤组织生长,也有利于雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱的积累,且褐化程度较轻。根愈伤组织增长量、雷公藤内酯醇含量最高,而叶愈伤组织中雷公藤总生物碱的含量最高。愈伤组织最适继代时间为40~45天,雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱的产量在第50天时最高。

MS,B5,NT,H,1/2MS,6,7-V and White were used as basic media,supplemented with 1.0 mg·L-12,4-D and 0.5 mg·L-1 KT, to study their effects on callus growth and secondary metabolite content of Tripterygium wilfordii.Light,pH,inoculating quantity,explants and culture time were studied with NT as basic media to explore the best culture conditions of the callus growth and secondary metabolite content.The results showed that 6,7-V medium was best for callus growth and preservation.White was the best suitable for the accumulation of triptolide and total alkaloids.NT medium was suitable for subculture.The optimal pH for the callus growth was 5.8.The optimal pH for the accumulation of triptolide was 6.7 and the optimal pH for the total alkaloids accumulation was 5.2.Dark condition was best not only for callus growth,but also for the triptolide and total alkaloids accumulation,with lesser browning callus.The root callus growth and triptolide content were significantly higher than that of the stem and leaf callus.Alkaloid content of leaf callus was significantly higher than that of the root and stem callus.The optimal duration for callus subculture was around 40-45 days.The triptolide and total alkaloids yield was the highest in 50 days.


全 文 :第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
’()*+,)- ’)./-* ’)+)(-*
/012 !",+02 #
345,$ % & %
培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和
次生代谢产物含量的影响!
李6 琰&,$ 6 冯俊涛& 6 王永宏$ 6 李玉平$ 6 张6 兴&
(&2 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心 6 陕西省生物农药工程技术研究中心 6 杨凌 7&$&%%;
$2 西北农林科技大学生命科学学院 6 杨凌 7&$&%%)
摘 6 要:6 以 3’,8#,+,,9,& : $3’,",7;/ 及 <=>?@ 为基本培养基,分别添加 &2 % AB·.
C &$,!;D 和 %2 # AB·. C & E,,分
析不同类型培养基对雷公藤愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响,并以 +, 为基本培养基进行光照条件、F9
值、接种量、不同外植体以及培养时间试验,探讨雷公藤愈伤组织生长及次生代谢产物含量的最佳培养条件。结果
表明:",7;/ 培养基有利于愈伤组织生长和继代保存,<=>?@ 培养基上雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱含量最高,
+, 培养基适合进一步继代培养。F9#2 G 时,最有利于愈伤组织生长,F9"2 7 时雷公藤内酯醇的含量最高,而雷公藤
总生物碱含量在 F9#2 $ 时最高;光照处理中,暗光不仅有利于愈伤组织生长,也有利于雷公藤内酯醇及雷公藤总
生物碱的积累,且褐化程度较轻。根愈伤组织增长量、雷公藤内酯醇含量最高,而叶愈伤组织中雷公藤总生物碱的
含量最高。愈伤组织最适继代时间为 !% H !# 天,雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱的产量在第 #% 天时最高。
关键词:6 雷公藤;愈伤组织;组织培养;次生代谢产物
中图分类号:’7&G2 !";IJ!K2 &6 6 6 文献标识码:-6 6 6 文章编号:&%%& C 7!GG($%&%)%# C %%"! C %"
收稿日期:$%%J C %! C &7。
基金项目:国家“十五”攻关项目($%%$8-#&"-%!)。
!张兴为通讯作者。
!""#$%& ’" ()&*$ +#,*) )-, ./0%/1# .’-,*%*’-& ’- .)00/& 21’3%4 )-, 5#$’-,)16
+#%)7’0*%# .’-%#-% ’" !"#$%&"’(#)* +#,-."/##
.> L4M&,$ 6 N@MB OPM?40& 6 <4MB L0MB=0MB$ 6 .> LPF>MB$ 6 Q=4MB R>MB&
(&2 !"#"$%&’ $() *"+",-./"(0 1"(0"% -2 34-%$04-($, 5"#04&4)",6-%0’7"#0 89: ;(4+"%#40<
=’$$(>4 5%-+4(&" ?"&’(-,-@< $() A(@4(""%4(@ 1"(0"% -2 34-."#04&4)"6 B$(@,4(@ 7&$&%%;
$2 1-,,"@" -2 C42" =&4"(&",6-%0’7"#0 89: ;(4+"%#40<6 B$(@,4(@ 7&$&%%)
87&%1)$%:6 3’,8#,+,,9,& : $3’,",7;/ 4MS <=>?@ T@U@ PV@S 4V W4V>X A@S>4,VPFF1@A@M?@S T>?= &2 % AB·.
C & $,!;D
4MS %2 # AB·. C & E,,?0 V?PS5 ?=@>U @YY@X?V 0M X411PV BU0T?= 4MS V@X0MS4U5 A@?4W01>?@ X0M?@M? 0Y ?%4.0"%<@4D/ 74,2-%)44Z
.>B=?,F9,>M0XP14?>MB [P4M?>?5,@\F14M?V 4MS XP1?PU@ ?>A@ T@U@ V?PS>@S T>?= +, 4V W4V>X A@S>4 ?0 @\F10U@ ?=@ W@V? XP1?PU@
X0MS>?>0MV 0Y ?=@ X411PV BU0T?= 4MS V@X0MS4U5 A@?4W01>?@ X0M?@M?Z ,=@ U@VP1?V V=0T@S ?=4? ",7;/ A@S>PA T4V W@V? Y0U
X411PV BU0T?= 4MS FU@V@U]4?>0MZ <=>?@ T4V ?=@ W@V? VP>?4W1@ Y0U ?=@ 4XXPAP14?>0M 0Y ?U>F?01>S@ 4MS ?0?41 41^410>SVZ +,
A@S>PA T4V VP>?4W1@ Y0U VPWXP1?PU@Z ,=@ 0F?>A41 F9 Y0U ?=@ X411PV BU0T?= T4V #2 GZ ,=@ 0F?>A41 F9 Y0U ?=@ 4XXPAP14?>0M
0Y ?U>F?01>S@ T4V "2 7 4MS ?=@ 0F?>A41 F9 Y0U ?=@ ?0?41 41^410>SV 4XXPAP14?>0M T4V #2 $Z D4U^ X0MS>?>0M T4V W@V? M0? 0M15 Y0U
X411PV BU0T?=,WP? 41V0 Y0U ?=@ ?U>F?01>S@ 4MS ?0?41 41^410>SV 4XXPAP14?>0M,T>?= 1@VV@U WU0TM>MB X411PVZ ,=@ U00? X411PV
BU0T?= 4MS ?U>F?01>S@ X0M?@M? T@U@ V>BM>Y>X4M?15 =>B=@U ?=4M ?=4? 0Y ?=@ V?@A 4MS 1@4Y X411PVZ -1^410>S X0M?@M? 0Y 1@4Y X411PV
T4V V>BM>Y>X4M?15 =>B=@U ?=4M ?=4? 0Y ?=@ U00? 4MS V?@A X411PVZ ,=@ 0F?>A41 SPU4?>0M Y0U X411PV VPWXP1?PU@ T4V 4U0PMS !% C
!# S45VZ ,=@ ?U>F?01>S@ 4MS ?0?41 41^410>SV 5>@1S T4V ?=@ =>B=@V? >M #% S45VZ
9#6 3’1,&:6 ?%4.0"%<@4D/ 74,2-%)44;X411PV;?>VVP@ XP1?PU@;V@X0MS4U5 A@?4W01>?@V
6 6 雷 公 藤( ?%4.0"%<@4D/ 74,2-%)44)系 卫 矛 科
((@14V?U4X@4@)雷公藤属植物,它既是一种重要的杀
虫植物,又是著名的药用植物,其杀虫成分主要是雷
公藤甲素和生物碱(李琰等,$%%G;周琳等,$%%";
’T>MB1@ "0 $,Z,&J!&)。雷公藤甲素又称雷公藤内酯
醇,是中药雷公藤的主要有效成分之一,作为免疫抑
! 第 " 期 李 ! 琰等:培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
制药物,可应用于许多自身免疫性疾病的治疗(夏
焱等,#$$")。雷公藤生物碱具有明显的体液和细
胞免疫抑制作用,也是治疗类风湿性关节炎的有效
成分,其含量对评价生药质量具有一定的意义。在
农业害虫防治中,雷公藤内酯醇有较好的触杀活性
(罗都强等,#$$%),雷公藤总生物碱有较好的拒食
活性(周琳等,#$$&)。这些有效成分人工合成困
难,价格昂贵,市场需求量大,而且资源日益遭到破
坏,因此,通过细胞培养技术生产雷公藤药用次生代
谢物质,具有特殊的理论和现实意义(于树宏等,
%’’()。
利用雷公藤组织培养生产次生代谢产物的研究
并不多见(李耀维等,#$$$;尹作鸿等,%’’#;)*+,-
!" #$.,#$$/;0121-3 !" #$.,%’’()。本研究通过对基
本培养基的筛选和对培养条件的优化试验,旨在筛
选雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量较高的
培养基及培养条件,为进一步进行组织培养生产雷
公藤内酯醇和雷公藤总生物碱奠定基础。
%! 材料与方法
!" !# 试验材料
试验用雷公藤植物采自福建省泰宁地区,取其
% 年生枝条,扦插于苗床上,新长出的幼茎高度达 "
45 时取叶、幼茎及 % 个月后长出的新根作为外植体
进行愈伤组织诱导,形成愈伤组织在 &,678 9 %: $
5;·< = %#,/7> 9 $: " 5;·< = %?@ 培养基上连续培养 "
代以上,形成的各种愈伤组织作为供试材料。除不
同愈伤组织种类对雷公藤愈伤组织生长和雷公藤内
酯醇及雷公藤总生物碱含量的影响试验中用幼茎及
叶愈伤组织外,其余愈伤组织均为根诱导形成的愈
伤组织。
!" $# 仪器与药剂
日本岛津 测器。C8%#$7$# 型紫外 D可见分光光度计(日本岛
津)。雷公藤内酯醇标准品(批号 %"&&7#$$#$%,纯
度 ’"E)由中国药品生物制品鉴定所提供。雷公藤
总生物碱,由西北农林科技大学无公害农药研究服
务中心提供,为本课题组从雷公藤根皮中提取得到,
经光谱鉴定结构 F)’"E。甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,色
谱纯),水为超纯水,#,/ = 二氯苯氧乙酸(#,/7>)
(上海试剂四厂,化学纯),& =糠胺基嘌呤(?@)( G-
8,HI3 >,1;-3JH,4K5 L1-M1-N G-HOI-1H,3-1M G-4.,化学
纯),蔗糖(广东西陇化学试剂有限公司,分析纯),
乙酸乙酯(西安化学试剂厂,分析纯),其他试剂均
为分析纯。
!" %# 培养基及培养条件筛选
采用 PL,Q",0@,F,% D #PL,&,678(8OM,2R !" #$.,
%’6$)及 ST,HO 培养基,分别添加 %: $ 5;·< = %#,/7>
和 $: " 5;·< = % ?@。检测不同 +F 值、光照条件、接
种量、不同外植体以及培养时间对愈伤组织生长和
雷公藤内酯醇及总生物碱含量的影响,试验采用 0@
培养基加入 %: $ 5;·< = %#,/7> 和 $: " 5;·< = %?@。
以上培养基,加入蔗糖 U$ ;·< = %,用琼脂 &
;·< = %固化,+F 用 )FL7#A 型酸度计高压灭菌前调
至 ": ((培养基 +F 值对愈伤组织生长及雷公藤内酯
醇和总生物碱含量的影响除外)。试验每个处理接
种 U$ 瓶,每瓶接种大小基本相近的愈伤组织 U 块,
总鲜质量控制在 $: U V $: / ;(不同接种量对雷公藤
愈伤组织生长的影响除外)。培养室温度( #" W
%)X,不同光照条件试验的光照强度为 % $$$ V
% "$$ MY,其余为自然光照。培养 "$ 天后收获(不同
培养时间对愈伤组织生长和雷公藤内酯醇及总生物
碱含量的影响试验每 " 天收获 % 次),冷冻干燥至恒
质量,粉碎过 &$ 目筛并计算愈伤组织增长量(愈伤
组织增长量 Z 收获量 D瓶 =接种量 D瓶)。
愈伤组织褐化级别:% 级:轻度褐化,愈伤组织
底部及培养基呈淡黄色;# 级:褐化,愈伤组织底部
及周围培养基呈黄褐色;U 级:较严重褐化,愈伤组
织底部及周围培养基呈褐色;/ 级:严重褐化,愈伤
组织底部及周围培养基呈黑褐色。
!" &# 次生代谢产物含量的测定
%: /: %! 样品的制备 ! 精密称取雷公藤愈伤组织样
品 % ;,置磨口三角瓶中,加入乙酸乙酯 #$ 5< 浸泡
过夜,超声提取 /$ 5,-,过中性氧化铝柱(含 U ; 中
性氧化铝,玻璃柱 % Z %: $ 45),然后用 #$ 5< 乙酸
乙酯冲洗柱子,合并洗脱液,减压回收乙酸乙酯至
干,用流动相溶解并定容至 " 5< 容量瓶中。
%: /: #! 雷公藤内酯醇的测定 ! 采用高效液相色谱
(F)A%(,/: & 55 [ #"$ 55," !5;流动相:甲醇 \水体积
分数为/"\ "";流速:% 5<·5,- = %;检测波长:#%(
-5;以雷公藤内酯醇为标准品,其回归方程为 & Z
/& (&&’ = %$ 66%,(# Z $: ’’’ ’。
%: /: U! 雷公藤总生物碱的测定 ! 紫外分光光度法
测定总生物碱的含量,将提取液用 /"E 甲醇稀释
%$ V U$倍,用紫外 D可见分光光度计在 #&( -5 波长
下进行比色测定吸光度(李琰等,#$$’);以总生物
碱为 标 准 品,其 回 归 方 程 为 & Z $: $$( 6’ =
$: $$( %,(# Z $: ’’’ (。
"&
林 业 科 学 !" 卷 #
$ # 结果与分析
!" #$ 基本培养基对雷公藤愈伤组织生长和次生代
谢产物含量的影响
组织培养的培养基一般可以分为含盐量高的
(%&)、高硝酸钾的( ’()、中等无机盐的( )*,+,
, - $%&,",./0)和低盐的(12345)! 种类型,不同类
型的培养基对雷公藤愈伤组织增长量和次生代谢产
物含量的影响有明显差异(表 ,)。愈伤组织的增长
量在 ",./0 培养基上高于其他类型培养基,且在这
种培养基上的愈伤组织生长旺盛、质地疏松、富有光
泽,褐化程度也比其他培养基轻,但在这种培养基上
雷公藤内酯醇及总生物碱含量较低,其中雷公藤内
酯醇含量为 )* 的 , - 6,适合愈伤组织继代保存。
)* 培养基上雷公藤内酯醇含量较高,但愈伤组织增
长量不及 ",./0 培养基,褐化程度也较 ",./0 培养
基严重。%& 和 ’( 培养基上生长的愈伤组织致密、
褐化严重,不适宜进一步继代培养。低盐的 12345
培养基上愈伤组织生长最差,生长量仅为 ",./0 的
, - $,但雷公藤内酯醇及总生物碱含量最高,褐化也
较 ",./0 轻。权衡愈伤组织生长、雷公藤内酯醇及
总生物碱产量,使用 )* 培养基较为合适。
表 #$ 基本培养基对雷公藤愈伤组织生长和雷公藤内酯醇及总生物碱含量的影响!
%&’( #$ )**+,-. /* ’&.0, 1+20& /3 ,&445. 67/8-9 &32 .+,/32&7: 1+-&’/40-+. ,/3-+3- /* !" #$%&’()$$
基本培养基
’7839 :5;3<:
增长量
=>9?5:5>4(@1)-( A·BC78D E ,)
雷公藤内酯醇含量
*?3F4GC3;5 9G>45>4 -(!A·A E ,)
总生物碱含量
*G47C 7CD7CG3;8 9G>45>4 -(:A·A E ,)
褐化级别
’?GH>3>A ;5A?55
%& IJ ", K IJ I,I L ,,J $I $J $! !
’( IJ (( K IJ I,I 9 ,,J I( 6J M( !
)* IJ (N K IJ I,( L ,$J $. $J ,$ 6
+ IJ !. K IJ I,$ 5 !J N, 6J ,6 6
, - $%& IJ (, K IJ I,I ; !J $N $J (, 6
",./0 IJ "! K IJ I$I 7 !J I" $J "M $
12345 IJ 6I K IJ I$" B $$J IM (J ". ,
# # "表中数据为 6 次重复的平均值。不同字母表示经 @<>97> 氏新复极差测验差异显著(! O IJ I()。下同。@747 3> 425 9GC<:> 7?5 425 :57>8
GB 42?55 ?5F54343G>8P @3BB5?5>4 C5445?8 3> 425 9GC<:>8 82GH 83A>3B397>4 ;3BB5?5>95 74 !IJ I( LQ @<>97>R8 :图 ,# F+ 值对雷公藤愈伤组织生长的影响
S3AP ,# TBB5948 GB ;3BB5?5>4 F+ G> 97CC<8 A?GH42 GB "# $%&’()*%%
!" !$ 培养基 ;< 值对雷公藤愈伤组织生长和雷公
藤内酯醇及总生物碱含量的影响
培养基 F+ 值通过影响细胞对离子的吸收,进
而影 响 细 胞 的 生 长 和 次 生 代 谢 产 物 的 合 成
(%7?892>5?,,NN()。本试验中 . 种 F+ 值的培养基
对雷公藤愈伤组织增长量、雷公藤内酯醇含量及总
生物碱含量影响差异较大(图 ,,$)。当 F+ 值为
(J M 时,雷公藤愈伤组织增长量达最大值,然后随
F+ 值升高而下降。雷公藤内酯醇的合成适合偏碱
性的环境条件,含量在 F+"J . 时较高;而总生物碱
的合成适合偏酸性的环境条件,含量随 F+ 值升高
而下降,在 F+(J $ 时最高;此时愈伤组织增长量仅
为 F+(J M 时的 "!U。
图 $# F+ 值对愈伤组织中雷公藤内酯醇及
总生物碱含量的影响
S3AP $# TBB5948 GB ;3BB5?5>4 F+ G> 4?3F4GC3;5 7>; 4G47C
7CD7CG3;8 9G>45>4 GB "# $%&’()*%% 97CC<8
!" =$ 不同光照条件对雷公藤愈伤组织生长和雷公
藤内酯醇及总生物碱含量的影响
试验中设计了 ! 种光照处理条件(表 $),暗培
养的愈伤组织增长量、雷公藤内酯醇及总生物碱含
量均最高,褐化程度较轻,但培养的愈伤组织呈乳白
色、无光泽,不适合进一步继代培养。自然光照与
,$ 2·; E ,光照培养的愈伤组织质地疏松,颗粒状,适
合进一步继代培养,但自然光培养的愈伤组织雷公
藤内酯醇及总生物碱含量均较 ,$ 2·; E ,光照高。在
""
! 第 " 期 李 ! 琰等:培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
连续光照条件下,愈伤组织逐渐失去光泽,生长速度
缓慢,致密,褐化程度严重,该条件也不利于雷公藤
内酯醇和总生物碱的形成。雷公藤内酯醇、总生物
碱等有效成分主要集中在根皮中,可见,有效成分积
累已完全适应了黑暗的环境条件。
表 !" 不同光照条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
#$%& !" ’(()*+, -( ./01+ -2 *$..3, 04-5+1 $26 ,)*-26$47 8)+$%-./+), *-2+)2+ -( !" #$%&’()$$
光照
#$%&’
增长量
()*+,-,)’(./)0
( %·12345 6 7)
雷公藤内酯醇含量
8+$9’:2$;, *:)’,)’ 0
(!%·% 6 7)
总生物碱含量
8:’32 32532:$;4 *:)’,)’ 0
(-%·% 6 7)
褐化级别
<+:=)$)% ;,%+,,
自然光照 >3’?+32 2$%&’$)% @A B@ C @A @7@ 3 7DA EF DA 7B G
暗培养 .3+5 @A B7 C @A @7D 3 D@A @F GA DH 7
7D &·; 6 7光照 7D &·; 6 7 2$%&’ @A "H C @A @7D I FA FD 7A EG G
!9 :" 不同愈伤组织种类对愈伤组织生长和雷公藤
内酯醇及总生物碱含量的影响
以雷公藤根、幼茎及叶为外植体诱导的愈伤组
织,在同样培养基上连续继代培养多代以后,根愈伤
组织逐渐变得疏松、颗粒状,而茎、叶愈伤组织致密、
呈块状,褐化严重。产生这种情况的原因可能是不
同生长部位、不同生理状态的外植体材料酚类物质
的含量及 JJK 的活性上有所差异(付影等,D@@H)。
根愈伤组织增长量、雷公藤内酯醇含量也明显高于
茎、叶愈伤组织(表 G),而叶愈伤组织中总生物碱的
含量明显高于根、茎愈伤组织中的含量。而在雷公
藤植株中雷公藤内酯醇及总生物碱主要存在于根
部,根皮中雷公藤内酯醇及总生物碱的含量显著高
于其他部位(杨春欣等,D@@7;戴克敏等,7LLE)。一
般次生代谢产物含量高的植物或器官诱导出的愈伤
组织次生物质的含量也高(李琰等,D@@E;李春斌
等,D@@G;M):I2:*&,7LFD),而在雷公藤中并不完全
一致,可见次生代谢产物形成的复杂性。
表 ;" 不同愈伤组织种类对愈伤组织中雷公藤内酯醇及总生物碱含量的影响
#$%& ;" ’(()*+, -( +),+ *$..3, -2 *$..3, 04-5+1 $26 +4/<+-./6) $26 +-+$. $.=$.-/6, *-2+)2+ -( !" #$%&’()$$
愈伤组织种类
8,4’ *322?4
增长量 ()*+,-,)’
(./)0( %·12345 6 7)
雷公藤内酯醇含量
8+$9’:2$;, *:)’,)’ 0(!%·% 6 7)
总生物碱含量
8:’32 32532:$;4 *:)’,)’ 0(-%·% 6 7)
褐化级别
<+:=)$)% ;,%+,,
根 N::’ @A "L C @A @@B 3 7DA E@ DA DD G
茎 O&::’ @A "G C @A @7@ I FA FE 7A H" E
叶 #,31 @A "E C @A @@B I FA @E GA "B E
图 G! 不同接种量对雷公藤愈伤组织生长的影响
P$%Q G! R11,*’ :1 ;$11,+,)’ $):*?23’$)% S?3)’$’T
:) *322?4 %+:=’& :1 !" #$%&’()$$
!9 >" 不同接种量对雷公藤愈伤组织生长的影响
由图 G 可知,接种量在 @A 7" U @A GF % 之间,雷
公藤愈伤组织的增长量随接种量的增加而增加,当
接种量超过 @A GF % 后,愈伤组织的增长量趋于平
稳,因此在 7@@ -# 三角瓶中,雷公藤愈伤组织接种
量控制在 @A GF % 时,愈伤组织增长量为最大值。愈
伤组织的生长状态也与接种量有关,接种量不足时,
到达对数期所经历的时间明显延长,接种量过大,营
养供给不足,愈伤组织生长时间缩短,且褐化加重。
!9 ?" 培养时间对愈伤组织生长和雷公藤内酯醇及
总生物碱含量的影响
雷公藤愈伤组织的生长曲线大致呈 O 形(图 E,
")。生长延迟期较长,接种后第 7" 天进入对数生
长期,在 7" U E@ 天期间,愈伤组织生长速度明显加
快,E@ U "@ 天处于生长平稳期,"@ 天后开始逐渐下
降。所以雷公藤愈伤组织最适继代时间为 E@ U E"
天。雷公藤内酯醇含量在培养到第 "" 天时达到最
大值,总生物碱的含量随着培养时间的延长而持续
增加,但产量在第 "@ 天时也可以达到最高,这是由
于产量是由愈伤组织增长量及次生代谢产物含量共
同决定的;虽然在培养到第 "" 天时雷公藤内酯醇含
量达到最大值,但其增长量已开始下降,在第 "@ 天
即对数期末期,总积累量达最大,故本试验采取产量
最高的阶段,即生长到第 "@ 天时收获愈伤组织。当
愈伤组织增长量达到最大值时,雷公藤内酯醇和总
HB
林 业 科 学 !" 卷 #
生物碱的含量持续上升。说明了雷公藤愈伤组织细
胞中雷公藤内酯醇和总生物碱的合成与细胞生长是
不一致的。
图 !# 不同培养时间对雷公藤愈伤组织生长的影响
$%&’ !# ())*+, -) +./,.0* ,%1* -2 +3//.4 &0-5,6 -) !" #$%&’()$$
图 7# 不同培养时间对愈伤组织中雷公藤内酯醇
及总生物碱含量的影响
$%&’ 7# ())*+,4 -) +./,.0* ,%1* -2 ,0%8,-/%9* 329
,-,3/ 3/:3/-%94 +-2,*2, -) !" #$%&’()$$ +3//.4
;# 结论与讨论
不同培养基的无机元素浓度差异很大,对植物
细胞生长和次生代谢产物的形成必然会有较大的影
响(上官新晨等,<==";袁弟顺等,<==!)。一般认
为,高盐的培养基较适合愈伤组织的生长,低盐的培
养基较适合次生代谢产物的积累(上官新晨等,
<==")。而本试验中,高盐的 >?,@7 不仅对雷公藤
愈伤组织生长不利,褐化也比较严重,雷公藤内酯醇
的含量明显高于低盐培养基;而低盐的 ",ABC 培养
基较适合雷公藤愈伤组织的生长,褐化也比较低,雷
公藤内酯醇的含量明显低于高盐培养基。可见,不
同植物细胞生长及次生代谢所需的培养基是不
同的。
付影等(<==A)报道,培养基中无机盐浓度过高
可引起酚类外溢物质的大量产生,导致外植体褐变,
降低盐浓度则可以减少酚类外溢,从而减轻褐变。
无机盐中有些离子,如 >2< D,E.< D 是参与酚类合成
与氧化酶类的组成成分或辅因子,因此盐浓度过高
会增加这些酶的活性,酶又进一步促进酚类合成与
氧化。本试验所用的 A 种基本培养基中,比较其离
子浓度,可以看出:FG,H 等培养基的大量元素含量
要低于 >?,@7 培养基,褐化程度也较 >?,@7 培养基
轻,",ABC 培养基中大量元素又偏低于 FG,H 等中
等无机盐的培养基,褐化程度也较中等无机盐轻。
可见,为了抑制褐变,使用低盐培养基,可以收到较
好的效果。
培养条件如光照对褐变及次生代谢也有影响。
有研究结果表明,很多植物经过暗培养预处理可减
轻组织培养外植体褐变(印芳等,<==";杨博等,
<==;;高蓉等,<==I)。在雷公藤愈伤组织培养中,
发现光照越强愈伤组织的褐变也越严重,而黑暗可
以抑制褐变的发生。光照强度主要通过影响次生代
谢途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶和查尔酮合成酶等
的活性及苯丙氨酸解氨酶基因的表达而影响次生代
谢物的合成和积累(谢灵玲等,<===)。叶和春等
(IJJI)发现,光照对新疆紫草(*+,-$. ,/01(’+.)愈
伤组织紫草宁衍生物的形成有强烈抑制作用。在栽
培条件下,光照强度的减弱诱导总生物碱的积累,而
使植物组织中的总生物碱含量增加(H3*&*/* ,2 .%’,
IJJJ)。本试验中,随着光照强度的增加不仅愈伤组
织的生长受到了抑制,雷公藤内酯醇及总生物碱的
合成也明显受到了抑制。詹亚光等(<==A)在沙枣
(3%.,.45/6 .54/62$&’%$. )愈伤组织培养中发现,暗培
养的沙枣愈伤组织增长比光照下大,分裂产生的细
胞大、排列疏松,原儿茶酸含量也比光照培养高得
多,说明暗培养更有利于原儿茶酸的积累。本试验
也得出了类似的结论。
参 考 文 献
戴克敏,王 # 艳 ’ IJJ!’不同地区药用部位雷公藤和昆明山海棠的总
生物碱含量测定 ’中成药,I"(II):!I K !<’
付 # 影,荣俊冬,陈礼光,等 ’ <==A’ 植物组织培养中褐变问题研究进
展 ’亚热带农业研究,;(;):IJ= K IJ7’
高 # 蓉,赵博光 ’ <==I’防止黑松外植体及其愈伤组织褐变的方法 ’ 南
京林业大学学报:自然科学版,<7(7):A7 K AA’
李春斌,王关林,岳玉莲,等 ’ <==;’ 培养条件对银杏悬浮培养细胞黄
酮合成影响研究 ’大连理工大学学报,!;(;):李 # 琰,董娟娥,姜在民,等 ’ <==!’ 杜仲愈伤组织中次生代谢产物积
累动态研究 ’西北植物学报,李 # 琰,冯俊涛,王永宏,等 ’ <==L’ 雷公藤愈伤组织诱导及杀虫活性
研究 ’西北农林科技大学学报:自然科学版,;"(7):I=; K I=L’
李 # 琰,冯俊涛,史晓燕,等 ’ <==J’ 雷公藤组培产物中雷公藤甲素和
总生物碱含量的测定 ’农药学学报,II(;):;"A K ;A<’
李耀维,冯文新,武增寿,等 ’ <===’ 激光诱变选育雷公藤次生物质高
L"
! 第 " 期 李 ! 琰等:培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
产细胞系 #激光生物学报,$(%):&’( ) &’%#
罗都强,秦建春,张 ! 兴 # &**(#雷公藤甲素对粘虫中肠消化酶及其组
织结构的影响 #西北农林科技大学学报:自然科学学版,&$(+):
", ) +*#
上官新晨,郭春兰,杨武英,等 # &**+# 培养基及培养条件对青钱柳愈
伤组织生长和黄酮含量的影响 # 福建农林大学学报:自然科学
版,-+(+):"’’ ) "$&#
夏 ! 焱,段宏泉,张铁军,等 # &**"#雷公藤属药用植物的研究进展 # 中
草药,-+(,):(*$- ) (*$+#
谢灵玲,赵武玲,沈黎明 # &***# 光照对大豆叶片苯丙氨酸裂解酶
(./0)基因表达及异黄酮合成的调节 #植物学通报,(,("):%%-
) %%$#
杨 ! 博,韩振海,张 ! 永,等 # &**-# 不同光照强度对玫瑰组织培养中
初代培养物褐化的影响 #中国农学通报,($(+):($% ) ($+#
杨春欣,周庭川,秦万章 # &**(# 雷公藤内酯醇不同季节的含量变化 #
中国医院药学杂志,&((():&" ) &+#
叶和春,尹作鸿,李国凤,等 # ($$(# 不同理化因子对新疆紫草愈伤组
织生长及紫草宁生物合成的影响 # 植物学报,--( (&):$&,
) $-(#
尹作鸿,朱蔚华 # ($$&#雷公藤愈伤组织悬浮培养的研究 #生物工程学
报,’(():$" ) $’#
印 ! 芳,葛 ! 红,彭克勤,等 # &**+#酚类物质与蝴蝶兰褐变关系初探 #
园艺学报,--("):((-, ) ((%*#
于树宏,李 ! 玲,何晓明 # ($$’# 利用细胞培养技术提高次生代谢物
的产量 #生物学通报,--(,):%* ) %&#
袁弟顺,林丽明,孙威江,等 # &**%# 不同品种茶树愈伤组织的培养与
茶氨酸的积累 #福建农林大学学报:自然科学版,--(&):(,’ )
(’(#
詹亚光,宋继园,王巍巍 # &**,#暗培养对沙枣愈伤组织中原儿茶酸含
量的影响 #植物生理学通讯,%-("):$"%#
周 ! 琳,冯俊涛,马志卿,等 # &**+# 雷公藤总生物碱对粘虫的生物活
性 #植物保护学报,--(%):%*( ) %*+#
1234353 6 7,89:355 8 ; <# ($$$# =3>3?@A 2>B 3>C@D9>E3>?25FG2H3B
C2D@2G@5@?I @> H3A9>B2DI E3?2G95@?3 532J A9>?3>? 9J !"#$%&’()#&
*))+*,+*# 2>B !- *).+$( /H?3D2A323): / ?3H? 9J ?K3 D3H9LDA3
2C2@52G@5@?I KIM9?K3H@H3# N@O9H,’":&-% ) &%+#
P>9G59AK P 1# ($’&# <3B@LE 2>B 5@4K?F@>BLA3B J9DE2?@9> 9J H3DM3>?@>3
2>B 2>?K9AI2>@>H A355 HLHM3>H@9> AL5?LD3 9J /*’0*,*$’01&#
.KI?9AK3>,&((-):"$( ) "$%#
<2DHAK>3D 1# ($$"# <@>3D25 >L?D@?@9> 9J M52>?# 09>B9> 12DA9LD? 6D293 Q
R9EM2>I .5LG5@HK3DH,((#
;2O2>9 P,S9HK@B2 R,7LDLO2:2 T,#’ *)# ($$’# U3DM3>9@BH @>
?D2>HJ9DE3B D99? AL5?LD3 9J 2,+.’#,(3+14 5+)6%,"++# .KI?9AK3E@H?DI,%$
(+):(’&( ) (’&%#
.VM@> < 7,RK2C2D@3 R,/DAK2EG2L5? W# &**%# =D9:?K 2>B @EE9G@5@X2?@9>
9J 2,+.’#,(3+14 5+)6%,"++ AL5?LD3B A355H# 6@9?3AK>95 6@93>4,-’((():
(&’" ) (&$(#
Y:@>453 T U,12553D 1 0,Y@3453D Z 1,#’ *)# ($%(# RK@>3H3 @>H3A?@A@B25
M52>? 2,+.’#,(3+14 5+)6%,"++ @>?D9BLA3B @>?9 ?K3 [>@?3B Y?2?3#
YA@3>A3,$-(&%*-):+* ) +(#
\35@OI ] /,<2D?@> Y <# ($,*# / J3DE3>?3D J9D M52>? A355 HLHM3>H@9>
AL5?LD3H# R2> W <@AD9G@95,(+(%):&&- ) &&+#
(责任编辑 ! 徐 ! 红)
$+