全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$% & % 年 # 月 林 业 科 学 ’()*+,)- ’)./-* ’)+)(-* /012!"!+02# ’345!$ % & %
文冠果悬浮细胞系的建立及细胞生长特性!
刘6磊&!$6顾玉红&6孟6坤&6王6莉&6黄6伟& "&2河北农业大学生命科学学院6保定 %8&%%%#$2石家庄市第十八中学6石家庄 %>%&%%$摘6要!6以文冠果成熟种胚诱导的愈伤组织为材料!进行悬浮培养细胞系的建立及细胞生长特性的研究% 结果 表明& 文冠果细胞悬浮培养的初始接种量在 &%% J.三角瓶 !% J.液体培养基中以$2% F为宜!最适激素浓度以
$!!Y@!"Y?-!+--均为 %2> JF).=&为宜!细胞活力在接种第 7 天时达到最大!细胞分裂指数在接种第 &% 天时达到 最大!鲜质量增长量在第 &! 天时达到最大% 关键词&6文冠果# 悬浮培养# 接种量# 激素# 细胞生长特性 中图分类号! ;#!$666文献标识码!-666文章编号!&%%& =8!<<#$%&%$%# =%%8# =%>
收稿日期& $%%# =%8 =&!# 修回日期&$%%# =&& =7%%
基金项目& 河北农业大学博士基金"$%%>&%%<$ %
!顾玉红为通讯作者%
K/’-9$#/,A)*’"1!&/B)*/#"*+)$+&$’&()/-*=+)$5("<’,+,-(-.’)(#/’#./
"1?%(1,6#$2%**62>"96&"% .IH .3I&!$6WH CHD0EF&6b3EFlHE&6MLEF.I&69HLEFM3I&
"&O=’/"0"’*$4*"6.4"1."!70(4.;/);(%/J143"(,4)#’*@"&"46>%’2410 %8&%%%#$OG’O&< @409 F422/"6.9’’/’*694?4%Q9;%106694?4%Q9;%10 %>%&%%$89/’(-.’&6’HT43ETI0EYUH1SHO3R U311IE3T0NT%1)9’."(%,6’(&4*’/4% Z3O33TSLX1ITD3R XPHTIEFUL1HTIERHU3R NO0JJLSHO3 3JXOP0T5WO0ZSD UDLOLUS3OITSIUT0NSD3U31UH1SHO3TZ3O3NHOSD3OTSHRI3R5,D3O3TH1STTD0Z3R SDLSSD304SIJHJIEISIL1 LJ0HES0NIE0UH1HJLJ0HESZLT$ FIE !% J.1IoHIR UH1SHO3J3RIHJ! LER SD304SIJHJU0EU3ESOLSI0E 0N41LESD0OJ0E3T
ZLT%2> JF).=& $!!Y@LER %2> JF).=& "Y?-LER %2> JF).=& +--! O3T43USIV31P5,D3DIFD3TSU31JIS0SIUIER3[ L443LO3R 0E RLP&%!SD3U31LUSIVISPZLTDIFD3TS0E RLP7!LER SD3NO3TD Z3IFDS43Lh3R 0E RLP&!5 :); <"(=/&6T%1)9’."(%,,’(&4*’/4%# THT43ETI0E UH1SHO3# IE0UH1HJLJ0HES# D0OJ0E3T# FO0ZIEFUDLOLUS3OITSIU0NU31 66 文冠果 "T%1)9’."(%,,’(&4*’/4%$ 为无患子科
"’L4IERLU3L3$文冠果属"T%1)9’."(%,$植物!是我国
特有的珍稀木本油料和药用植物!可治疗小儿遗尿
症"特格喜等!&##8$’心脏病’血管病等!具有抗癌 "王红斗!&##<$’抗艾滋病 "李在留等!$%%8# bL") %/5!$%%%# $%%!$活性% 种子可用于生产柴油’食用
油和高级润滑油 "朱丹等!&##8$!是国家重点生物 燃油树种!种仁含油率为 >>j _"8j% 目前!已有 文冠果体细胞胚"顾玉红等!$%%!$及其发生过程中 钙的超微细胞化学定位 "顾玉红等!$%%<$的研究! 为更好地利用它!还需建立稳定的悬浮培养细胞体 系并掌握细胞生长特性% 已有研究表明& 水翁 "=/"4,)’.%/#C$ "周英彪等! $%%8$’西洋参 "<%1%C
041,"10$"闫静辉等!$%%>$’桑树"F’5,%/&%$ "李勇
等!$%%8$及红豆杉 "L%C;,=941"1,4,$"刘华!$%%

$$悬浮细胞系的建立及其细胞生长特性的研究对快繁 及原生质体制备有重要作用% 本试验以文冠果种胚 为外植体诱导获得愈伤组织!对初始接种量’激素浓 度进行筛选!建立悬浮培养体系!并对该体系的细胞 生长曲线’细胞分裂指数’细胞活力等进行研究!旨 在获得稳定的悬浮培养体系并掌握细胞生长特性! 为原生质体的制备’细胞分裂研究等奠定基础!为开 展大规模培养文冠果细胞获得药用成分和油用资源 服务% &6材料与方法 >D>?试验材料 ! ‘下干燥贮藏的’成熟的文冠果种子% >DF?试验方法 &2$2&6接种与继代培养的方法6将洗净的种子在 超净台上用有效氯浓度为 !j _>j的 +L(1e7 溶液 消毒 &% JIE!无菌水漂洗 > 次# 再用 8>j的酒精溶 液消毒 & JIE!无菌水漂洗 7 次后用无菌水浸泡过 夜% 在超净台里剥去种皮!将种胚切成 %2> UJ7的 林 业 科 学 !" 卷6 碎块!接种到 ?> a$2% JF). =& $!!Y@ a$%2% F).=& 蔗糖 a>2> F).=&琼脂的培养基" 49>2<$上!培养 温度为"$> s&$‘!暗培养!此为初代培养% 将初代 培养 &> 天获得的愈伤组织 "图 & $ 转接到 ?> a &2% JF).=& $! !Y@ a &2% JF) .=& +-- a $%2% F).=& 蔗 糖 a>2> F).=& 琼 脂 的 培 养 基 "49>2<$上进行第 & 次继代培养!培养温度同上!弱 光% &> 天后进行第 $ 次继代培养!培养条件同第 & 次继 代 培 养! 培 养 &> 天 后 获 得 胚 性 愈 伤 组 织"图$$ %
图 &6接种 &> 天培养的愈伤组织
BIF5&6(H1SHO3R UL1HTNO0JSD3T33R IE SD3&> R
图 $6继代培养的愈伤组织 BIF5$6(L1HTNO0JTHXUH1SHO3
&2$2$6建立文冠果细胞悬浮培养体系的方法6文
冠果细胞悬浮培养的初始接种量的筛选& 分别称取
疏松的胚性愈伤组织 &2%!$2%!72%!!2% F!接种到装 有 !% J.液体培养基 "?> a%2> JF). =&$! !Y@
a%2> JF).=& "Y?- a %2> JF) .=& +-- a
$%2% F).=& 蔗糖!49>2<$的 &%% J.三角瓶中!每处
理接种 &> 瓶% 培养 &< 天后测定悬浮液中细胞的鲜
质量与干质量!按照以下公式计算增长率!并进行方
差分析% 观察悬浮细胞的生长状态%
增长率"j$i- "培养 &< 天后的细胞质量 = 初始接种量$A初始接种量. d&%%j%
文冠果细胞悬浮培养的外源激素浓度的筛选&
称取胚性愈伤组织 $2% F!接种到装有 !% J.液体培 养基"49>2<$的 &%% J.三角瓶中% 以 ?> 为基本培
养基!加 $%2% F).=&蔗糖!$!!Y@’"Y?-!+--的配比
见表 &% 每处理接种 &> 瓶!培养 &< 天后测细胞的
鲜质量与干质量!计算增长量"培养 &< 天后的细胞
克数 =初始接种的细胞克数$!进行方差分析% 观 察悬浮细胞的生长状态% 表 >?筛选文冠果悬浮细胞外源激素浓度的试验设计 4-9@>?4,)’)/’=)/#3*"1=#11)()*’,"(A"*)/."*.)*’(-’#"* "*’,).)$/&/B)*/#"*.&$’&() JF).=& 处理 ,O3LSJ3ES$!!Y@ "Y?- +--
l& %2% %2> %2>
l$%2> %2> %2> l7 &2% %2> %2> l! %2> &2% &2% &2$276文冠果悬浮细胞生长特性的研究方法6将
$2% F颜色鲜黄’质地疏松’分散性高的胚性愈伤组 织接种到装有 !% J.培养基 "?> a%2> JF). =&$!!Y@ a%2> JF).=& +-- a%2> JF).=& "Y?- a
$%2% F).=& 蔗糖! 49>2<$ 的 &%% J.三角瓶内!
@mY#%%型旋转摇床上 -<% O4J!"$> s&$‘.光照振
荡培养!7 天后用 <% 目细胞筛滤除大的细胞团块!
&< 天继代 & 次!7 _! 次后形成主要由单细胞和小型
细胞团组成的细胞悬浮系"图 7$!进行细胞生长特 性的研究% 图 76悬浮培养的细胞" d&%%$
BIF576’HT43ETI0E UH1SHO30NU31T" d&%%$细胞生长曲线的测定& 从培养的第$ 天起!每 $天取 & 次样直到 &< 天!每个样本 > 瓶!7 次重复!称 重法测细胞鲜质量!计算鲜质量增长量 "每次取样 的细胞克数 =初始接种克数$!以培养时间为横坐
标!增长量为纵坐标!绘制生长曲线%
细胞分裂指数的测定& 从培养的第 $天起!每$
天取 & 次样直到 &< 天!在载玻片上滴加细胞悬浮液
和 &j的醋酸洋红染液各 & 滴!盖上盖玻片!在酒精
灯上微热则细胞核被染上色而细胞质无色!于
e.Cbfc’ (K$& 型显微镜下观察细胞分裂情况并 照相!观察& %%%个以上细胞!记录分裂期细胞个数! %< 6第 # 期 刘6磊等& 文冠果悬浮细胞系的建立及细胞生长特性 计算细胞分裂指数 "分裂期细胞数A细胞总数 d&%%j$%
细胞活力的测定& 接种第 & _! 天每天取样!之
后每 $天取 & 次样直到 &< 天% 采用 ,,(法"BITUD3O ")%/5! &##>$% 将悬浮细胞过滤后!每试管加悬浮细
胞 7>% JF"鲜质量$’%2!j的 ,,(溶液$2> J.’
4982% 的磷酸缓冲液 $2> J.!混匀!$> ‘避光处理
&" _&# D!去上清液!加 > J.蒸馏水洗涤细胞!重复
7 次% 加 #>j的乙醇 > J.!"% ‘下水浴 7% JIE 后
室温下至细胞无色% 取上清液!用 c/Y$&%$(型分
光光度计在 !<> EJ下测吸光值!初始培养基按以上
程序操作用以调零% 吸光值越大!细胞的活力越强
",THOH0hL")%/5! &##"$%$6结果与分析
FD>?文冠果悬浮细胞系的建立
$2&2&6初始接种量对文冠果悬浮细胞培养的影响 初始接种量对文冠果悬浮细胞培养的影响见表$%
从细胞增长率看!初始接种量 &2% 和 $2% F处理之 间的差异不显著!但均极显著高于 72%!!2% F的处 理% 从生长状态来看!初始接种量为$2% F的细胞
团小且数量多!分散性好!悬浮液较为清澈# 初始接
种量为 72%!!2% F的细胞团数量较少!细胞次生代
谢产物和细胞碎片较多致使悬浮液浑浊% 因此!选
定 $2% F为文冠果悬浮细胞培养的最适初始接 种量% 表 F?初始接种量对文冠果细胞悬浮培养的影响! 4-9@F?K11).’"1<)#3,’"1#*#’#-$#*".&$&A "*.)$/&/B)*/#"*.&$’&() 初始接种量 M3IFDS0NIEISIL1 IE0UH1HJAF 增长率 WO0ZSD OLS3Aj 鲜质量6BM 干质量6@M 生长情况 WO0ZSD TSLSHT 细胞团情况 (31TIQ3LER EHJX3O 悬浮液浑浊度 ,HOXIRISP0NTHT43ETI0E &2% %28$7 8 - %2%"< # - 较好 W00R 小 .IS13’少 .IS13 清 (13LO3O
$2% %2887$ - %2%8% ! - 好 ?3TS 小 .IS13’多 bHUD 较清 (13LO
72% %2>$8 " ? %2%!# # ? 较好 W00R 小 .IS13’较少 .3TT 稍浑浊 bHRRP !2% %2>%!$ ? %2%!# " ? 差 M0OTS 大 ?IF’较少 .3TT 浑浊 bHRRI3O
66! 进行 @HEULE 新复极差检验!具不同字母表示差异显著!大写字母表示 %2%& 水平上的差异显著水平% b3LE T34LOLNI0ETZ3O343ON0OJ3R
HTIEFSD313LTSTIFEINIULESRIN3O3EU3J3SD0R! J3LET0NTLJ413TN010Z3R XPRIN3O3ESUL4ISL113S3OTLO3IERIULS33ESO3J31PTIFEINIULES1PRIN3O3ES".’@S3TS!
$2&2$6外源激素浓度对文冠果悬浮细胞培养的影
响6外源激素浓度对文冠果悬浮细胞培养的影响见
表 7% 从增长量看!由大到小依次为 l$!l&!l!!l7 处理!各处理间的鲜质量增长量均呈极显著差异!处 理 l! 和 l7 的干质量增长量极显著高于 l$ 和 l&%
从生长状态来看!处理 l$的生长好’细胞团小而 多’悬浮液较清% 综合考虑!选$!!Y@!"Y?-!+--
均为 %2> JF).=&的处理 l$为文冠果悬浮细胞培养 的最适激素浓度% 表 C?外源激素浓度对文冠果细胞悬浮培养的影响! 4-9@C?K11).’"1=#11)()*’,"(A"*)/."*.)*’(-’#"*/"*.)$/&/B)*/#"*.&$’&() 处理 ,O3LSJ3ES 增长量 WO0ZSDAF 鲜质量6BM 干质量6@M 生长情况 WO0ZSD TSLSHT 细胞团情况 (31TIQ3LER EHJX3O 悬浮液浑浊度 ,HOXIRISP0NTHT43ETI0E l& &28<8 < ? %2&"# 7 ? 较差 M0OT3 小 .IS13’少 .IS13 清 (13LO3O l$ $2%!> & - %2&#> # - 好 ?3TS 小 .IS13’多 bHUD 较清 (13LO3O l7 &2!#% & @ %2&!& " ( 好 ?3TS 小 .IS13’较多 .3TT 较清 (13LO l! &2>8> " ( %2&!# ! ( 差 M0OTS 大 ?IF’较少 .3TT 稍浑浊 bHRR3O FDF?文冠果悬浮培养细胞生长特性的研究$2$2&6文冠果悬浮培养细胞的生长曲线6由图 ! 可知& 文冠果悬浮培养细胞的生长曲线呈*’+型!即 增长量呈先上升后下降的趋势% 接种第 & _! 天为 延迟生长期!增长量很小# 第 > _&! 天为快速生长 期!增长量急剧增加# 第 &! 天增长量最大!其值为$2%$% ! F!第 &> _&< 天为生长减慢期!增长量下降%$2$2$6文冠果悬浮培养细胞分裂指数的变化6文
冠果胚性悬浮培养细胞的分裂情况见图 > _8!其细
胞的分裂指数随培养时间的变化如图 < 所示!呈先
图 !6文冠果悬浮细胞的鲜质量增长量随培养时间的变化
BIF5!6,D3UDLEF3T0NTO,’(&4*’/4% U31NO3TD
Z3IFDSIEUO3LT3RHOIEFSD3FO0ZSD 43OI0R
&<
林 业 科 学 !" 卷6
上升后下降的趋势% 接种第 & _$天未见细胞分裂! 之后细胞分裂指数急剧上升!并在第 &% 天达到最 大!其值为 >28j!第 && _&! 天细胞分裂指数急剧 下降!第 &> _&< 天细胞分裂指数缓慢下降% 图 >6细胞分裂间期" d!%%$
BIF5>6bIS0SIUIES3O4DLT3" d!%%$图 "6细胞分裂前期" d!%%$
BIF5"6bIS0SIU4O04DLT3" d!%%$图 86细胞分裂中期"-$’后期"?$’末期"($" d&%%$BIF586bIS0SIUJ3SL4DLT3"-$ ! JIS0SIULEL4DLT3"?$! JIS0SIUS3104DLT3"($ " d&%%$图 <6文冠果悬浮细胞的分裂指数随培养时间的变化 BIF5<6,D3UDLEF3T0NTO,’(&4*’/4% U31RIVITI0E IER3[RHOIEFSD3FO0ZSD 43OI0R$2$276文冠果悬浮培养细胞活力的变化6文冠果 悬浮培养细胞活力的变化如图 # 所示!呈先上升后 下降的趋势% 接种第 & _7 天的细胞活力急剧上升! 第 7 天达到最大值!第 ! _&< 天细胞活力逐渐下降% 图 #6文冠果悬浮细胞的活力随培养时间的变化 BIF5#6,D3UDLEF3T0NTO,’(&4*’/4% U31 VILXI1ISPRHOIEFSD3FO0ZSD 43OI0R 76结论与讨论 本研究表明& !% J.液体培养基中加$2% F文
冠果愈伤组织为宜% 这与 >% J.培养液中加入
$2% F皂质芦荟 "7/’",%D’1%(4%$愈伤组织为宜的结
果相近"周晓鹿等!$%%<$!说明植物细胞在液体培
养基中生长需要一定的细胞密度!从而形成细胞生
长所需要的生理环境% 细胞密度过低时!细胞生长
量低# 细胞密度过大!会因营养缺乏而使细胞过早
衰亡%
本研究表明& 文冠果悬浮培养细胞的生长曲线
呈*’+型!即增长量呈先上升后下降的趋势!第 &> _
&< 天为生长减慢期!增长量下降!认为在进行细胞
增殖时的继代周期以 &> _&< 天为宜% 这与水翁"周
英彪等!$%%8$’西洋参"闫静辉等!$%%>$’桑树 "李
勇等!$%%8$等悬浮细胞生长曲线的趋势一致% 说
明刚接种的细胞因需适应新的培养基环境导致增长
量很小!适应后增长量迅速增加!培养后期则主要因
营养缺乏而使细胞增长量下降% 文冠果悬浮培养细
胞的分裂指数呈先上升后下降的趋势!并在第 &% 天
达到最大!认为在进行细胞分裂方面的研究时以接
种第 &% 天左右取材为宜% 这与桑树悬浮细胞在接
种第 & 天未见细胞分裂!细胞分裂指数在接种第 &%
天达到最大值 >2&#j"李勇等!$%%8$的结果相近!
而与红豆杉悬浮细胞接种第 & _! 天未见细胞分裂!
细胞分裂指数在接种第 < 天达到最大值 72>华!$%%$$有异!由此可见& 虽然这 7 个物种的变化 趋势一致!但在时间上$ 种被子植物与裸子植物的
差别较大% 文冠果悬浮培养细胞的活力呈先上升后
下降的趋势!并在接种第 7 天达到最大!认为在进行
原生质体制备研究时以接种第 7 天取材为宜% 这与
桑树"李勇等!$%%8$’红豆杉"刘华!$%%$$等的结果$<
6第 # 期 刘6磊等& 文冠果悬浮细胞系的建立及细胞生长特性
一致!即生长延迟期细胞活力最高!快速生长期细胞
活力降低%
综合分析表明& 文冠果悬浮细胞在接种后有生
长延迟期需要适应新的培养基!此时细胞活力最大!
增长量最小!细胞分裂指数最低# 之后细胞分裂指
数剧增!细胞活力下降!增长量急剧增加!细胞进入
快速生长期!且细胞分裂指数的高峰比细胞增长量
的高峰早!说明增长量的增加主要来自于细胞的分
裂即细胞个数的增加!而不是细胞体积的增长%
参 考 文 献
顾玉红!高述民!郭惠红!等5$%%!5文冠果的体细胞胚胎发生5植物 生理学通讯! !%"7$ & 7&& =7&75
顾玉红!程朋军!高述民!等5$%%<5文冠果体细胞胚发生中钙的超微 细胞化学定位5林业科学!!!"<$ & >$=>>5 李6勇!邢6辉!张金芳!等5$%%85桑树悬浮细胞生长规律及其生理
特性的研究5蚕业科学! 77"&$& #& =#!5 刘6华5$%%$5悬浮培养红豆杉细胞活力及存活率与生长周期的关 系5生物学杂志! &<"&$ & &# =$%5 李在留!李凤兰!郑永唐!等5$%%85文冠果种皮中的香豆素类化合
物及抗 9)/Y& 活性研究5北京林业大学学报!$#">$ & 87 =<75
特格喜!乌力吉5&##85文冠果治疗遗尿症 &$% 例临床观察5中国民 族药杂志! "&$ & &$5 王红斗5&##<5文冠果的化学成分及综合利用研究进展5中国野生 植物资源!&8"&$ & &7 =&"5
闫静辉!张小兵!李亚璞!等5$%%>5西洋参悬浮细胞系的建立及其 生长特性的研究5河北省科学院学报!$$"!$ & $& =$"! 7"5
周英彪!王6瑞!肖冬光5$%%85水翁悬浮细胞系的建立及其悬浮培 养的生长特性5生物技术!&8"&$ & ""5
周晓鹿!李思良5$%%<5皂质芦荟细胞悬浮培养初探5北方园艺! "$$& &<< =&#$5
朱6丹!胡6群!李霞冰5&##85文冠果化学成分预试与综合利用的
研究5国土与自然资源究!&& "# =8&5
BITUD3Of?! (01IE b! lLO1TT0E W ?5&##>5,D3L14DLYF1HU0TIRLT3
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9)/Y& 4O0S3LT30NU0ETSISH3ESTNO0J SD3Z00R 0NT%1)9’."(%,
,’(&4*’/4%5k+LSfO0R! "7" $$& $7< =$!$5 bL(b! +LhLJHOL+! +LZLZI-! ")%/5$%%!5-E0V314O0S0I1HRLE3 T3ToHIS3O43E3NO0J SD3Z00R 0NT%1)9’."(%,,’(&4*’/4%5(DIE3T3 (D3JIUL1.3S3OT! &>"&$ & "> ="85 ,THOH0hL,! BHhHPLTH 9! )TDIb! ")%/5&##"5)EDIXISI0E 0NJ0HT3 SHJ0OJ3SLTSLTITZISD E0nIOIJPUIEYO31LS3R U0J40HERT5k0HOEL10N -ESIXI0SIUT! !#"$$ & &>> " &"&5
!责任编辑6王艳娜"
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