全 文 ：第 !" 卷 第 " 期
# $ % $ 年 " 月
林 业 科 学
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./01!"!*/1"
2345!# $ % $
银杏叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因
K;7.M+>LD的克隆与表达!
李琳玲%! #6程6华#6许6锋=6王6燕=6姜德志=6程水源#
"%1河北农业大学园艺学院6保定 $8%$$%# #1黄冈师范学院生命科学与工程学院6黄冈 !=9$$$#
=1长江大学园艺园林学院6荆州 !=!$#<$
摘6要!6利用 N,’)技术首次从银杏中克隆得到铜锌型超氧化物歧化酶基因 "K;7.M+>LD$的 YC*,序列%
K;7.M+>LD的YC*,全长为 89= ^\% 基因内部含有 % 个长度为 "!# ^\开放阅读框!编码长度为 #%= 个氨基酸残基
的蛋白质!预测分子质量为 #%17< ‘3!等电点为 "19#% 三维结构预测结果显示!I^’3f4&oC含有 = 个转角环和 9 个
(折叠构成桶状的活性中心% I^’3f4&oC氨基酸序列与其他植物的’3f4&oC具有很高的相似性% 进化树分析结
果表明 I^’3f4&oC和其他物种的’3f4&oC源自于相同的祖先% 信息学分析显示!得到的 I^’3f4&oC属于叶绿体
&oC% &/3WLMU4杂交证实!K;7.M+>LD属于一个小的多基因家族% */UWLMU4杂交表明K;7.M+>LD在银杏的茎’叶和
果中有表达!根中没有表达!在叶中的表达量最高% ,B,和 =" c高温能诱导K;7.M+>LD的转录表达!而低温和渗
透压处理结果不明显%
关键词&6银杏# 7.M+>LD基因# 表达分析
中图分类号! &8%91!"( J7!=1#666文献标识码!,666文章编号!%$$% A8!99"#$%$#$" A$$=< A$9
收稿日期& #$$7 A$! A%=# 修回日期& #$$7 A%$ A#$%
基金项目& 教育部新世纪优秀人才支持计划"*’)+]$!]$8!"$!湖北省教育厅重大科技项目"f#$$"#8$$#$和湖北省青年杰出人才基金
"#$$=,B$%!$%
!程水源为通讯作者%
K’(-#*,($#$4NL21&’’,($()*"&!"-(1(2-#’*!(22&1]X,$0+72&1(L,4&Q,’J7*#’&
:&$&"560$7#89:$ )1(J51#;-, 61",6*
-H-H40H4F%!#6’LM4FP3E#6@3 gM4F=6SE4FGE4=62HE4FCMaLH=6’LM4F&L3HX3E4#
"%"7/3$4$/0H/’,-(.3,.’$>(-$+($! H$;$-84’-(.3,.’&3J+-<$’%-,56?&/6-+4 $8%$$%#
#"7/3$4$/0:-0$>(-$+($&+6 2+4-+$$’-+4! H.&+44&+4 A/’=&3J+-<$’%-,56H.&+44&+4 !=9$$$#
="7/3$4$/0H/’,-(.3,.’$&+6 K&’6$+-+4! c&+4,N$J+-<$’%-,56d-+4N)/. !=!$#<$
=>’*1#0*&6 , T30]0M4FWL YC*, KMR3M4YM/TK-+P4/;-3/;& YL0/U/\0EKWY/\\MUeaH4Y]K3\MU/_HVMVHKO3WEKMFM4M
"K;7.M+>LD! g2<<<$#$$ ZEKHK/0EWMV TU/OK";-3/;& T/UWLMTHUKWWHOM5+LMT30]0M4FWL YC*,/TK;7.M+>LDZEK89=
^\! H4Y03VH4FE"!# ^\ /\M4 UMEVH4FTUEOM"oNg$ ZLHYL ZEKVMV3YMV W/M4Y/VME#%=]EOH4/]EYHV \U/WMH45,\UMVHYWMV
O/0MY30EUZMHFLW/TWLM\U/WMH4 ZEK#%59 ‘3 ZHWL \(/T"59#5+LUMM]VHOM4KH/4 KWU3YW3UMO/VM0H4FKL/ZMV WLEW
I^’3f4&oCY/4WEH4MV = LM0H_MKE4V 9 KLMMWK! E4V LEV EYX0H4VMUO/WHTE4V WLUMMM_WMU4E00//\KH4 WLMM4aXOMY/UM5
dLX0/FM4MWHYWUMME4E0XKHKUM[ME0MV WLEWI^’3f4&oCKLEUMV WLMKEOME4YMKW/UZHWL /WLMU’3f4&oCK5BH/H4T/UOEWHY
E4E0XKHKKL/ZMV WLEWWLM’3f4&oCY/4WEH4MV EYL0/U/\0EKW]WEUFMWMV WUE4KHW\M\WHVMK5&/3WLMU4 E4E0XKHKKL/ZMV WLEWWLM
K;7.M+>LDFM4MKZEKM4Y/VMV ^XEKOE0FM4MTEOH0XH4 K";-3/;&5*/UWLMU4 LX^UHVHaEWH/4 E4E0XKHKKL/ZMV WLEW
K;7.M+>LDM_\UMKKMV H4 0ME[MK! KWMOKE4V TU3HWK! ZHWL WLMLHFLMKWM_\UMKKH/4 H4 0ME[MK5+LMUMZEK4/M_\UMKKH/4 T/34V
H4 U//WK5+LMM_\UMKKH/4 /TK;7.M+>LDY/30V ^MH4V3YMV ^X,B,E4V =" c WMO\MUEW3UM! ^3W4/W^X/KO/WHY3OKE4V 0/Z
WMO\MUEW3UM5
?&/ @(14’&6K-+P4/;-3/;&# Y/\\MUeaH4Y]K3\MU/_HVMVHKO3WEKMFM4M"7.M+>LD$# M_\UMKKH/4 E4E0XKHK
66超氧化物歧化酶"K3\MU/_HVMVHKO3WEKM!&oC$是
体内氧自由基清除反应的第 % 个酶类!催化超氧负
离子转变成为 o# 和 P#o# "NE^H4/ZHWYL $,&35!
%79=$% 植物细胞主要含有 = 种类型的 &oC&
’3f4&oC!Q4&oC和 gM&oC% Q4&oC和 gM&oC存
在于线粒体’过氧化物酶体和叶绿体中!’3f4&oC
林 业 科 学 !" 卷6
主要存在于叶绿体’胞质和过氧化物酶体中"郑荣
梁! %77#$% 因此在植物细胞的不同部位都有相应
的抗氧化能力% ’3f4&oC是 = 种歧化酶中含量最
丰富的一种!是活性氧清除酶系统中最重要的酶!与
植物的抗旱’抗盐碱’耐低温以及耐高温等多种抗逆
性有密切关系!在植物体内’3f4&oC的表达受到多
种逆境因子以及激素等的诱导表达 "S3 $,&35!
%777# NETEM0$,&35! %77%# +KE4F$,&35! %77%$%
大量研究发现!提高植物体内抗氧化酶活性和
增强抗氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效途
径"+E4E‘E$,&35! %777# g/XMU$,&35! %77!# QYDMUKHM
$,&35! %77=# QHW0MU$,&35! %77!# %77%$% 在抗性不
同的物种或品种中! 氧化伤害的降低程度与抗氧化
物系统相关酶的表达量的增加呈正相关"dH4LMU/$,
&35! %778$% 通过转基因技术手段将抗氧化相关基
因导入植物体内表达!能显著提高转基因植株的部
分抗氧化能力和抗逆性% 在抗氧化转基因研究中!
’3f4&oC活性的提高能显著增强植物对各种环境
胁迫的适应能力!转基因植株中7.M+>LD基因的大
量表达不同程度地提高了植株对环境胁迫的抵抗能
力"李筠等! #$$"# I3\WE$,&35! %77=E# %77=^$%
银杏"K-+P4/;-3/;&$历经百万年各种复杂的气
候环境!不仅表现了强大的生存适应能力!而且在形
态上至今很少改变% 这与其对环境的适应!对各种
逆境胁迫的耐受能力紧密相关"CM4F$,&35! #$$"$%
对银杏7.M+>LD"K;7.M+>LD$基因的克隆和表达
分析有助于揭示银杏对环境的适应机制!以及抗氧
化抗逆性的生理机制!并为利用基因工程技术培育
优良林木提供理论依据和基因资源%
%6材料与方法
CBCD材料
%1%1%6菌株和质粒6大肠杆菌 +od%$ 为本实验室
保存!\QC%9]+购自+,D,N,%
%1%1#6植物材料6基因克隆及不同组织表达分析
的银杏材料采集于长江大学银杏果用园!品种为家
佛手!%# 年生嫁接苗% 嫁接苗生长势一致!土肥水
管理良好% 采集时间为& 茎采集于 #$$9 年 < 月中
旬根蘖苗嫩茎!根和叶采集于 < 月中旬!果采集于 8
月上旬%
所有诱导处理的银杏材料均采用长江大学园艺
园林学院温室 % 年生盆栽苗"#$$9 年 8 月$!品种为
家佛手% 盆栽苗生长在 #< c’%#$ )O/0\L/W/4K.
OA#KA%光照 %" L’%9 c暗环境 9 L 的温室中!保持
8$:相对湿度!培养基质为体积比%p%p%的草炭’腐
叶土和珍珠岩%
%1%1=6酶与分子生物学试剂6限制性内切酶’I&e
酶’d’N耗材’ &Q,N++Q N,’)YC*,,O\0HTHYEWH/4
DHW均为 +,D,N,公司产品# C(I]PHFL dUHOMC*,
-E^M0H4FE4V CMWMYWH/4 &WEUWMUDHW和 C(I*/UWLMU4
&WEUWMUDHW购自 N/YL# &3\MUKYUH\W+反转录酶为
(4[HWU/FM4公司产品# 杂交膜使用 QH0H\/UM公司的
d.Cg膜# 胶回收试剂盒为+(,*I)*公司离心柱型
琼脂糖凝胶C*,回收试剂盒# ,B,和(,,为 &HFOE
公司产品# 氨苄青霉素钠盐购自上海生工生物工程
技术服务有限公司# 引物合成和测序由上海生工完
成!引物序列见表 %# 其他试剂均为国产分析纯%
CBAD方法
%1#1%6C*,提取及 &/3WLMU4 杂交6参考魏春红等
"#$$"$’+,B法提取银杏幼叶 C*,!提取液成分与
魏春红等"#$$"$配方完全相同% &/3WLMU4 杂交中!
基因组分别使用 2(/N*’?&=P*和 H-+V,酶切!
探针浓度’杂交操作参考 C(I]PHFL dUHOMC*,
-E^M0H4FE4V CMWMYWH/4 &WEUWMUDHW%
%1#1#6总N*,提取及反转录6银杏不同组织采集
后放入液氮速冻并转 A8$ c超低温冰箱保存% 不
同组织总N*,提取采用蔡荣等"#$$8$的’+,B法%
提取的总 N*,用 %:琼脂糖凝胶电泳检测% 反转
录第 % 链YC*,合成采用(4[HWU/FM4的 &3\MUKYUH\W+
反转录酶操作# 模板合成参考 &Q,N++Q N,’)YC*,,O\0HTHYEWH/4
DHW说明书%
*/UWLMU4杂交检测不同组织和不同处理的银杏
叶片7.M+>LD转录情况% 为了比较 = 类 &oC基因
在银杏不同组织’不同诱导表达变化!根据已提交
IM4BE4‘的银杏 F+>LD"K;F+>LD!)g"==<$"$和银
杏1$>LD"K;7.M+>LD!g2<<<$%7$基因序列设计一段
YC*,序列作为不同组织杂交和诱导表达分析探针!
K;7.M+>LD探针引物"表%$直接由测序结果设计!银
杏 %9& N*,引物"表 %$扩增产物作为内参探针% 杂
交操作参照C(I*/UWLMU4 &WEUWMUDHW说明书%
%1#1=6不同诱导处理6激素处理诱导选择,B,和
(,,喷洒处理盆栽苗!浓度均为 %$ )O/0.-A%!处理
后分别于 %#!#! L 采集盆栽苗叶片液氮速冻!转
A9$ c保存% 渗透压处理选用 %$:蔗糖 " &3Y$’
%$:甘露醇"QE4$和 %$$ OO/0.-A%的 *E’0!分别喷
洒处理盆栽苗!#! L 后采集叶片液氮冷冻! A9$ c
保存% 以上清水处理作为对照组%
低温选取 ! c作为处理温度!分别于 %#!#! 和
=" L采集叶片液氮处理! A9$ c保存% 高温选取
"=
6第 " 期 李琳玲等& 银杏叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因K;7.M+>LD的克隆与表达
="!!$ 和 !! c作处理温度!分别于 !!9 L 后采集叶
片液氮处理! A9$ c保存% 常温培养"#< c$盆栽
苗作为对照组%
%1#1!6其他操作6简并d’N采用梯度d’N确认最
佳退火温度!总共设置 %#个梯度% N,’)d’N使用巢
式d’N扩增!首次扩增用+/3YLV/Z4 d’N!巢式扩增为
三步法d’N扩增% 探针模版扩增采用三步法d’N扩
增% d’N操作程序见表 #% d’N扩增产物用 %:琼脂
糖凝胶电泳检测!胶回收!+,克隆后送出测序%
%1#1< 6 生物信息学分析 6 软件 .MYW/U*+(
&3HWM%$1$ 进行不同物种间同源基因的核苷酸序列
比对!测序片段拼接% Q)I,!1% 绘制系统进化树%
利用J3E4WHWXo4M!1< 对杂交结果进行定量分析%
用 dUHOMUdUMOHMU<1$ 和 o0HF/" 软件设计引物%
B0EKWd" LW\&$ZZZ54Y^H540O54HL5F/[eB-,&+e$做
同源搜索% &ZHKK]O/VM0服务器"LW\&$KZHKKO/VM05
M_\EKX5/UFe$进行蛋白质三维结构预测% dU/WdEUEO
"LW\& $E35M_\EKX5/UFeW//0Ke\U/W\EUEO5LWO0$ 计算
蛋白质分子质量及等电点% &HF4E0d=1$ &MU[MU"LW\&
$ZZZ5Y^K5VW35V‘eKMU[HYMKe&HF4E0d$预测信号肽及
剪切位点%
表 CD银杏0$7#89:克隆及分析用引物
9#>ICD9"&0-($&#$4#$#-/’,’21,J&1’()560$7#89:
引物
dUHOMUK
序列
dUHOMUKMR3M4YMK"简并引物 I^’3&d ’,GII,++G’,GG+I’,GI,N
CMFM4MUEYX\UHOMUK I^’3,d ’,N,’I+’’*’’+I’N++N’’
N,’)扩增引物 ’3&oC=N% I+++I,’,’,’II+I’+’’+I,,I,
N,’)\UHOMUK ’3&oC=N# ,I+’I+III,,III’,+++I++
’3&oC’3&oC合成探针引物 ’3&oC&% ’,,,’+’++I++I’+I’’+’’,
dU/^M\UHOMUK ’3&oC&# I+I,I+’’I,’’,’,’’,’,,I
Q4&oC&% +++I+’,,+I’+I,I,+II,,I+
Q4&oC&# III’++’,+++’,++’+’I+,+
gM&oC&% ’++’’,+’I’,’,’,II’,+’
gM&oC&# +I+,,+’+II+’I+’II++’+I,
%9& N*,引物 %9&md II,,I,I’’’,I’,+I,,,,+
%9& N*,\UHOMUK %9&C* ,I’I’’+’I+II+I’,,’,I
表 AD.!;扩增程序!
9#>IAD9"&21(0&’’&’().!;
d’N d’N引物dUHOMUKT/Ud’N
程序
d’N\U/YMV3UM
简并d’NCMFM4MUEYXd’N I^’3&d! I^’3,d 7! c!=$ K# <# ;"= c"%# FUEVHM4WK$!!$ K# 8# c!% OH4# =# YXY0MK
’3&oC=i末端扩增 =iN,’) ’3&oC=N%! mdQ 79 c!%$ K# "9 c!% OH4# =$ YXY0MK
’3&oC=N#! *md 7! c!=$ K# <8 c!!$ K# 8# c!% OH4# =$ YXY0MK
探针合成 dU/^MKX4WLMKHK &oC&%! &oC&# 7! c!=$ K# <9 c!=$ K# 8# c!% OH4# =< YXY0MK
%9&md! %9&C* 7! c!=$ K# "% c!=$ K# 8# c!% OH4# =< YXY0MK
66!简并d’N中退火温度从 <= ;"! c依次设置 %# 个温度梯度% +LMVMFM4MUEYXd’NKMW%# FUEVHM4WKTU/O<= W/"! c5
#6结果与分析
ABCD560$7#89:0QW=的克隆及其序列特征
分析
简并引物 I^’3&d和 I^’3,d对 YC*,模板做
简并 d’N扩增!得到 % 条 =$" ^\ 的扩增片段!经
*’B(比对分析为叶绿体7.M+>LD基因片段% 根据
测序结果分别设计 ’3&oC接得到 89= ^\ K;7.M+>LD全长序列"IM4MBE4‘ 登
录号& g2<<<$#$$!包含 % 个 "!# ^\ 最大读码框
"oNg$% 分析表明!K;7.M+>LD含有保守的植物基
因翻译起始序列 ,I’,,+II!与 -3WY‘M等"%798$
统计的植物基因翻译起始序列",,’,,+II$基本
符合% K;7.M+>LD编码 % 条 #%= 个氨基酸残基的
多肽!预测分子质量为 #%17< ‘3!等电点 " \($
为 "19#%
I^’3f4&oC氨 基 酸 序 列 与 海 岸 松 "!-+.%
E-+&%,$’! ,g!=!%9"$的同源性最高!为 9#1":% 与拟
南芥 "8’&;-6/E%-%,)&3-&+&! ,,C%$#$9 $’ 银 白 杨
"!/E.3.%&3;&! B,g9$<9< $’ 亚 洲 棉 " K/%5E-.=
&’;/’$.=! ,B-"=<%9$’陆地棉 "K/%5E-.= )-’%.,.=!
,’’7="=8 $’ 木 榄 " ?’.4.-$’& 45=+/’)-N&!
’,Q79!!!$’红三叶"I’-0/3-.=E’$,$+%$! ,,N%$9%#$’
向日葵"H$3-&+,).%&++..%! ’,P$"!!7$’豌豆"!-%.=
%&,-<.=! ’,,=79%7 $’ 西 瓜 " 7-,’.3.% 3&+&,.%!
,,&8#7=8$’欧洲山杨"!/E.3.%,’$=.3&! ’,’==9!!$
和扭口藓"?&’;.3& .+4.-(.3&,&! B,’""7!8$相似性为
"!1=:;8%19:"图 %$%
用近邻相接法"QMFE!1%$对不同植物’3f4&oC
氨基酸序列作进化树分析!进化树中数字代表
^//WKWUE\值!重复检测% $$$次% 进化树下方为相对
进化距离% 分析结果显示 ’3f4&oC被分为 = 大类
"图 #$!其中被子植物银白杨’欧洲山杨’木榄等为
8=
林 业 科 学 !" 卷6
图 %6’3f4&oC氨基酸序列同源性比较
gHF5%6QHW/YL/4VUHE0’3f4&oCEOH4/EYHV KMR3M4YMKE0HF4OM4W
下划线为简并引物设计位点# 方框中为预测的信号肽序列#&&表示与’3结合的氨基酸残基#’&表示f4结合位点#(&表示叶绿体引导肽
剪切的保守位点#序列比对最后为其他植物与 I^’3f4&oC同源性百分比#最后部分比对序列省略%
&MR3M4YMK3KMV T/UVMKHF4H4Fd’N\UHOMUKEUM34VMU0H4MV# &LEVMV ^/_MKEUM\3WEWH[MYL0/U/\0EKWWEUFMWH4FKMR3M4YMK# "&$ H4VHYEWMKE4 ’3 ^H4VH4F
KHWM# "’$ H4VHYEWMKE4 f4 ^H4VH4FKHWM# "($ WLMKLMEUKHF4 \/KHWH/4 /TWUE4KHW\M\WHVMKT/UYL0/U/\0EKW]WEUFMWMV ’3f4&oC\U/WMH4K# +LMKMR3M4YM/T
’3f4&oCE0HF4OM4WHKL/O/0/FX\MUYM4WEFM# oOHWK/OMKMR3M4YMEWWLM0EKW5
9=
6第 " 期 李琳玲等& 银杏叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因K;7.M+>LD的克隆与表达
一组!其分化时间最迟!集中在 $1$< ;$1$" 之间#
银杏和海岸松作为裸子植物为一组!与被子植物的
进化分歧时间较早!在 $1$9 ;$1$7 之间# 扭口藓作
为较原始的苔藓类植物单独为一组!其相对进化分
歧时间大于 $1%%
ABAD:>!7X$+^ Q蛋白质三维结构预测
图 #6植物胞质’3f4&oC系统进化树
gHF5#6dLX0/FM4MWHYWUMM/T\0E4WYXW/\0EKW’3f4&oCK
基于*MHFL^/U]2/H4H4F方法构建!Q)I,!1%% 各节点处数字表示自引值!重复% $$$次% +LMWUMMZEKY/4KWU3YWMV ^XWLM
*MHFL^/U]2/H4H4FOMWL/V! Q)I,!1%5+LM43O^MUKEWMEYL 4/VMUM\UMKM4WMV WLM^ //WKWUE\ [E03M! ZHWL % $$$ UM\0HYEWMK5
66在’3f4&oC蛋白质一级结构分析中!酶的活性
中心与金属离子结合部位非常保守!其中 PHK%$PHK%$8!PHK%## 和 PHK%87 以 ’3 原子为中心形成 %
个活性单位结构!而 PHK%##!PHK%=$!PHK%=7 和
,K\%!# 与f4原子结合构成另外一个亚基的活性中
心!活性中心主要处于 ’3f4&oC的靠近 ’端的区
域% 靠近*端的氨基酸序列保守性较低% 依据同
源建模的预测方法! 应用 &ZHKK]O/VM0构建的
I^’3f4&oC蛋白高级结构模型"图 =!!$!预测结果
表明 I^’3f4&oC蛋白质包含 = 个小的’螺旋!9 个
(折叠片!%= 个卷曲和 8 个转角结构% 该蛋白结构
的*端区主要是 9 个反向平行的(折叠片构成的 %
个桶状结构!’端区主要为 % 个拧成 = 股 ’螺旋的
松散环结构% 酶活性中心处于靠近 (折叠片的结
构域边缘% 在 K;7.M+>LD的氨基酸序列信号肽预
测中发现有一段叶绿体转运肽!剪切点位于 <7 位的
丙氨酸%
ABED560$7#89:+(7*"&1$印迹分析
为了确定K;7.M+>LD基因在基因组中的拷贝
数!设计了 % 对引物用以扩增 YC*,的一段插入序
列作为杂交探针% 选择 % 段不含 2(/N*’?&=P*
和H-+V,酶切位点的 K;7.M+>LD基因组外显子序
列作为杂交探针!&/3WLMU4 分析结果显示每个基因
组酶切产物在 $1< ;71$ ‘^ 之间有 # ;= 个以上杂
交条带"图 <$!杂交条带较明显% 这说明在银杏中!
图 =6&ZHKK]O/VM0构建的 I^’3f4&oC亚基与
f4# l结合的 =C结构模型
gHF5=6+LM=CKWU3YW3UM\UMVHYWH/4 /TI^’3f4&oCE4V
f4# l ^H4VH4FK3^34HWY/4KWU3YWMV ^X&ZHKK]O/VM0
7.M+>LD基因有多个拷贝!属于 % 个小的多基因
家族%
ABOD560$7#89:不同组织表达分析
*/UWLMU4杂交分析显示"图 "$!银杏 7.M+>LD!
F+>LD!1$>LD基因在银杏的茎’叶和果中都有表
达% 其中7.M+>LD和 1$>LD在根中不表达!只有
F+>LD在根部有大量表达% 在银杏的叶中三者都
有大量表达!表达量依次为 1$>LD>F+>LD>
7.M+>LD% 在银杏的茎中 7.M+>LD和 1$>LD表达
量较高!而F+>LD表达量较低% 在果实成熟前期!
7=
林 业 科 学 !" 卷6
图 !6&ZHKK]O/VM0构建的 I^’3f4&oC亚基
与’3# l结合的 =C结构模型
gHF5!6+LM=CKWU3YW3UM\UMVHYWH/4 /TI^’3f4&oC
E4V ’3# l ^H4VH4FK3^34HWY/4KWU3YWMV ^X&ZHKK]O/VM0
表达 量 最 高 的 是 F+>LD! 其 次 是 1$>LD! 而
7.M+>LD只有痕量表达%
图 <6K;7.M+>LD&/3WLMU4杂交分析
gHF5<6IM4/OHY^ 0/WE4E0XKHK/TK;7.M+>LD
银杏基因组C*,用2(/N*’?&=P*和H-+V,进行酶切!$18:
的琼脂糖凝胶电泳分离!杂交探针为基因组的 YC*,间隔序列!
左侧为分子量标准% IM4/OHYC*,ZEKVHFMKWMV ZHWL 2(/N*!
?&=P*E4V H-+V,! E4V KM\EUEWMV /4 E$18: EFU/KMFM05+LM
C*,^0/WZEKLX^UHVHaMV ZHWL WLMH4KMUWH4 WLMK;7.M+>LDYC*,
Y0/4M5d/KHWH/4K/TO/0MY30EUZMHFLWOEU‘MUKEUMKL/Z4 /4 WLM0MTW5
ABPD560$7#89:诱导表达分析
植物激素的诱导试验结果显示!银杏 7.M+>LD
能够迅速被,B,诱导表达!表达量随时间增加而积
累!而(,,对K;7.M+>LD则没有明显诱导作用"图
8,$% ,B,喷洒处理 %# L 后 K;7.M+>LD表达量明
显提高!处理 #! L 后表达量基本处于平稳状态%
(,,处理样与对照组比较 K;7.M+>LD表达量无明
图 "6银杏不同组织几种 >LD*/UWLMU4杂交分析
gHF5"6*/UWLMU4 E4E0XKHK/TWLMM_\UMKKH/4 /TWLUMM
>LDFM4MKH4 VHTMUM4W/UFE4K
显提高% 渗透压处理结果显示!蔗糖和甘露醇处理
#! L 后 K;7.M+>LD表达量只有微量增加!而 %$$
OO/0.-A% *E’0处理后表达量未见明显提升 "图
8B$% 表明渗透胁迫处理不能明显诱导银杏叶
7.M+>LD的表达%
图 86银杏盆栽苗几种环境条件诱导K;7.M+>LD
转录表达的*/UWLMU4分析结果
gHF586*/UWLMU4 E4E0XKHK/TK;7.M+>LDFM4MM_\UMKKH/4
H4 UMK\/4KMW/KM[MUE0Y/4VHWH/4
,&,B,!(,,处理#B&渗透压处理#’&低温处理% QE4& 甘露醇# &3Y& 蔗
糖% ,& +UMEWOME4WZHWL ,B,E4V (,,# B& +UMEWOM4WZHWL /KO/WHY3OK# ’&
+UMEWOM4WZHWL 0/ZWMO\MUEW3UM5QE4& QE44HW/0# &3Y& &3YU/KM5
温度胁迫处理显示!! c处理对K;7.M+>LD表
达的影响不明显!在低温处理 =" L 仍未发现表达量
有明显升高 "图 8’$% 而不同高温处理能影响
K;7.M+>LD 的 表 达! =" c 高 温 能 明 显 诱 导
7.M+>LD表达量升高!! L 表达量有微弱增加!处理
9 L 表达量有显著提升% !$ c 高温下! 银杏
7.M+>LD的表达在 ! L取样点有微弱下降!处理 9 L
后表达量又开始小幅上升% 在 !! c高温处理下!
K;7.M+>LD呈现先小幅升高后又降低的现象!! L
取样7.M+>LD转录小幅增加!9 L 表达量大幅下降
到对照水平下"图 9$%
$!
6第 " 期 李琳玲等& 银杏叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因K;7.M+>LD的克隆与表达
图 96银杏盆栽苗高温处理诱导K;7.M+>LD
转录表达的*/UWLMU4分析结果
gHF596*/UWLMU4 E4E0XKHK/TK;7.M+>LDFM4M
M_\UMKKH/4 H4 UMK\/4KMW/LHFL WMO\MUEW3UM
=6结论与讨论
利用简并d’N和 N,’)技术从银杏中克隆了
K;7.M+>LD基因% K;7.M+>LD虽由基因组编码!
但最终表达蛋白会定位到叶绿体中发挥作用% 进化
树"QMFE!1%$分析结果显示!K;7.M+>LD在进化上
分化较早% 在选取的物种中仅次于苔藓类植物扭口
藓!而与裸子植物海岸松具有相近的分化时间% 这
与物种由简单到复杂进化理论是一致的!也与银杏
8>#!1\H!FfDK等基因的进化树分析结果相符合
"-3 $,&35! #$$9# &LM4 $,&35! #$$"E# #$$"^# #$$<$%
K;7.M+>LD属于多基因家族% 在豌豆 "!-%.=
%&,-<.=$中也存在多个 7.M+>LD拷贝!而且编码的
’3f4&oC同工酶在胞质和叶绿体中都有分布"&YH/0H
$,&35! %799$% 在菠菜">E-+&(-& /3$’&($&$中!含有 #
种’3f4&oC同工酶!’3f4&oC% 在菠菜幼苗’黄化
苗的细胞质中表达!而 ’3f4&oC# 在菠菜成熟苗的
叶绿体中大量表达"DE4MOEWK3 $,&35! %77$$% 银杏
中多个7.M+>LD拷贝出现可能与 I^’3f4&oC同工
酶在不同组织或细胞内不同部位表达变化有关%
K;7.M+>LD除了有不同的亚细胞定位外!还具
有组织表达差异性% 在陆地棉中!7.M+>LD只在
叶’茎中表达!而在根’花’下胚轴中不表达"P3 $,
&35! #$$8$% DZ/4 等"#$$=$在研究萝卜"#&E)&+.%
%&,-<.%$时发现其7.M+>LD只在叶和绿色下胚轴表
达而在红色下胚轴和根中则不表达!其原因可能是
’3f4&oC主要在光合代谢中起作用!而呼吸代谢以
及其他次生代谢产生的超氧化物主要靠 gM&oC和
Q4&oC来清除% ’3f4&oC主要定位于叶绿体中!所
以在含有叶绿体等器官组织中有表达!而在不含叶
绿体的根部组织中则表达量较低或者不表达%
近年来越来越多的证据表明 ,B,参与调节植
物对逆境胁迫的反应!(,,在植物的细胞分裂’生
长’分化等生理过程中起着重要作用 "潘瑞炽!
#$$!$% 在木薯 "F&+-)/,$%(.3$+,& $’ 玉米 "M$&
=&5%$和萝卜的研究中都发现!7.M+>LD能够被外
源的,B,诱导表达"-MM$,&35! %777# G/KLH43UE$,
&35! %777# I3E4 $,&35! %779$!说明,B,诱导植物抗
氧化酶的表达量提升是一个普遍现象% ,B,诱导
>LD基因表达的分子机制及信号转导途径还不清
楚!目前研究认为No&可能作为信号分子参与了这
一过 程 "2HE4F$,&35! #$$% $% 烟 草 "A-(/,-&+&
,&;&(.=$中!7.M+>LD对 ,B,和 (,,处理都不敏
感"D3UM\E$,&35! %778$% 在银杏中!(,,处理只诱
导了1$>LD!F+>LD的大量表达!对K;7.M+>LD的
表达没有明显的提高!可能是因为银杏在 (,,诱导
的细胞生长过程中超氧离子的清除靠 gM&oC和
Q4&oC来完成% 渗透压影响 >LD转录量的提高也
在多种植物抗逆性研究中有报道"-MM$,&35! %777#
B3M4/$,&35! %779# I3E4 $,&35! %779 $% -MM等
"%777 $ 的研究发现!组织悬浮培养的木薯中!
7.M+>LD有非常高表达量!但是这种表达量的升高
究竟是由于培养基中蔗糖造成的碳源充足生长活性
提高!还是由于蔗糖造成渗透压改变!则不清楚% 但
是在用 *E’0对木薯的叶片处理中能够明显诱导
7.M+>LD的大量表达% = 种渗透压处理银杏!都未
能明显引起盆栽苗7.M+>LD表达量的增加!但却能
引起银杏F+>LD和1$>LD的大量表达% 因此银杏
在高渗胁迫下的超氧化物清除可能与 F+>LD和
1$>LD的大量表达有关%
低温和高温也是普遍存在的 # 种环境胁迫因
子% -MM等"%777$的研究发现!=8 c高温处理能诱
导木薯中7.M+>LD表达量的升高!而 ! c低温处理
反而降低了 7.M+>LD表达水平% 但这并不代表
7.M+>LD与植物抗低温胁迫无关% S3 等"%777$
在小麦"I’-,-(.=&$%,-<.=$耐寒驯化中发现!冬小麦
和春小麦 F+>LD和 7.M+>LD均能被低温诱导表
达% 郁万文等"#$$9$研究发现梯度低温处理能够
诱导银杏总的 &oC活性升高!而在 ! c低温处理
中!银杏F+>LD和1$>LD表达量都有大幅提高!说
明银杏中Q4&oC和gM&oC参与了银杏对低温胁迫
的适应!而’3f4&oC则在银杏的正常生长环境下起
作用% 高温胁迫下!特别是在 !! ;!9 c高温处理银
杏盆栽苗!能够诱导银杏总的 &oC活性提高"欧祖
兰等! #$$9$% 而银杏 7.M+>LD在 !! c时表达量
呈先升后降趋势!同处于叶绿体中的 1$>LD表达则
在 !$!!! c保持较高的表达量!暗示在正常的银杏
生长条件下!’3f4&oC负责叶绿体光合作用中活性
氧的清除!而gM&oC则可能在温度补偿点以上叶绿
体的呼吸作用中起到抗逆调节作用%
%!
林 业 科 学 !" 卷6
参 考 文 献
蔡6荣!许6锋!陈柳吉!等5#$$85银杏不同组织的总N*,提取方
法的改进5生物技术! %8"!$& =9 A!$5
李6筠! 邓西平! 郭尚洙5#$$"5转铜e锌超氧化物歧化酶和抗坏血
酸过氧化物酶基因甘薯的耐旱性5植物生理与分子生物学学
报! =#"!$& !<% A!<85
欧祖兰! 曹福亮! 郑6军5#$$95高温胁迫下银杏形态及生理生化
指标的变化5南京林业大学学报! =#"=$& =% A=<5
潘瑞炽5#$$!5植物生理学5北京& 高等教育出版社! #9" A#7#5
魏春红! 李6毅5#$$"5现代分子生物学实验5北京& 高等教育出版
社! %=< A%=85
郁万文! 曹福亮! 汪贵斌! 等5#$$95银杏抗氧化酶系统对短期梯度
变温的响应5江西农业大学学报! =$"#$& #<# A#<<5
郑荣梁5%77#5生物学自由基5北京& 高等教育出版社! % A#5
B3M4/d! dHR3MUEK,! D3UM\E2! $,&3"%7795)_\UMKKH/4 /TE4WH/_HVE4W
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&LM4 I3/E4! dE4FG/4FaLM4! S3 SMHKLM4F! $,&3"#$$"^5’0/4H4FE4V
YLEUEYWMUHaEWH/4 /TEU//W]K\MYHTHYM_\UMKKH4FFM4MM4Y/VH4F=]
LXVU/_X]=]OMWLX0F03WEUX0Y/M4aXOMEUMV3YWEKMTU/OK-+P4/;-3/;&5
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+E4E‘EG! PH^H4/+! PEXEKLHG! $,&3"%7775&E0WW/0MUE4YM/T
WUE4KFM4HYUHYM/[MUM_\UMKKH4FXMEKWOHW/YL/4VUHE0Q4]&oC H4
YL0/U/\0EKWK5d0E4W&YHM4YM! %!9"#$& %=% A%=95
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/TK3\MU/_HVMVHKO3WEKMKH4 \0E4WKM_\/KMV W/M4[HU/4OM4WE0KWUMKK5
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0/YE0HaEWH/4! E4V VHTMUM4WHE0M_\UMKKH/4 /TOHW/YL/4VUHE0OE4FE4MKM
K3\MU/_HVMVHKO3WEKME4V YL0/U/\0EKWHYY/\\MUeaH4YK3\MU/_HVM
VHKO3WEKMFM4MKH4 ZLMEW5d0E4WdLXKH/0/FX! %#$"#$& <%= A<#$5
G/KLH43UED! GE^3WEG! +EO/HQ! $,&3"%7775,0WMU4EWH[M0XK\0HYMV
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!责任编辑6徐6红"
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