全 文 ：第 wv卷 第 t期
u s s z年 t 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1wv o‘²1t
¤±qou s s z
杨树与杨盘二孢菌激发子互作进程中
活性氧的释放及膜脂过氧化 3
冯 莹t ou 韩正敏t
kt q南京林业大学 南京 utssvz ~ u q广东省森林病虫害防治与检疫总站 广州 xtstzvl
摘 要 } 用杨盘二孢菌的激发子粗提液 o与高度抗黑斑病的 Œp zu杨和高度感染黑斑病的加杨悬浮细胞互作 o测
定杨树悬浮细胞的生物化学变化 ∀结果表明 }Œp zu杨在活性氧的释放和 ∃³‹ 的变化两方面均明显高出加杨 ~膜
脂过氧化过程 o从量的方面看 o二者几乎没有差异 o只是 Œp zu杨的膜脂过氧化高峰期要早于加杨 t «∀这些研究可
以为杨树的抗病机理和杨树抗病基因的研究提供基础 ∀
关键词 } 杨树 ~杨生褐盘二孢菌 ~悬浮细胞 ~激发子 ~病害互作
中图分类号 }≥zyv1su 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlst p ssy{ p sw
收稿日期 }ussx p sz p sx ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目/杨树和杨盘二孢菌互作系统中激发子及其功能研究0kvsuzts{tl ∀
3 韩正敏为通讯作者 ∀
Αχτιϖε Οξψγεν Ρελεασε ανδ Μεµ βρανε Λιπιδ Περοξιδατιον ιν τηεΙντεραχτιον
οφ Μαρσσονινα βρυννεα Ελιχιτορ ανδ Ποπλαρ Συσπενσιον Χελλ
ƒ ±¨ª ≠¬±ªtou ‹¤± «¨ ±ª°¬±t
kt qΝανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvz ~ u qΓενεραλΣτατιον οφ Φορεστ Πεστ Μαναγεµεντ ανδ Θυαραντινε οφ Γυανγδονγ Προϖινχε Γυανγζηου xtstzvl
Αβστραχτ} ׫¨ ¥¬²¦«¨ °¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨¶²©¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦¨¯¯ ²©·«¨ ¶∏¶¦¨³·¬¥¯¨³²³¯¤µ¤±§·«¨ µ¨¶¬¶·¤±·²±¨ ·«µ²∏ª«·«¨ ¬±·¨µ¤¦·¬²±
¥¨·º¨ ±¨¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦¨¯¯ ²©³²³¯¤µ¤±§·«¨ ¦µ∏§¨ ¨¯¬¦¬·²µ²© Μαρσσονινα βρυννεα º¨ µ¨ §¨·¨µ°¬±¨ §q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¤µ¨ ¤¶¥¨ ²¯º }·«¨
³µ²§∏¦·¬²±²©¤¦·¬√¨ ²¬¼ª¨ ± ¤±§·«¨ ∃³‹ ²©¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦¨¯¯ ²©Œ p zu ³²³¯¤µº¨ µ¨ «¬ª«¨µ·«¤± Ποπυλυσ χαναδενσισ¬± º«²¯¨
³µ²¦¨¶¶q׫¨µ¨ º¤¶±²§¬¶·¬±¦·§¬©©¨µ¨±¦¨ ²±·«¨ ∏´¤±·¬·¼¬±·«¨ °¨ °¥µ¤±¨ ¬¯³¬§³¨µ²¬¬§¤·¬²± k⁄„l ²©¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦¨¯¯ ²© Πq
χαναδενσι󤱧Œp zu o¥∏··«¨ ⁄„ µ∏¶««²∏µ¬± Œp zu ¤³³¨¤µ¨§²±¨ «²∏µ ¤¨µ¯¬¨µ·«¤±¬±·«¨ Πq χαναδενσισ ³²³¯¤µq׫¨¶¨
¦²∏¯§³µ²√¬§¨ ¤©²∏±§¤·¬²±·²∏±§¨µ¶·¤±§¬±ª·«¨ µ¨¶¬¶·¤±·°¨ ¦«¤±¬¶° ¤±§·«¨ µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ²©³²³¯¤µq
Κεψ ωορδσ} ³²³¯¤µ~ Μαρσσονινα βρυννεα~¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦¨¯¯ ~¨¯¬¦¬·²µ~§¬¶¨¤¶¨ ¬±·¨µ¤¦·¬²±
杨树黑斑病是杨树最主要的病害之一 o世界各地均有分布 ∀杨树感病后叶片早落 o生长量降低 ∀杨盘二
孢菌k Μαρσσονινα βρυννεαl是该病害的病原 ∀研究表明杨盘二孢菌存在有激发子物质k梁伟红等 oussyl ∀寄主
受病原物及其激发子影响后 o内部所发生的生理生化变化及病理生理代谢 o常常是寄主发生组织病变的基
础 o也是病害生理生化诊断的基础 o所以对寄主 p病原物互作关系的研究 o不仅有助于揭示寄主感抗病机制 o
而且还可进一步从分子水平上揭示病害的发生规律 o并在此基础上通过调控感病因子和激发抗病因子 o以达
到控制该病害的目的 ∀对杨树与杨生褐盘二孢菌互作早期反应进程和细胞水平上生理生化变化及其内在联
系的研究 o国内还未见报道 ∀本文对杨树悬浮细胞与杨盘二孢菌激发子粗提液互作后细胞内活性氧代谢及
膜脂过氧化等方面进行了研究 ∀
t 材料与方法
1 .1 杨树细胞悬浮系的建立
杨树 }选择加杨k Ποπυλυσχαναδενσισl作为感病杨树的代表 ~选择Œp zu杨k Πq δελτοιδεσ¦√ qŒp zul作为抗病
杨树的代表 ∀
愈伤组织的诱导 }采集杨树的嫩茎或叶柄作为外植体 o经 zs h酒精表面消毒 vs ¶os qt h升汞灭菌 w °¬±o
无菌水冲洗 v ∗ x遍后 o在无菌滤纸上吸尽嫩茎和叶柄上所吸附水分 o再切成 t¦°的小段 o接种在  ≠ 系列固
体培养基上 o于 uy ε 下暗培养 vs §o产生愈伤组织后转接继代 o定期观察愈伤组织生长情况 ∀
细胞悬浮系的建立 }在固体培养基上挑选具有分化能力的淡黄色或乳白色 !颗粒状愈伤组织 t ªo置于
tss °三角瓶中 o加入 vs °液体培养基 ouy ε !tvs µ#°¬±pt振荡暗培养 ∀前 v次继代时 o待培养物静置 u
°¬±后 o用无菌吸管吸出 uΠv左右上清液 o补充加入新鲜培养液至 vs °∀以后每次继代 o均用无菌吸管吸取
约 t °的悬浮细胞至内含 vs ∗ ws °液体培养基的 tss °的三角瓶中 o根据细胞生长速度 o每 tu ∗ tx §继
代 t次k≤∏µµ¬±§¨µot|{| ~王影等 ot||tl ∀
1 .2 杨盘二孢菌激发子的提取
杨生褐盘二孢菌的培养 }杨生褐盘二孢菌多芽管专化型k Μq βρυννεα ©q¶³qµυλτιγερµτυβιl菌株 o分离自南
京加杨 o由南京林业大学病理实验室保存 ∀将生长在 °⁄„培养基斜面上 u周的杨盘二孢菌转移到酵母浸膏
液体培养基k酵母浸膏 x ª~蔗糖 us ª~自来水定容至 t l中振荡培养 o在 ux ε 下 tvs µ#°¬±pt振荡 o暗培养 ts
∗ tw §o待长出均匀的菌丝团后滤纸过滤 ∀菌丝用重蒸水反复洗涤 w ∗ y次 o以除掉培养液 o冻存于 p us ε 冰
箱中待用 ∀过滤下来的滤液也存于冰箱待用 ∀
激发子的提取 }参照毕咏梅等kt||sl的方法并略作改进 ∀将所存的滤液分别按照 tΒx !tΒts !tΒtx !tΒus
k∂Β∂l的比例 o于 ys ε 下真空旋转蒸发仪中分别浓缩成 x !ts !tx !us倍的浓缩液 ∀在浓缩液中以 tΒvk∂Β∂l
的比例加入 |x h乙醇 ow ε 放置过夜 o次日弃去上清液 ∀用 vs °双蒸水悬浮沉淀 o并用重蒸水透析 t夜k每
ts «换 t次重蒸水l oy sss µ#°¬±pt离心 tx °¬±o取上清液作激发子粗提液使用 ∀
1 .3 互作体系的建立
采用 …¤®¨µ等kt||v l的方法 ∀取对数生长期的悬浮细胞 o棉布过滤收集 o互作介质ks1x °°²¯#pt ∞≥ o
s1x °°²¯#pt ≤¤≤¯ u os1x °°²¯#pt Žu≥’w 及 tzx °°²¯#pt甘露醇 o用 ‘¤’‹调 ³‹至 y1sl冲洗细胞 o沥干后称
取湿细胞 o使悬浮在互作介质中的细胞浓度达到 s1tx ªƒ • #°pt ∀互作体系中激发子粗提液的浓度为 ts倍
的浓缩液 ∀以不加粗提液的互作体系为对照 ∀
1 .4 Ο2 # −测定
将不同处理时间中的悬浮细胞取出 o棉布过滤收集 o称取湿细胞 s1x ªo加入 u1x °ks1sx °²¯ #pt o
³‹z1{l磷酸缓冲液≈含 s1t °°²¯#pt ∞⁄ׄ ~s1v h k •Π∂l×µ¬·²± ÷ p tss ~w h k •Π∂l°∂°k聚乙烯吡咯烷酮l  o研
磨匀浆 ots sss µ#°¬±pt ow ε 冷冻离心 us °¬±o取上清液备用 ∀互作时间分别为 t !u !v !w !x !y !z !{ «∀用
s1sx h ‘…×k氮兰四唑l处理上清液 ts °¬±后离心 o上清液在 {x ε 的水浴中加热 x °¬±o冷却至室温 o测 ’⁄x{s o
由 ≥’⁄抑制反应证明 ’u# p对 ‘…×的还原kŽ¨³³¯ µ¨等 ot|{|l o并计算矫正变化值 ≈矫正变化值k h l € k处理 p
对照lΠ对照 ≅ tss h   ∀
1 .5 脂膜过氧化测定
丙二醛k⁄„l的提取 }将不同处理时间中的悬浮细胞取出 o用蒸馏水将菌体冲洗干净 o称取湿细胞 s1x
ªo加入 ts h ×≤„k三氯乙酸lt °研磨至匀浆 o再加 v1s °×≤„进一步研磨 o匀浆于 y sss µ#°¬±pt w ε 冷冻
离心 ts °¬±o上清液备用 ∀
显色反应和测定 }吸取离心的上清液 u °o处理加入 u °s1y h ׅ„溶液k硫代巴比妥酸 o用 ts h ×≤„
配制lk对照加 u °蒸馏水l o混匀物于沸水浴上反应 tx °¬±o迅速冷却后离心 ts °¬±∀取上清液分别测
’⁄xvu !’⁄yss和 ’⁄wxsk余叔文等 ot|||l ∀计算寄主细胞内 ⁄„含量的公式如下 }
Χk±°²¯#ªptƒ • l € ≈k’⁄xvu p ’⁄ysslΠs1txx  ≅反应体积 ≅ k提取液总量Π提取液用量lΠ样品鲜质量
1 .6 ∃πΗ的测定
在互作体系中 o用 ⁄∞×„ vus ³‹计定时测定互作体系中 ³‹值 o用定时互作体系中实测 ³‹值减去互作
前测得的 ³‹值即得到该互作时间 ∃ ³‹的变化k…¤®¨µετ αλqot||vl ∀
u 试验结果
2 .1 Ο2 # −的变化
用激发子粗提液处理 Œp zu杨和加杨悬浮细胞 o各互作系统中悬浮细胞 ’u# p 的释放及其变化如图 t ∀
互作体系中 oŒp zu杨悬浮细胞 ’u# p的释放表现出 ’u# p产生/氧化突发0现象 o即 ’u# p释放量先增加再减少 ∀
加杨悬浮细胞在粗提液作用下 o’u# p释放量一直处于较低水平 o总体水平还低于对照 ~比较对照矫正后抗病
|y 第 t期 冯 莹等 }杨树与杨盘二孢菌激发子互作进程中活性氧的释放及膜脂过氧化
的 Œp zu杨和感病的加杨 ’u# p释放量 o显示抗病的 Œp zu杨比感病的加杨的 ’u# p释放量在总体上高出很多 o
特别在互作 u «时 o差别最大 ∀
2 .2 膜脂过氧化变化
在 Œp zu杨和加杨悬浮细胞与粗提液互作过程中 o悬浮细胞膜脂过氧化的变化均为先上升而后下降 ∀
Œp zu杨和加杨相比 o前者在互作 t «后细胞膜脂过氧化急剧上升 o而后缓慢下降 ~后者在互作 u «后才大幅
上升 ∀经过各自对照进行矫正 o再来比较感病杨树和抗病杨树在膜脂过氧化上的差异 ∀总的来讲 o感病杨树
和抗病杨树在激发子物质处理后 o膜脂过氧化的变化无明显差别k图 ul ∀
图 t 杨盘二孢菌滤液粗提液处理 Œp zu杨和
加杨悬浮细胞 ’u # p变化值的比较
ƒ¬ªqt ≤²°³¤µ¬¶²± ²©·«¨ ¦«¤±ª¨¶²© ’u# p ³µ²§∏¦·¬²± ²©
Œp zu ¤±§ Πq χαναδενσι󷵨¤·¨§º¬·«¦µ∏§¨ ¨¯¬¦¬·²µ
²© Μq βρυννεα
图 u 杨盘二孢菌滤液粗提液处理 Œp zu杨和加杨
悬浮细胞膜脂过氧化变化值的比较
ƒ¬ªqu ≤²°³¤µ¬¶²± ²©·«¨ ¦«¤±ª¨¶²© ° °¨¥µ¤±¨ ¬¯³¬§
³¨µ²¬¬§¤·¬²± ²©Œp zu ¤±§ Πq χαναδενσι󷵨¤·¨§
º¬·«¦µ∏§¨ ¨¯¬¦¬·²µ²© Μq βρυννεα
2 .3 ∃πΗ的变化
先测定杨树悬浮细胞的 ³‹ 值 o再测定激发子粗提液处理后的互作体系的 ³‹ 值 o计算各处理的 ∃³‹ ∀
随着处理时间的推移 o不管是对照还是处理 o∃³‹变化均有一定的波动 ∀但经对照矫正后可以明显看出 o抗
病树种 Œp zu杨粗提液的处理 ³‹变化增幅明显高于感病加杨k图 vl ∀
图 v 杨盘二孢菌滤液粗提液处理 Œp zu杨和
加杨悬浮细胞 ∃³‹变化值的比较
ƒ¬ªqv ≤²°³¤µ¬¶²± ²© ∃³‹ ¦«¤±ª¨¶²©Œp zu ¤±§ Πq χαναδενσισ
·µ¨¤·¨§º¬·«¦µ∏§¨ ¨¯¬¦¬·²µ²© Μq βρυννεα
v 讨论
植物被病原体感染 o发生过敏反应时有大量活性氧
产生和积累 o这种现象称为氧化暴发k²¬¬§¤·¬√¨ ¥∏µ¶·l ∀植
物体内的活性氧主要是 }过氧化氢k‹u ’ul !超氧阴离子
k’u# p l !羟自由基k#’‹l和单线态氧kt ’ul ∀活性氧在植
物抗病防卫反应中有着极其重要和积极的生理作用k傅
爱根等 ousssl ∀大量研究表明在寄主植物和病原菌互作
的早期常有氧化暴发现象 o这些释放的活性氧在寄主植
物防卫反应及信号传递过程中都扮演着重要的角色 ∀大
量的寄主植物互作系统中都发现了这一现象 o包括寄主
植物与真菌 !细菌和病毒的互作 ∀活性氧的产生是一个
典型的往往在互作的早期发生的现象 o对其后的一系列
防卫事件及互作关系的确定具有重要的作用k…¤®¨µετ αλqot||v l ∀另外 o细胞间的 ³‹的变化与氧化突发也
紧密相关 o并且通过 ³‹值的提高 o使膜上相关的蛋白被激发k‹¤«¯¥µ²¦® ετ αλqot||x ~≥¨ ª¤¯ ετ αλqot|{tl ∀在本
研究中 o抗病的 Œp zu杨悬浮细胞 ’# pu 的释放表现出了/氧化突发0现象 o而感病的加杨悬浮细胞 ’# pu 释放量
一直处于较低水平 ~³‹的变化也有同样的规律 o这一结果与 ⁄²®¨ kt|{vl和 ’µ¯¤±§¬等kt||tl的研究结果相类
似 ∀抗病树种表现的这一规律 o将有助于对杨树抗病性遗传和抗病基因的研究 ∀
„§¤°等kt|{|l在研究香假单孢k Πqσψρινγαε ³√ q πισιl引发烟草k Νιχοτιανα τοβαχυµl悬浮细胞叶片或黄瓜
k Χυχυµισσατιϖυσl子叶的 ‹• 中 o证明 ’u# p直接启动膜脂过氧化的发生 o说明氧突发和膜脂过氧化有一定的因
sz 林 业 科 学 wv卷
果关系 ∀但在本研究中 o虽然感病杨树和激发子互作后活性氧的释放水平一直很低 o但膜脂过氧化水平却在
u «后也有一个高峰 o只是比抗病杨树慢 t «∀抗病杨树和感病杨树的膜脂过氧化差异 o主要区别是否在于发
生的时间上而不是水平上 o这一点还要做进一步的证明 ∀
参 考 文 献
毕咏梅 o欧阳光察 qt||s q稻瘟诱导物对水稻苯丙烷类途径酶系和绿原酸的诱导作用 q植物生理学通讯 ouykvl }t{ p us
傅爱根 o罗广平 o王爱国 qusss q活性氧在植物抗病反应中的作用 q热带亚热带植物学报 o{ktl }yv p y|
梁伟红 o韩正敏 qussy q杨盘二孢菌激发子粗提物生物活性的研究 q南京林业大学学报 ovskvl }zt p zw
王 影 o黄敏仁 qt||t q杨树细胞悬浮培养及体细胞胚胎发生的研究 q南京林业大学学报 otxkvl }vt p vy
余叔文 o汤章城 qt||| q植物生理与分子生物学 qu版 q北京 }科学出版社 ovyy p v{|
„§¤° „ oƒ¤µ®¤¶× o≥²°¬¼¤¯ Š o ετ αλqt|{| q ≤²±¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© ’u# p ª¨ ±¨ µ¤·¬²± §∏µ¬±ª¤¥¤¦·¨µ¬¤¬±§∏¦¨§«¼³¨µ¶¨±¶¬·¬√¨ µ¨¤¦·¬²± ¬±·²¥¤¦¦²} ⁄¨ ·¨µ¬²µ¤·¬²± ²©
°¨ °¥µ¤±¨ ¬¯³¬§¶q°«¼¶¬²¯ ²¯ °¯ ¤±·°¤·«²¯ ovw }tv p t|
…¤®¨µ≤ o ²¦® ‘  o Š¯¤½¨ ±¨ µo ετ αλqt||v q • ¦¨²ª±¬·¬²± µ¨¶³²±¶¨ ¬± ³¤·«²ª¨ ±Π±²±p«²¶·¤±§µ¤¦¨Π¦∏¯·¬√¤µ¬±·¨µ¤¦·¬²±¶¬±√²¯√¬±ª¶²¼¥¨¤± ¤±§³¶¨∏§²°²±¤¶
¶¼µ¬±ª¤¨ ³¤·«²√¤µ¶q°«¼¶¬²¯ ²¯ °¯ ¤±·°¤·«²¯ owvkul }{t p |w
≤∏µµ¬±§¨µ≥ ≤ qt|{| q≥²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤±§³¯¤±·µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²±©µ²° ¦¨¯¯ ¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¤±§·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²© °¤·∏µ¨ ‹¬°¤¯¤¼¤± ³²³∏¯¤µk Ποπυλυσχιλιαταl q°¯ ¤±·
≤¨¯¯ • ³¨²µ·o{ }tuw p tuz
⁄²®¨ ‘qt|{v1 Œ±√²¯√ °¨ ±¨·²© ¶∏³¨µ²¬¬§¨ ¤±¬²± ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ¬± ·«¨ «¼³¨µ¶¨±¶¬·¬√¨ µ¨¶³²±¶¨ ²© ³²·¤·² ·∏¥¨µ·¬¶¶∏¨¶·² ¬±©¨¦·¬²± º¬·« ¤± ¬±¦²°³¤·¬¥¯¨µ¤¦¨ ²©
Πηψτοπητηορα ινφερσταν󤱧·²·«¨ «¼³«¤¯ ¦¨¯¯ º¤¯¯¦²°³²±¨ ±·¶q°«¼¶¬²¯ °¯ ¤±·°¤·«²¯ ouv }vwx p vxz
‹¤«¯¥µ²¦® Žo≥¦«¨ ¨¯ ⁄o²ª¨ °¤±± ∞o ετ αλqt||x1 ’¯ ¬ª²³¨ ³·¬§¨ ¨¯¬¦¬·²µ2° §¨¬¤·¨ §¨©¨ ±¶¨ ª¨ ±¨ ¤¦·¬√¤·¬²±¬± ¦∏¯·∏µ¨§³¤µ¶¯ ¼¨ ¦¨¯¯ q°µ²¦‘¤·¯ „¦¤§≥¦¬˜ q≥ q„ qo
|u }wtxs p wtxz
Ž¨³³¯ µ¨⁄o…¤®¨µ≤ qt|{|1 Œ±¬·¬¤·¨§ ¬¯³¬§³¨µ²¬¬§¤·¬²±¬± ¤¥¤¦·¨µ¬¤2¬±§∏¦¨§«¼³¨µ¶¨±¶¬·¬√¨µ¨¤¦·¬²±¬±·²¥¤¦¦² ¦¨¯¯ ¶∏¶³¨ ±·¬²±¶q°«¼·²³¤·«²¯²ª¼ oz| }xxx p
xyu
’µ¯¤±§¬∞ • o ‹∏·¦«¨¶²± ≥ • o…¤¦®¨µ≤ qt||u q∞¤µ¯¼ ³«¼¶¬²¯²ª¬¦¤¯ µ¨¶³²±¶¨ ¤¶¶²¦¬¤·¨ º¬·«µ¤¦¨p¶³¨¦¬©¬¦µ¨¦²ª±¬·¬²±¬±¶²¼¥¨¤± ¯¨ ¤©·¬¶¶∏¨ ¤±§¦¨¯¯ ¶∏¶³¨ ±¶¬²±
·µ¨¤·¨§º¬·« Πσευδοµονασσψρινγαε ³√ q γλψχινεα q°«¼¶¬²¯ ¤±§ ²¯ °¯ ¤±·°¤·«²¯ ows }tzv p tz|
≥ ª¨¤¯ „ • o Š¨ ¬¶²º  oŠ¤µ¦¬¤ • o ετ αλqt|{t q׫¨ µ¨¶³¬µ¤·²µ¼ ¥∏µ¶·²©³«¤ª²¦¼·¬¦¦¨¯¯ ¬¶¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«¤µ¬¶¨ ¬± √¤¦∏²¯¤µ³‹ q‘¤·∏µ¨ ou|s }wsy p ws|
k责任编辑 朱乾坤l
tz 第 t期 冯 莹等 }杨树与杨盘二孢菌激发子互作进程中活性氧的释放及膜脂过氧化