全 文 ：第 49 卷 第 5 期
2 0 1 3 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 5
May，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130518
收稿日期: 2012 － 10 － 31; 修回日期: 2013 － 02 － 03。
基金项目: 国家林业公益性行业专项(201104054) ; 国家自然科学基金项目(31200486)。
* 朱天辉为通讯作者。
2 种杨树可培养内生细菌的多样性和季节动态变化*
王 瑫1，2 李 永2 朴春根2 汪来发2 朱天辉1
(1. 四川农业大学林学院 雅安 625014; 2. 中国林业科学研究院森林生态与保护研究所
国家林业局森林保护学重点实验室 北京 100091)
摘 要: 为了解三倍体毛白杨和健杨 94 树干皮层组织中内生细菌的群落多样性和季节动态变化，利用
传统的细菌分离培养，结合 16 S rDNA 序列分析等方法对其进行分析。从 2 种杨树干部皮层中共计分离
纯化细菌菌株 532 株，分属于 26 属 47 种，2 种杨树内生细菌组成存在较大差异。其中，从三倍体毛白杨
中分离得到 18 属 30 个种，以根瘤菌属和芽孢杆菌属为优势菌群 ; 健杨 94 中分离得到 16 属 22 个种，以
根瘤菌属、微杆菌属为优势菌群。杨树干部皮层植物内生细菌的多样性丰富。2 种杨树内生细菌数量季
节变化规律总体表现为夏秋 2 季均高于冬春 2 季。2 种杨树在 4 个季节的优势菌群各不相同，随季节变
化而变化。
关键词: 杨树; 内生细菌; 季节变化; 多样性; 16S rDNA; 系统发育
中图分类号: S718. 83 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)05 － 0135 － 12
Diversity and Seasonal Fluctuations of Culturable Endophytic
Bacteria Isolated from Two Poplars
Wang Tao1，2 Li Yong2 Piao Chungen2 Wang Laifa2 Zhu Tianhui1
(1 ． College of Forestry，Sichuan Agricultural University Yaan 625014; 2. Key Laboratory of Forest Protection of State
Forestry Administration Research Institute of Forest Ecology，Enviroment and Protection，CAF Beijing 100091)
Abstract: In this paper traditional bacterial isolation and culture techniques，combined with 16S rDNA sequence
analysis，were used to investigate diversity of community structure and seasonal dynamics of endophytic bacteria in cortex
tissues of Populus tomentosa and P． × euramericana cv． Robusta 94． A total of 532 isolates were obtained from the two
poplars and their 16S rDNAs were sequenced and analyzed． Results showed that the isolates were classified into 26 genera
and 47 species． There was difference in the isolate composition between two poplars． The number of bacteria genera and
species isolated from P． tomentosa and P． × euramericana cv． Robusta 94 was much different． There were 18 genera and
30 species isolated from P． tomentosa，and Rhizobium and Bacillus were the most predominant，while there were 16
genera and 22 species from P． × euramericana cv． Robusta 94，Rhizobium and Microbacterium were the most widely
distributed and predominant． The results indicated that the community structure of plant endophytic bacteria was diverse in
the poplars． The seasonal variation in the number of bacterial isolates from the two poplars exhibited that endophytic
bacteria isolated in summer and autumn were more than in winter and spring． The dominant species of the bacterial
communities changed significantly with the seasonal fluctuation．
Key words: poplar; endophytic bacteria; seasonal fluctuation; diversity; 16S rDNA; phylogenetic diversity
1866 年，De Bary 首 次 提 出 了 内 生 菌
(Endophyte)的概念，认为凡是在植物体内的微生物
均为内生菌。1992 年，Kloepper 等(1992)提出植物
内生细菌 (Endophytic bacteria)是一类定殖于植物
内部且不引起植物病害的细菌。随着植物微生态系
统研究的深入，现在被大多数研究学者广泛接受的
植物内生细菌的定义是，在植物一生或至少一生中
的某个阶段能进入活体植物组织内，并不使植物组
林 业 科 学 49 卷
织的表型特征和功能发生变化的细菌称为内生细菌
(Wilson，1995)。近年来研究发现，内生细菌几乎
存在于所有健康植物体内，其可以增强或赋予宿主
抗病、抗干旱、固氮等能力，还可以促进植物生长、防
治植物病害以及修复重金属污染等 (姚领爱等，
2010; 卢昕等，2007)。因而，研究植物内生细菌的
群落多样性和数量消长规律对内生细菌开发和利用
具有重要意义。
目前，植物内生细菌的报道主要集中在草本植
物或木本植物的叶片、根系等部位，而对木本植物干
部组织的内生细菌报道相对较少。王爱华等
(2010)对柑橘(Citrus reticulata)健康植株和病株韧
皮部组织内生细菌的研究发现，二者存在明显差异，
但都获得了较为丰富的群落多样性组成。Safiyh 等
(2009)和 Fiona 等(2006)在对 Populus trichocarpa ×
deltoides cv． Hoogvorst 的内生细菌研究中，分离到一
些具有碳汇固定作用和促进植物新陈代谢，以及对
植物有修复作用的内生细菌。赵桂华等 (2007)开
展了南林 351 杨 ( Populus deltoides Harvard × P．
deltoides‘Lux’)、土耳其杨(P． deltoides‘S307-26’)
和天演杨(P． × euramericana)枝条内生真菌种类及
其分布情况的调查，但未涉及内生细菌研究。杨树
(Populus spp． )因其具有速生丰产、轮伐期短，容易
杂交和无性繁殖等特点成为世界上主要的用材林之
一。优良的杨树无性系品种，对解决木材短缺和
提供 大 量 造 纸 原 料 有 着 重 要 作 用 (王 战 等，
1988)。近年来，由于杨树栽植品种比较单一，降
低了对害虫大面积发生的抵御能力。为减轻杨树
害虫危害，韩一凡等培育出以健杨为外植体的转
Bt 基因欧美杨，即健杨 94 ( Populus × euramericana
cv． Robusta 94)，其具有抗食叶害虫及耐寒和速生
等特性 (李淑梅等，2008 )。三倍体毛白杨 ( P．
tomentosa)是朱之悌等采用染色体部分替换和染色
体加倍技术，将传统 38 条染色体的二倍体毛白
杨，改造为有 57 条染色体的三倍体新品种，具有
苗期短、速生、栽培周期短等一系列优点(朱之悌，
2002)。2 种杨树为我国新培育的优良品种，其内
生菌情况未见报道。本研究通过对 2 个杨树品种
树干皮层内生细菌的物种多样性、群落组成及其
优势种群季节动态变化规律的研究，了解这 2 种
经特殊改造的杨树体内潜在病原菌以及生防菌等
有益微生物的状况，为杨树病虫害防治、有益微生
物的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 材料采集 样品采集时间: 2010 年 7，10
月; 2011 年 1，4，7，10 月; 2012 年 1，4 月; 采集地
点为河南省濮阳市清丰县柳各乡窑厂杨树人工林
地，林龄为 6 ～ 7 年生，随机 3 点采样，每点选取健
株各 3 株，采样部位距地面 1 ～ 1. 2 m，采集 15 cm
× 5 cm 的三倍体毛白杨和健杨 94 树皮组织并做
好标记。装入无菌的自封袋中，带回中国林业科
学研究院森林生态环境与保护研究所植物病原与
病害治理实验室，保藏于 4 ℃冰箱，于 48 h 内进行
分离培养。
1. 1. 2 主要仪器及试剂 Longgene A200 PCR 仪，
Vilber 3000 凝胶成像系统，Nano drop1000 核酸测
定仪。
16S rDNA 片段扩增所用的 2 × PCR Master Mix
购自天根生化科技有限公司，通用引物由上海英潍
捷基生物技术有限公司合成，其余菌株分离所需试
剂均来自国产分析纯。
1. 1. 3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基(NA): 牛肉
膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，琼脂粉 15 ～ 20 g，蒸
馏水 1 000 mL，pH 7. 0，混匀分装后高压灭菌，用于
内生细菌分离培养。
胰蛋白胨大豆琼脂培养基( TSA): 胰蛋白胨
15 g，大豆蛋白胨 7. 5 g，氯化钠 30 g，琼脂粉 20 g，
蒸馏水 1 000 mL，pH7. 0，混匀分装后高压灭菌，用
于分离菌株纯化保藏。
1. 2 内生细菌的分离与纯化
采回的样品用无菌水冲洗干净，然后用无菌手
术刀片在三倍体毛白杨和健杨 94 的 3 个重复上分
别切取 1. 0 g 组织，共 3. 0 g，用 70% 的酒精消毒
30 s，无菌水洗 3 次后，再用 4%的 NaClO 消毒 3 min
后，无菌水洗 3 次，将最后一次洗涤液涂抹平板，30
℃黑暗培养 24 h，用于表面消毒的对照，检查表面消
毒是否彻底。
将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研
钵，加入灭菌的石英砂和 30 mL 无菌水，充分研磨振
荡培养 30 min，稀释 10 － 1，10 － 2，10 － 3，10 － 4共 4 个梯
度，分别吸取 100 μL 研磨液涂布 NA 平板，每个处
理 3 次重复，30 ℃黑暗培养 48 h，选取生长最为均
匀的梯度，进行平板计数。
依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、
表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落
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第 5 期 王 瑫等: 2 种杨树可培养内生细菌的多样性和季节动态变化
在 NA 平板上划线纯化，纯化后转接 TSA 斜面于
4 ℃保藏备用(方中达，1998; 东秀珠等，2001)。
1. 3 内生细菌的生理生化鉴定
采用优势度指数比较判断优势菌群。优势度计
算公式为: D = N /NT。其中 N 为分离的每属内生细
菌的种类数量，NT为分离到内生细菌的全部种类数
量。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》( John et al．，
1994) 和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，
2001)对所得的优势菌群进行形态和生理生化
鉴定。
1. 4 内生细菌的分子生物学鉴定
1. 4. 1 内生细菌 DNA 提取 用改良的 CTAB 法提
取细菌总 DNA: 将过夜培养的菌体用无菌水洗下，
12 000 r·min － 1离心收集菌体，加入 1 × TE、2%
CTAB 和 3 mol·L － 1 NaCl 溶液各 200 μL，振荡混匀
后经液氮 /沸水冻融法反复裂解 3 次，65 ℃ 水浴
10 min，加入等体积氯仿进行抽提，12 000 r·min － 1
离心 10 min，吸取上清液，加入 1. 5 倍体积无水乙醇
混匀后置于 － 20 ℃ 冷冻 20 min 以沉淀 DNA，
12 000 r·min － 1离心 15 min 后倒掉上清液，加入
70%乙醇清洗盐离子等杂质，晾干，加入 1 × TE 溶
解 DNA，置于 － 20 ℃备用。
1. 4. 2 内生细菌 16S rDNA 的扩增 16S rDNA 扩
增采用细菌通用引物( Julian et al．，1998): 27F (5-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 和 1492R ( 5-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3)。PCR 反应体系为
25 μL: 2 × PCR Master mix 12. 5 μL，引物各 1 μL，
模板 DNA 1 μL，加 ddH2O 补足 25 μL。PCR 反应程
序为: 94 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 变性 30 s，52 ℃ 退
火 45 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环; 72 ℃最后延
伸 8 min。反应结束后，取 3 ～ 4 μL PCR 扩增产物进
行 1% (W /V)的琼脂糖凝胶电泳检验。PCR 产物由
上海英潍捷基生物有限公司纯化后测序。
1. 4. 3 内生细菌 16S rDNA 鉴定及系统发育分析
将分离菌株 16S rRNA 序列与该种模式菌株序列进
行比较，相似性大于 97%的分离菌视为同种，小于
97%的视为未定种。测序结果在 EzBioCloud( http:
∥ eztaxon-e． ezbiocloud． net /) 和 BLAST ( http: ∥
www． ncbi． nlm． nib． gov / blast / blast． cgi)上进行同源
性分析比较。用 Clustal X 进行多序列比对，用
MEGA4. 0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)
软件包，采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析并
构建系统进化树，自展值 ( Bootstrap，1 000 次重复
检验)(卡依尔等，2011)。
2 结果与分析
2. 1 2 种杨树可培养内生细菌鉴定
2. 1. 2 2 种杨树可培养内生细菌鉴定结果 从分
离过程分析，2 种杨树皮层组织经过表面消毒后，最
后一次清洗的无菌水涂布 NA 平板，30 ℃培养 48 h
后未有菌落生长，可以认定分离到的菌株均为内生
细菌。根据菌落形态 (大小、色泽及边缘光滑与否
等)特征挑取单菌落进行分离、纯化及保藏，2 年共
分离纯化得到 532 个菌株(共 8 次，2 种杨树)。通
过 16S rDNA 序列同 EzBioCloud 网站比对鉴定，结
果显示，大多数菌株与已知模式菌株的序列相似性
在 97% ～ 100% 之间，分离菌株分属于 26 个属，47
个种。详细鉴定结果和优势菌群生理生化特征见表
1，2，3。
2. 1. 2 2 种杨树可培养内生细菌系统发育分析
本研究选取的具有代表性的 26 个属的 47 种内生细
菌，属于细菌域的 4 个大的系统发育类群: 即厚壁
菌门( Firmicutes)、线菌门 ( Actinobacteria)、拟杆菌
门( Bacteroidetes )、变形菌门的 α-变形菌纲 ( α-
Proteobacteria)和 γ-变形菌纲 ( γ-Proteobacteria)，其
中厚壁菌门的分离比例为 12. 3%，包括葡萄球菌属
(Staphylococcus)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、类芽孢菌
属(Paenibacillus) 3 个属; 放线菌门的分离比例为
16. 1%，包括微杆菌属 (Microbacterium)、纤维菌属
( Cellulomonas )、 壤 球 菌 属 ( Agrococcus )、
Amnibacterium、考克氏菌属 ( Kocuria )、小杆菌属
(Curtobacterium)、类诺卡氏菌属 (Nocardioides) 7 个
属; 拟杆菌门的分离比例最少，为 3. 7%，包括黄杆
菌属(Flavobacterium)1 个属; α-变形菌纲的分离比
例最多为 46. 9%，接近总分离比例的一半，包括甲
基杆 菌 属 ( Methylobacterium )、鞘 氨 醇 单 胞 菌
(Sphingomonas)、橙单胞菌属 ( Aurantimonas)、根瘤
菌属(Rhizobium)、副球菌属(Paracoccus)、玫瑰单胞
菌属(Roseomonas)、新鞘脂菌属(Novosphingobium)7
个属; γ-变形菌纲的分离比例次之，为 21%，包括志
贺 氏 杆 菌 ( Shigella )、Brenneria、肠 杆 菌 属
(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌
属(Pseudomonas)、藤黄单胞菌属( Luteimonas)、成团
泛菌属(Pantoea)、黄单胞菌(Xanthomonas)8 个属。
总之，2 种杨树的内生细菌以变形菌门的细菌为主
要类群，从基于 16S rDNA 序列构建的系统发育树
中可看出，2 种杨树树皮可培养内生细菌体现出较
为丰富的系统发育多样性(图 1，2)。
731
林 业 科 学 49 卷
表 1 三倍体毛白杨可培养内生细菌的群落结构和多样性
Tab． 1 The community structure and diversity of culturable endophytic bacteria from triploid Populus tomentosa
菌株编号
Strain No．
属
Genus
优势度
Dominance(% )
拉丁学名
Latin name
同源性
Similarity(% )
M1_1 /M2_1
MBY-hong
黄杆菌属
Flavobacterium(Fl)
5. 93 海泥黄杆菌
Flavobacterium oceanosedimentum ATCC 31317(T)
海泥黄杆菌 Flavobacterium oceanosedimentum ATCC 31317(T)
99. 779
99. 84
M3
M4_1
MBY2-B
葡萄菌属
Staphylococcus( St)
5. 77
Staphylococcus hominis subsp． novobiosepticus GTC 1228(T)
Staphylococcus warneri ATCC 27836(T)
Staphylococcus hominis subsp． novobiosepticus GTC 1288(T)
99. 856
100
99. 83
M5_1
4M5_2
甲基杆菌属
Methylobacterium(Me)
4. 74
Methylobacterium oryzae CBMB20(T)
Methylobacterium thiocyanatum DSM 11490(T)
99. 773
99. 618
10M2
8M3
微杆菌属
Microbacterium(Mi)
9. 80
Microbacterium marinilacus YM11_607(T)
黄色细杆菌 Microbacterium flavum YM18_098(T)
99. 853
99. 033
MBY3-C
10M3
纤维菌属
Cellulomonas(Ce)
10. 17 纤维单胞菌
Cellulomonas hominis DMMZ CE40(T)
纤维单胞菌 Cellulomonas hominis DMMZ CE40(T)
98. 676
99. 52
YM1_1
4M7
志贺氏杆菌属
Shigella( Sh)
5. 91 弗氏志贺菌
Shigella flexneri ATCC 29903(T)
弗氏志贺菌 Shigella flexneri ATCC 29903(T)
99. 855
99. 782
YM1_3
4M6
8M5
鞘氨醇单胞菌属
Sphingomonas( Sp)
6. 43
Sphingomonas aquatilis JSS7(T)
Sphingomonas yunnanensis YIM 003(T)
叶球鞘氨醇单胞菌 Sphingomonas phyllosphaerae FA2(T)
98. 864
99. 773
99. 696
YM4 Amnibacterium(Am) 1. 98 Amnibacterium kyonggiense KSL51201_037(T) 97. 645
4M1_1
4M3_2
橙单胞菌属
Aurantimonas(Au)
10. 23
Aurantimonas altamirensis S21B(T)
Aurantimonas frigidaquae CW5(T)
100
97. 043
4M4_2 壤球菌属
Agrococcus(Ag)
0. 65 Agrococcus terreus DNG5(T) 99. 851
8M1
MBY1-C
Brenneria(Br) 8. 52
Brenneria salicis LMG 2698(T)
Brenneria salicis LMG 2698(T)
99. 333
99. 34
10k4
MBY-5-3
MBY-5-4
MBY-4-2
根瘤菌属
Rhizobium(Rh)
15. 16
解纤维根瘤菌 Rhizobium cellulosilyticum ALA10B2(T)
Rhizobium nepotum 39 /7(T)
碱土根瘤菌 Rhizobium alkalisoli CCBAU 01393(T)
土壤根瘤菌 Rhizobium soli DS-42(T)
97. 643
99. 16
98. 2
98. 51
MBY1-A 肠杆菌属
Enterobacter(En)
0. 35 Enterobacter cowanii CIP 107300(T) 99. 62
MBY1-A 考克氏菌属
Kocuria(Ko)
0. 46 玫瑰色库克菌 Kocuria rosea DSM 20447(T) 99. 45
MBY1-B 假单胞菌属
Pseudomonas(Ps)
0. 43 Pseudomonas argentinensis CH01(T) 99. 62
MBY3-B 藤黄单胞菌属
Luteimonas(Lu)
0. 23 Luteimonas aestuarii FR1330(T) 99. 05
MBY-5-2 泛菌属
Pantoea(Pa)
0. 24 Pantoea rodasii LMG26273(T) 98. 92
MBY-5-1
MBY-9-1
MBY-9-2
MBY-9-3
芽孢杆菌属
Bacillus(Ba)
13
Bacillus aerophilus 28K(T)
Bacillus arabhattai B8W22(T)
Bacillus tequilensis 10b(T)
苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis ATCC 10792(T)
100
99. 84
99. 92
100
831
第 5 期 王 瑫等: 2 种杨树可培养内生细菌的多样性和季节动态变化
表 2 健杨 94 可培养内生细菌的群落结构和多样性
Tab． 2 The community structure and diversity of culturable endophytic bacteria from Populus × euramericana cv． Robusta 94
菌株编号
Strain No．
属
Genus
优势度
Dominance(% )
拉丁学名
Latin name
同源性
Similarity(% )
K1 /K3 假单胞菌属
Pseudomonas
2. 2 Pseudomonas psychrotolerans C36(T) 100
K2 /k5-1 / k7-2
K6_1
10k3
10k4
YK6
4k1_1 /4k11
根瘤菌属
Rhizobium
21. 75
溶纤维素根瘤菌 Rhizobium cellulosilyticum ALA10B2(T)
洪特拉根瘤菌 Rhizobium huautlense S02(T)
碱土根瘤菌 Rhizobium alkalisoli CCBAU 01393(T)
溶纤维素根瘤菌 Rhizobium cellulosilyticum ALA10B2(T)
碱土根瘤菌 Rhizobium alkalisoli CCBAU 01393(T)
洪特拉根瘤菌 Rhizobium huautlense S02(T)
98. 34
98. 87
98. 21
98. 25
98. 19
99. 25
k14_1
K4_1
10k7
YK3
4k6_2
鞘氨醇单胞菌属
Sphingomonas
6. 45
Sphingomonas yunnanensis YIM 003(T)
Sphingomonas jinjuensis YC6723(T)
Sphingomonas koreensis JSS26(T)
Sphingomonas desiccabilis CP1D(T)
Sphingomonas desiccabilis CP1D(T)
99. 78
97. 66
97. 20
100
100
JY-3 / JY-A 泛菌属
Pantoea
2. 52 Pantoea rodasii LMG26273(T) 98. 92
JY-4-2 黄单胞菌属
Xanthomonas(Xa)
2. 23 Xanthomonas gardneri ATCC19865(T) 100
k8_2 埃希氏杆菌属
Escherichia(Es)
0. 24 大肠杆菌 Escherichia coli KCTC 2441(T) 99. 71
k11 /K12_2
YK2
橙单胞菌属
Aurantimonas
11. 72
Aurantimonas altamirensis S21B(T)
Aurantimonas altamirensis S21B(T)
100
100
k12_1 /K13_1 纤维菌属
Cellulomonas
7. 93 Cellulomonas denverensis W6929(T) 99. 78
10k1 副球菌属
Paracoccus(Par)
0. 5 Paracoccus caeni MJ17(T) 98. 79
10k2 芽孢杆菌属
Bacillus
3. 48 坚强芽孢杆菌 Bacillus firmus NCIMB 9366(T) 99. 41
10K5 小杆菌属
Curtobacterium(Cu)
5. 02 萎蔫短小杆菌 Curtobacterium flaccumfaciens LMG 3645(T) 100
10K6 类诺卡氏菌属
Nocardioides(No)
9. 48 盐水类诺卡氏菌 Nocardioides salarius CL_Z59(T) 97. 99
JY-2 类芽孢杆菌属
Paenibacillus(Pae)
6. 36 Paenibacillus uliginis N3 /975(T) 97. 62
YK4
4k3_1∥4k13_1
微小杆菌属
Microbacterium
17. 84
Microbacterium radiodurans GIMN1. 002(T)
居土微杆菌 Microbacterium terricola KV_448(T)
99. 87
99. 73
YK7 玫瑰单胞属
Roseomonas(Ro)
1. 48 颈玫瑰单胞菌 Roseomonas cervicalis ATCC 49957(T) 98. 49
4k4_1 新鞘脂菌属
Novosphingobium(Nov)
0. 8 Novosphingobium panipatense SM16(T) 99. 09
931
林 业 科 学 49 卷
表 3 2 种杨树可培养内生细菌优势菌群形态及其主要生理生化特征
Tab． 3 The morphology，physiology and biochemical features of the
dominant culturable endophtic bacteria isolated from two poplars
优势菌群
Dominant genera
菌株编号
Strain No．
菌落颜色
Colour
细胞形态
Morphology
革兰氏
染色
Gram stain
过氧化
氢酶
Catalase
氧化酶
Oxidase
吲哚
Indole
柠檬酸盐
Citate
硝酸还
原作用
Nitrate
reduction
VP 反应
VP reaction
黄杆菌属
Flavobacterium
MBY-hong 橙色
Orange
杆状
Rod
－ － － － － － －
葡萄球菌属
Staphylococcus
M4-1 乳白色
Cream
球状
Spherical
+ + － + － － +
甲基杆菌属
Methylobacterium
M5-1 红色
Red
杆状
Rod
－ + + － + + －
微杆菌属
Microbacterium
8M3 黄色
Yellow
杆状
Rod
+ + － － + － +
纤维菌属
Cellulomonas
10M3 乳白色
Cream
杆状
Rod
+ + － ND + + －
志贺氏菌属
Shigella
YM1-1 灰白色
Grey-white
杆状
Rod
－ + － － － － －
鞘氨醇单胞菌属
Sphingomonas
4M6 黄色
Yellow
杆状
Rod
－ + + － ND + －
Amnibacterium YM4 黄色
Yellow
杆状
Rod
+ + + － － － －
橙单胞菌属
Aurantimonas
4M1-1 黄色
Yellow
杆状
Rod
－ + + － － － －
壤球菌属
Agrococcus
4M4-2 黄色
Yellow
短杆状
Short rod
+ + － － － － －
Brenneria MBY1-C 白色
White
短杆状
Short rod
－ + － － － + －
根瘤菌属
Rhizobium
MBY5-4 白色
White
杆状
Rod
－ + － － － － ND
肠杆菌属
Enterobacter
MBY1-A 乳白色
Cream
杆状
Rod
－ + － － + + +
考克氏菌属
Kocuria
MBY1-A 红色
Red
球状
Spherical
+ + － － － + －
假单胞菌属
Pseudomonas
MBY1-B 白色
White
杆状
Rod
－ + － － + + －
藤黄单胞菌属
Luteimonas
MBY3-B 黄色
Yellow
杆状
Rod
－ + + － + － －
泛菌属
Pantoea
MBY5-2 黄色
Yellow
杆状
Rod
－ + － － + + ND
芽孢杆菌属
Bacillus
MBY9-2 黄色
Yellow
杆状
Rod
+ + + + + + －
类芽孢杆菌属
Paenibacillus
JY-2 乳白色
Cream
杆状
Rod
+ + + － + + －
黄单胞菌属
Xanthomonas
JY-4-2 黄色
Yellow
杆状
Rod
－ + － － + － －
埃希氏菌属
Escherichia
k8-2 乳白色
Cream
杆状
Rod
－ + － + － + +
副球菌属
Paracoccus
10k1 乳白色
Cream
球状
Spherical
－ + + － － － －
小杆菌属
Curtobacterium
10k5 黄色
Yellow
短杆状
Short rod
+ + + － － － +
类诺卡氏菌属
Nocardioides
10k6 乳白色
Cream
杆状
Rod
+ + － + － － +
玫瑰单胞菌属
Roseomonas
Yk7 红色
Red
球状
Spherical
－ + + － － － －
新鞘脂菌属
Novosphingobium
4k4-1 黄色
Yellow
杆状
Rod
－ － － － + + －
① + : 阳性反应 Positive; － :表示阴性反应 Negative; ND:未测定 Non-determined．
041
第 5 期 王 瑫等: 2 种杨树可培养内生细菌的多样性和季节动态变化
图 1 利用 NJ 法基于 16S rDNA 序列构建三倍体毛白杨可培养细菌系统发育树
Fig． 1 Phylogenetic tree of culturable endophytic bacteria from triploid Populus tomentosa based on 16S rDNA using NJ method
2. 2 2 种杨树可培养内生细菌群落多样性
2. 2. 1 三倍体毛白杨可培养内生细菌群落结构
从三倍体毛白杨中分离得到的可培养内生菌属于
18 个属，共 30 个种。其中以根瘤菌属、芽孢杆菌
属、橙单胞菌属、纤维菌属 4 个属为主，分离率分别
为 15. 16%、13%、10. 23%、10. 17%，4 个属的总分
离比例超过 50%。三倍体毛白杨树皮中可分离内
生细菌优势菌群为根瘤菌属，共分离到 4 个种，分别
是解纤维根瘤菌、R． nepotum、碱土根瘤菌和土壤根
瘤菌。芽孢杆菌属居次，共分离到 4 个种，分别是解
纤维根瘤菌、B． arabhattai、B． tequilensis 和苏云金
芽孢杆菌。除了以上出现频率较高的优势细菌属以
外，还分离到了其他 14 个属的细菌，每个属内的菌
株数量虽然不多，但是能充分地反映三倍体毛白杨
中可培养内生细菌的多样性和群落结构的特征，详
细结果见表 1 和图 1。
2. 2. 2 健杨 94 可培养内生细菌群落结构 从健杨
94 中分离得到的可培养内生菌属于 16 个属，共 22
种细菌。以根瘤菌属、微杆菌属、橙单胞菌属、类诺
卡氏菌属 4 个属为主，分离率分别为 21. 75%、
17. 84%、11. 72%、9. 48%，4 个属的总分离比例接
近 60%。健杨 94 树皮中可分离内生细菌优势菌群
为根瘤菌属，共分离到 3 个种，分别是解纤维根瘤
菌、洪特拉根瘤菌和碱土根瘤菌。微杆菌属次之，仅
分离到 2 个种，分别是 Microbacterium radiodurans 和
M． terricola。此外，尽管鞘氨醇单胞菌属的分离比
141
林 业 科 学 49 卷
图 2 利用 NJ 法基于 16S rDNA 序列构建健杨 94 可培养细菌系统发育树
Fig． 2 Phylogenetic tree of culturable endophytic bacteria from Populus × euramericana cv．
Robusta 94 based on 16S rDNA sequences using NJ method
241
第 5 期 王 瑫等: 2 种杨树可培养内生细菌的多样性和季节动态变化
例只有 6. 45%，但却分离到 4 个不同的菌株，在种
类上远远多过其他优势菌群。除了以上出现频率较
高的细菌属以外，还分离到了其他 12 个属的细菌，
虽然每个属的菌株数量不多，但是也能充分地反映
健杨 94 中可培养内生细菌的多样性和群落结构的
特征，详细结果见表 2 和图 2。
2. 2. 3 2 种杨树可培养内生细菌群落结构差异性
从表 1 和图 1 可以看出，三倍体毛白杨和健杨 94 树
皮可分离内生菌存在较大差异，从三倍体毛白杨分
离得到的可培养细菌属和种均多于健杨 94。两者
的优势种群均为根瘤菌属，但是却只有 2 个相同种。
另外，2 种杨树都分离到且量较多的属为橙单胞菌
属，三倍体毛白杨中分离得到 2 个种( Aurantimonas
altamirensis 和 A． frigidaquae)，而健杨 94 中只分离
1 个种(A． altamirensis)。
2 种杨树均分离到但量较少的细菌属有: 假单
胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、橙单胞菌属、纤维菌属、芽
孢杆菌属、微杆菌属、成团泛菌属共 7 个属。
仅从健杨 94 中分离得到的细菌属有: 埃希菌
属、副球菌属、小杆菌属、类诺卡氏菌属、玫瑰单胞菌
属、新鞘脂菌属和类芽孢杆菌属共 7 个属。仅从三
倍体毛白杨中分离得到的细菌属有: 葡萄球菌属、
甲基杆菌属、Amnibacteriu、志贺氏杆菌属、壤球菌
属、Brenneria、肠杆菌属、考克氏菌属、黄杆菌属、藤
黄单胞菌属共 10 个属。可以明显地看出，2 种杨树
可分离内生细菌种群差异很大。
2. 3 2 种杨树内生细菌不同季节的动态变化
2. 3. 1 不同季节 2 种杨树内生细菌种类动态变化
对三倍体毛白杨和健杨 94 在不同季节可培养内生
细菌种类的分离结果表明(图 3)，这 2 种杨树在不
同季节内可培养内生细菌种类差异明显，经 2010 －
07—2012 － 04 的观察，结果显示，总体变化规律为
三倍体毛白杨各季节可培养内生细菌种类少于或与
健杨 94 持平，健杨 94 各季节分离种属多在 5 种以
上，而三倍体毛白杨各季节分离种属则在 3 种以上。
二者在不同季节各分离到的种属见图 3。
2. 3. 2 不同季节 2 种杨树内生细菌数量动态变化
三倍体毛白杨和健杨 94 在不同季节可培养内生细
菌数量分析表明(图 4)，这 2 种杨树在不同季节内
可培养内生细菌数量存在明显的差异变化，2010 －
07—2012 － 04 近 2 年的数据显示，可培养内生细菌
的总体变化规律为: 健杨 94 内生细菌夏季 ＞ 春季
＞秋季 ＞冬季，夏季可培养内生细菌数量达 1. 65 ×
106和 1. 45 × 106 cfu·g － 1; 三倍体毛白杨内生细菌秋
季 ＞夏季 ＞冬季 ＞ 春季，秋季可培养内生细菌数量
图 3 2 种杨树不同季节内生细菌种类动态变化
Fig． 3 Dynamics of species of culturable endophytic bacteria
in different seasons of two poplars
达 0. 86 × 106和 1. 08 × 106 cfu·g － 1。二者内生细菌
的变化规律并不一致，但总体表现为夏秋 2 季均高
于冬春 2 季。
图 4 2 种杨树不同季节内生细菌数量动态变化
Fig． 4 Dynamics of total amount of culturable endophytic bacteria
in different seasons of two poplars
2. 3. 3 不同种杨树间内生细菌种群多样性季节动
态 三倍体毛白杨和健杨 94 在不同季节可培养内
生细菌种类及其数量的分析结果表明，春季三倍体
毛白杨 的优 势 种群 是 橙 单胞 菌，分 离 比 例 为
40. 9% ;健杨 94 则是根瘤菌，但分离比例仅占
36. 5% ; 二者均分离到芽孢杆菌，其中三倍体毛白
杨中分离比例较高，占 33. 3%，而健杨 94 中分离比
例很低，只有 3. 80% (图 5-A)。
夏季三倍体毛白杨的优势种群是微杆菌，分离
比例仅占 21. 5% ; 健杨 94 则是纤维菌，分离比例为
41. 81% ; 二者均分离到了根瘤菌和鞘氨醇单胞菌。
三倍体毛白杨中根瘤菌的分离比例为 14. 65%，低
341
林 业 科 学 49 卷
于健杨 94 的分离比例 18. 05%，三倍体毛白杨中鞘
氨醇单胞菌的分离比例为 5. 65%，显著低于健杨 94
的分离比例 14. 98% (图 5-B)。
秋季三倍体毛白杨的优势种群是纤维菌，分离
比例较高，为 40. 69%，健杨 94 则是微杆菌，分离比
例为 40. 25% ; 二者均分离到了微杆菌和假单胞菌。
三倍体毛白杨中微杆菌的分离比例仅为 17. 65%，
而健杨 94 中微杆菌为优势种群，显著高于三倍体毛
白杨，三倍体毛白杨中假单胞菌的分离比例为
0. 93%，显著低于健杨 94 的分离比例 6. 70% (图 5-
C)。
冬季三倍体毛白杨和健杨 94 的优势种群均
是根瘤菌，2 个树种中分离比例都比较高，分别为
54. 19%和 46. 42% 。二者均分离到了鞘氨醇单
胞菌，分离比例分别为 7. 33% 和 19. 45% (图 5-
D)。
图 5 2 种杨树可分离内生细菌种类及其含量
Fig． 5 Diagram of genera and their total amount of culturable endophytic bacteria in different seasons of two poplars
A．春季 Spring; B．夏季 Summer; C．秋季 Autumn; D．冬季 Winter．代号的含义见表 1，2。The meaning of code is shown in Tab． 1，2
3 结论与讨论
本文首次研究了三倍体毛白杨和健杨 94 树皮
内生细菌群落结构及其优势种群的季节动态变化情
况，采用纯培养方法分别从不同季节的杨树树皮内
共分离到内生细菌 532 株，分属于 26 个属，共 47
种，其中从三倍体毛白杨中分离得到 18 属，30 个
种，健杨 94 16 属，22 个种，2 种杨树树干皮层具有
丰富 的 内 生 细 菌 多 样 性。 Safiyh 等 ( 2009 ) 从
Populus trichocarpa × P． deltoides 的根、芽上分离到
78 株内生细菌，分属于细菌 4 大类群，其中以变形
菌纲的细菌属种为优势属种，如肠杆菌属，单胞菌属
( Stenotrophomonas )，假 单 胞 菌 属 和 沙 雷 菌 属
(Serratia)等，并通过接种试验证明内生细菌对植物
新陈代谢有促进作用。卡依尔·玉素甫等(2001)从
胡杨(P． euphratica)中分离内生细菌 62 株，分属于
细菌 4 大类群，其优势菌群为假单胞菌属和芽孢杆
菌属。Izumi 等(2008)对樟子松(Pinus sylvestris var．
mongolica)、白桦(Betula platyphylla)和花楸( Sorbus
pohuashanensis)等针叶树的内生细菌进行了基于
16S rRNA 序列的多样性分析，发现其以芽胞杆菌
属、类芽胞杆菌属、假单胞菌属等为主要优势菌群，
由此可见，木本植物的内生细菌呈现出整体一致的
特点，但研究仍然主要集中于根，叶等组织器官，对
于韧皮部组织的内生细菌研究较少。
目前，在各种农作物及果树等经济作物中发现
的内生细菌隶属 50 多个属，已超过 120 种(Berg et
al．，2006)。植物内生细菌中有很多是对植物生长
或微生态环境有利的菌群，如能产生 IAA 促进植物
生长并且能起到解磷作用的假单胞菌属、泛菌属，
能够结瘤固氮的根瘤菌属(Li et al．，2008)，能够拮
抗病原菌的类芽胞杆菌属、微杆菌属、芽胞杆菌属
441
第 5 期 王 瑫等: 2 种杨树可培养内生细菌的多样性和季节动态变化
(Trivedi et al．，2011)，能够分解有机除草剂和烃类
化合物的 Methylobacterium 等(Madsen et al．，2001)。
另外一些新发现的植物内生菌属的功能尚未确定，
有待进一步研究。本文分离到的 47 株菌株也属于
细菌 4 大类群，这与关于其他杨树内生细菌的报道
是一致的，但优势菌群却不完全相同。本文研究的
三倍体毛白杨以根瘤菌属和芽孢杆菌属为优势菌
群，健杨 94 的优势菌群则为根瘤菌属和微杆菌属。
二者都以根瘤菌属为优势菌群，根瘤菌属是一大类
群能在豆科植物结瘤固氮的细菌的统称，早在 1997
年对红花草内生细菌的研究中就发现，根瘤菌属在
改善植物固氮能力，提高植物修复能力中起到重要
作用(Sturz et al．，1997)。在 2 种杨树干部皮层组织
均分离到根瘤菌，这表明其为杨树组织器官的内生
细菌，并能推断杨树根部很可能具有固氮能力。芽
孢杆菌属则是一类常见的植物内生细菌，在许多植
物和环境中都有发现，并且表现出良好的生防潜力
(Reiter et al．，2006)。微小杆菌属则被报道为能有
效降解土壤中的重金属离子，并且能定殖于植物内
部，起到改善土壤生物量产出，促进植物生长的作用
(Sheng et al．，2008)。
多年 来，杨 树 一 直 受 到 灰 斑 病 ( Coryneum
spp． )、叶锈病 ( Melampsora spp． )、烂皮病 ( Valsa
spp． )、杨白潜蛾 ( Leucoptera susinella )、杨枯叶蛾
( Gastropacha populifolia )、春 尺 蠖 ( Apocheima
cinerarius)等病原菌和害虫的危害，这些病虫害极大
地加剧了林木的衰败与生态体系的破碎化进程。从
杨树干部分离到的内生细菌用于杨树腐烂病病原的
拮抗，表明菌株 JK-SH001 ( Burkholderia pyrrocinia)
有显著的抗病作用，并能定殖于杨树干部 (任嘉红
等，2009)。同样，也是该属的菌种 B． cepacia 被报
道能降解甲苯化的有机物，从而对杨树的适生环境
进行修复(Safiyh et al．，2005)。本研究在 2 种杨树
都分离到一定比例的芽孢杆菌，研究表明芽孢杆菌
属是改善宿主抗病、抗逆能力的主要功能菌群 (卢
镇岳等，2006)，如枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis)
就是一种对各种植物病原菌有着良好拮抗作用和定
殖作用的生防菌株 (王星云等，2007; Erick et al．，
2013)。因而，从杨树可培养内生细菌中筛选出的
一批具有生物防治作用的内生菌资源，将在提高杨
树的抗病虫能力和促进杨林复壮等方面具有潜在的
实践意义。
2 种杨树在不同季节内可培养内生细菌种类差
异明显，总体上三倍体毛白杨各季节可培养内生细
菌种类少于或与健杨 94 各季节可培养内生细菌持
平。2 种杨树内生细菌分离量随季节变化规律为，
健杨 94 夏季 ＞春季 ＞秋季 ＞冬季，夏季可培养内生
细菌数量最高可达 1. 65 × 106 cfu·g － 1; 三倍体毛白
杨: 秋季 ＞夏季 ＞ 冬季 ＞ 春季，秋季可培养内生细
菌数量最高可达 1. 08 × 106 cfu·g － 1。2 种杨树内生
细菌分离量变化规律并不一致，但总体表现为夏秋
2 季均高于冬春 2 季。这与大多植物内生细菌受到
季节变化的影响是整体一致的，即温暖的季节内生
细菌多样性大于寒冷的季节(黎起秦，2006; Stefano
et al．，2003)，原因之一可能是春季和冬季的温度低
于夏天和秋季，春冬 2 季的很多内生细菌处于休眠
状态，含量极低，无法被分离到，所以导致夏秋分离
率高于春冬季; 原因之二可能是与树体的生长阶段
有关，夏秋 2 季杨树生长最茂盛，体内营养物质最为
丰富，所以更适于内生细菌的生长和繁殖。因此，不
同季节变化会改变温度、湿度等影响因子，从而导致
寄主植物生长条件改变，间接影响植物内生细菌的
生长。
2 种杨树在各个季节的优势菌群则既表现出差
异性也表现出同一性，三倍体毛白杨和健杨 94 在前
3 个季节中表现出差异，却在冬季表现出一致性，即
以根瘤菌属为主，且健杨 94 4 个季节中大多以其为
主，这说明根瘤菌属在杨树体内的适生性和定殖能
力都比其他内生细菌强，能够长期稳定的占据优势
地位，也就说明健杨 94 内部可能存在较强的固氮能
力，这是否与该种杨树转 Bt 基因而提高了抗逆性，
从而影响了内生细菌优势菌群的定殖分布有关值得
探讨。而在夏季和秋季，三倍体毛白杨和健杨 94 的
优势菌群出现差异，前者夏季以微杆菌属为主，后者
以纤维菌属为主，秋季则恰好相反。纤维菌属是一类
能分泌纤维素酶的细菌，其在杨树体内定殖对生长有
怎样的影响也值得深入探讨。2 种杨树几乎在 4 个
季节都分离到了鞘氨醇单胞菌，其对改善土壤质量、
降低重金属污染有着显著的效果 ( Sheng et al．，
2008)，这表明 2 种杨树对于环境的适生能力较强，
丰富的内生细菌能够提高其对环境的抗逆性。
由于许多细菌的生长条件难以人工模拟或难以
培养，因此，采用传统的纯培养方法只能分离得到一
部分植物内生细菌，并不能真正全面地反映植物内
生细菌群落的多样性。每种内生细菌生长所需营养
物质有所差别，甚至差别很大，卡依尔等采用了 3 种
培养基( TSA、LB 和 NA 培养基)用于分离 Ugan 古
河道胡杨可培养内生细菌结果表明，采用 TSA 培养
基分离效果好于 NA 培养基(卡依尔·玉素甫等，
2011)。此外，在植物内生细菌分离时，在分离培养
541
林 业 科 学 49 卷
基中添加分离样品汁液，尽量模拟内生细菌的宿主
环境来保证内生细菌的分离量，可以更加真实地反
映植物内生细菌的情况。
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(责任编辑 朱乾坤)
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