全 文 ：第 ww卷 第 ts期
u s s {年 ts 月
林 业 科 学
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’¦·qou s s {
银杏 Œ¶³ƒ基因的克隆与功能分析 3
彭梅芳t 阳义健t 杨春贤t 陈 敏u 廖志华t
kt1 西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室 重庆 wssztx ~ u1西南大学药学院 重庆 wssztxl
摘 要 } 采用 • „≤∞技术 o从银杏中获得 ∞°途径中的第 x个酶 u p ≤ p甲基 p ⁄p赤藓醇 p u ow p环焦磷酸合成
酶kŒ¶³ƒl基因的全长 ¦⁄‘„ o命名为 ΓβΙσπΦkŠ¨ ±…¤±®登录号 }∞ƒsyuxz|l ∀该基因 ¦⁄‘„全长为 {|z ¥³o包含 zus ¥³的
开放阅读框 o编码 uv|个氨基酸残基的蛋白 o在 Š¥Œ¶³ƒ的 ‘p端有一个长为 x|个氨基酸残基的质体转运肽 ~序列
多重比对表明 Š¥Œ¶³ƒ与其他植物 Œ¶³ƒ同源 ∀利用半定量 • ×2°≤• 对 ΓβΙσπΦ进行组织表达谱分析 o结果表明 ΓβΙσπΦ
在银杏根 !茎 !叶 !果中均有表达 o但表达量差异较大 o在叶中表达量最高 o在根中表达量最低 ∀功能互补分析表明
ΓβΙσπΦ能推动工程菌 ÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ n ³„≤2…∞ׄ超量表达 Βp胡萝卜素 o在颜色互补平板上呈现 Βp胡萝卜
素特有的橘黄色 o证实 ΓβΙσπΦ具有典型的 Œ¶³ƒ基因功能 ∀
关键词 } 银杏 ~Œ¶³ƒ ~基因克隆 ~生物信息学分析 ~功能互补
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 } „ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lts p ssw| p sy
收稿日期 }ussz p tu p tu ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目/银杏内酯前体生物合成途径中关键酶基因的克隆与分析0kvsxssvsvl ∀
3 廖志华为通讯作者 ∀感谢 ≤∏±±¬±ª«¤°博士k美国 ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ ²© ¤µ¼¯¤±§l提供质粒 ³„≤2…∞ׄ和 ³×µ¦„·Œ°Œ∀
Χλονινγ ανδ Φυνχτιοναλ Αναλψσισ οφ α Νεω ΙσπΦ Γενεφροµ Γινκγο βιλοβα
°¨ ±ª  ¬¨©¤±ªt ≠¤±ª ≠¬­¬¤±t ≠¤±ª≤«∏±¬¬¤±t ≤«¨ ± ¬±u ¬¤² «¬«∏¤t
kt1 ΚεψΛαβορατορψοφ Εχο2Ενϖιρονµεντσιν Τηρεε Γοργεσ Ρεσερϖοιρ Ρεγιον οφ Μινιστρψοφ Εδυχατιον Σχηοολοφ Λιφε Σχιενχεσo
Σουτηωεστ Υνιϖερσιτψ Χηονγθινγ wssztx ~ u1 Χολλεγε οφ ΠηαρµαχευτιχαλΣχιενχεσo Σουτηωεστ Υνιϖερσιτψ Χηονγθινγ wssztxl
Αβστραχτ} u2≤2°¨ ·«¼¯2⁄2 µ¨¼·«µ¬·²¯ u ow2¦¼¦¯²§¬³«²¶³«¤·¨ ¶¼±·«¤¶¨ kŒ¶³ƒl ¬¶·«¨ ©¬©·« ±¨½¼°¨ ¬±√²¯√¨ §·«¨ ∞° ³¤·«º¤¼q׫¨
ª¨ ±¨ º¤¶¦¯²±¨ §©µ²° Γινκγο βιλοβα ¥¼ ∏¶¬±ª • „≤∞ ·¨¦«±²¯²ª¼o¤±§ º¤¶§¨¶¬ª±¤·¨§¤¶ ΓβΙσπΦ kŠ¨ ±…¤±® ¤¦¦¨¶¶¬²± ‘²q}
∞ƒsyuxz|l q׫¨ ©∏¯¯ 2¯ ±¨ª·«¦⁄‘„ ²© ΓβΙσπΦ¬¶{|z ¥³¦²±·¤¬±¬±ª¤zus ¥³²³¨ ±µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ k’• ƒl ±¨¦²§¬±ª¤uv|2¤°¬±²2
¤¦¬§³²¯¼³¨ ³·¬§¨ º¬·«¤x|2¤°¬±²2¤¦¬§³¯¤¶·¬§¬¤¯ ·µ¤±¶¬·³¨³·¬§¨ ¤·¬·¶‘2·¨µ°¬∏¶q׫¨ °∏¯·¬³¯¨¤¯¬ª±°¨ ±·¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §Š¥Œ¶³ƒ
º¤¶«²°²¯²ª²∏¶º¬·«Œ¶³ƒ¶§¨µ¬√¨ §©µ²° ²·«¨µ³¯¤±·¶³¨¦¬¨¶q≥¨ °¬2 ∏´¤±·¬·¤·¬√¨ • ×2°≤• º¤¶¦¤µµ¬¨§²∏··²¬±√¨ ¶·¬ª¤·¨·«¨ ·¬¶¶∏¨
¬¨³µ¨¶¶¬²± ³µ²©¬¯¨ ²© ΓβΙσπΦ¬± §¬©©¨µ¨±··¬¶¶∏¨¶¬±¦¯∏§¬±ªµ²²·¶o¶·¨°¶o¯¨ ¤√¨ ¶¤±§¶¨ §¨¶q ׫¨ µ¨¶∏¯·¶¶«²º¨ §·«¤· ΓβΙσπΦ
¬¨³µ¨¶¶¬²±¦²∏¯§¥¨ §¨·¨¦·¨§¬± ¤¯¯·«¨ ·¬¶¶∏¨¶¥∏·¤·§¬©©¨µ¨±·¯ √¨¨ ¶¯q׫¨ «¬ª«¨¶·¨ ¬³µ¨¶¶¬²±¯¨ √¨ ¯ º¤¶©²∏±§¬±¯¨ ¤√¨ ¶º«¬¯¨ ·«¨
²¯º¨ ¶·¨ ¬³µ¨¶¶¬²±¯¨ √¨ ¯ º¤¶©²∏±§¬±µ²²·¶qƒ∏±¦·¬²±¤¯ ¦²°³¯ °¨¨ ±·¤·¬²±¤¶¶¤¼¬±§¬¦¤·¨§·«¤·ΓβΙσπΦ¦²∏¯§³µ²°²·¨·«¨ Β2¦¤µ²·¨±¨
¤¦¦∏°∏¯¤·¬²±¬± ±¨ª¬±¨ µ¨¨§÷t2…¯ ∏¨ «¤¥²µ¬±ª³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ ¤±§³„≤2…∞ׄ o¤±§¤¶¤µ¨¶∏¯··«¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¨§¥¤¦·¨µ¬¤¶«²º¨ §·«¨
¥µ¬ª«·¯¼ ²µ¤±ª¨ ¦²¯²µª¬√¨ ± ¥¼ Β2¦¤µ²·¨±¨ q׫¬¶¶∏ªª¨¶·¨§·«¤·ΓβΙσπΦ«¤§·«¨ ·¼³¬¦¤¯ ©∏±¦·¬²± ²©®±²º±Œ¶³ƒ ª¨ ±¨ ¶q
Κεψ ωορδσ} Γινκγο βιλοβα~Œ¶³ƒ ~¦¯²±¬±ª~¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¤±¤¯¼¶¬¶~©∏±¦·¬²±¤¯ ¦²°³¯ °¨¨ ±·¤·¬²±
银杏k Γινκγο βιλοβαl是著名的孑遗植物 o含有多种药用活性成分 o主要包括银杏内酯和黄酮类kŠ²±ª ετ
αλqoussxl ∀其中银杏内酯是目前最好的血小板活化因子受体的天然专一拮抗剂 o广泛应用于治疗心血管疾
病kŽ¬° ετ αλqoussy¤l ∀银杏内酯在天然银杏中含量很低 o我国出产的优质银杏干叶中仅为 s1sy h k∂¤± …¨ ®¨
ετ αλqot||tl o但市场需求巨大 o使得其价格居高不下 o高达 us万美元#®ªptk韩金玉等 ousssl ∀近年来 o寻找
和扩大银杏内酯药源研究十分活跃 o包括 }tl 银杏内酯化学全合成k≤µ¬°°¬±¶ ετ αλqousssl ~ul 银杏组织培
养k¤∏µ¤¬± ετ αλqot||zl及毛状根的诱导k„¼¤§¬ετ αλqoussvl ~vl 利用基因工程技术遗传改良银杏 o开展银
杏内酯代谢工程研究 ∀而开展银杏内酯代谢工程的前提是阐明其生物合成的分子机制 o即分离该途径上多
个酶促反应步骤的基因 o进行功能验证和表达研究 o考察目的基因在银杏内酯生物合成途径中的作用 o为银
杏内酯的代谢工程提供候选基因和作用靶点 ∀银杏内酯属于萜类化合物 o由萜类物质共用 x碳前体异戊烯
基焦磷酸k¬¶²³¨ ±·¨±¼¯ §¬³«²¶³«¤·¨oŒ°°l和它的异构物二甲基烯丙基焦磷酸k§¬°¨ ·«¼¯ ¤¯ ¼¯¯ §¬³«²¶³«¤·¨o⁄„°°l
k¤µ∏¼¤°¤ ετ αλqot|yzl为骨架合成 ∀主要是以来源于三羧酸循环的丙酮酸k³¼µ∏√¤·¨l和 v p 磷酸甘油醛
kª¯¼¦¨µ¤¯§¨«¼§¨ v2³«²¶³«¤·¨oŠv°l为底物 o经过定位于质体的 ∞°途径k∞¬¶¨±µ¨¬¦« ετ αλqousst ~≥¦«º¤µ½ot||wl
合成 Œ°°和 ⁄„°° o二者再经一系列羟化和酰化等酶促反应最终合成银杏内酯k图 tl ∀Œ¶³ƒ是 ∞°途径中
的第 x个酶 o是银杏内酯生物合成途径中的关键酶 o也可能是其次生代谢工程的重要靶点 ∀本研究采用
• „≤∞技术克隆银杏 Œ¶³ƒ基因全长 ¦⁄‘„ o并对其进行相关生物信息学分析 !组织表达谱分析和对该基因进
行功能验证 o为最终实现银杏内酯的代谢工程提供候选基因和作用靶点 ∀
图 t 由 ∞°途径提供前体物质的银杏内酯生物合成途径
ƒ¬ªqt Š¬±®ª²¯¬§¨ ¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶·«µ²∏ª«·«¨ ∞° ³¤·«º¤¼
图 u 银杏 ΓβΙσπΦ¦⁄‘„全长序列和由此推测的氨基酸序列
ƒ¬ªqu ׫¨ ©∏¯¯ 2¯ ±¨ª·«¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤±§·«¨ §¨§∏¦¨§
¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© ΓβΙσπΦ
编码区和翻译的氨基酸用大写字母表示 o非编码区k˜×• l用小写字母表示 o
终止密码子用 3 表示 o画横线处为质体转运肽 ∀ ׫¨ ¦²§¬±ª¶¨ ∏´¨ ±¦¨
¤±§¬·¶§¨§∏¦¨§¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤µ¨ ¶«²º±¬± ¦¤³¬·¤¯ ¯¨ ·¨µ¶o
¤±§·«¨ ˜×• ¤µ¨ ¶«²º±¬± ¶°¤¯¯¯¨ ·¨µ¶q׫¨ ¶·²³¦²§²± k׊„l ¬¶°¤µ®¨ §
º¬·«¤± ¤¶·¨µo·«¨ ³¯¤¶·¬§¬¤¯ ·µ¤±¶¬·³¨ ³·¬§¨ ¬¶∏±§¨µ¯¬±¨ §q
t 材料与方法
111 材料
银杏种植于西南大学校园k重庆北碚l ∀
v月中旬采集幼叶 o{月中旬采集同株的根 !
茎 !果 o经液氮速冻后贮藏于 p zs ε 冰箱中
备用 ∀³„≤2…∞ׄ 和 ³×µ¦„·Œ°Œ质粒 !大肠杆
菌 ÷t2…¯ ∏¨ 由西南大学生命科学学院天然
产物与代谢工程实验室保存 ∀
112 方法
t1u1t 银杏总 • ‘„的提取 取 p zs ε 冰箱
中保存的银杏幼叶 !根 !茎 !果各 s1t ªo用
• ‘„³¯¤±·试剂盒k天为时代 o北京l分别提取
总 • ‘„ o存于 p zs ε 冰箱备用 ∀
t1u1u ΓβΙσπΦ核心片段的获得 ΓβΙσπΦ核
心片段特异性引物根据同源序列设计 o正向
引物 §©ΓβΙσπΦ}xχ2„׊Š≤׊≤≤Š≤„××≤×≤׊≤2vχ o反向引物 §µΓβΙσπΦ}xχ2×≤„≤××≤××≤„×≤„„„„Š×„≤„„×׊2
vχ ∀¦⁄‘„第一链合成使用 פŽ¤•¤ • ‘„ °≤• Ž¬·k„ ∂l o按照试剂盒操作手册合成¦⁄‘„链 ∀以¦⁄‘„为模板
进行 °≤• 扩增 o反应条件为 }|w ε 预变性 x °¬±~|w ε 变性 wx ¶oxx ε 退火 wx ¶ozu ε 延伸 t °¬±o共 vs个循
环 ~最后 zu ε 总延伸 ts °¬±∀°≤• 产物纯化按照上海赛百盛基因技术有限公司的 °≤• 产物纯化试剂盒说明
操作 o将回收产物与 ³⁄t{2×连接后转化 ⁄‹xΑo进行蓝白斑筛选 o挑取白斑进行菌落 °≤• 检测 o阳性克隆送
至上海英骏生物技术有限公司
测序 ∀测序结果进行 …„≥× 分
析以获得 ΓβΙσπΦ核心片段 ∀
t1u1v ΓβΙσπΦ全长 ¦⁄‘„ 的获
得 根据 ΓβΙσπΦ核心片段序列
设计 • „≤∞ 引物 } ΓβΙσπΦv2t }
xχ2ŠŠ×≤××≤≤׊„≤„×׊ŠŠ≤„2
vχ oΓβΙσπΦv2u }xχ2×׊„„ŠŠ„ŠŠ
≤ŠŠ×„≤Š×≤2vχ ~ ΓβΙσπΦx2t } xχ2
Š„≤Š×„≤≤Š≤≤×≤≤ ××≤„„2vχ o
ΓβΙσπΦx2u } xχ2׊≤≤≤„„׊×≤„
ŠŠ„„Š„ ≤≤2vχ ∀ • „≤∞2°≤• 扩
增按照 ≥„• × • „≤∞ ¦⁄‘„ 扩
增试剂盒k≤¯ ²±·¨¦«l的说明书进
行 ∀ • „≤∞产物的纯化 !克隆及
测序 按 上 述 步 骤 操 作 ∀ vχ
• „≤∞!xχ • „≤∞和核心片段进
行电子拼接 k ∂ ¦¨·²µ ‘׌ ≥∏¬·¨
{1sl获得全长 ¦⁄‘„ 序列 o根据
sx 林 业 科 学 ww卷
图 v 银杏 Š¥Œ¶³ƒ和其他植物 Œ¶³ƒ¶氨基酸序列的多重比对
ƒ¬ªqv ∏¯·¬2¤¯¬ª±° ±¨·²©¤°¬±²¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²© Š¥Œ¶³ƒ ¤±§²·«¨µ³¯¤±·Œ¶³ƒ¶
一致氨基酸和保守氨基酸残基分别显示为黑色背景和灰色背景 ~其他氨基酸残基用黑色字体白
色背景表示 ∀ ⁄{ !‹ts ! ‹wu k±u n结合位点l 保守活性位点用 ν 表示 o∞tvx kªun或 ±u n结合位
点l保守活性位点用 π表示 ∀ ׫¨ ¬§¨±·¬¦¤¯ ¤°¬±²¤¦¬§¶¤µ¨ ¶«²º±¬± º«¬·¨ º¬·« ¥¯¤¦® ¥¤¦®ªµ²∏±§¤±§·«¨
¦²±¶¨µ√¨ §¤°¬±²¤¦¬§¶¤µ¨ ¶«²º± ¬± ¥¯¤¦® º¬·«ªµ¤¼ ¥¤¦®ªµ²∏±§o²·«¨µ¤°¬±² ¤¦¬§¶¤µ¨ ¶«²º± ¬± ¥¯¤¦® º¬·«
º«¬·¨ ¥¤¦®ªµ²∏±§q/ ν 0 ¬±§¬¦¤·¨¶¤°¬±²¤¦¬§¶¦²²µ§¬±¤·¬±ªº¬·«½¬±¦¬²±q ¤ª±¨ ¶¬∏° ²µ°¤±ª¤±¨ ¶¨ ¬²± ¥¬±§¬±ª
¶¬·¨¬¶°¤µ®¨ §º¬·« / π 0 q
拼接序列设计全长特异性引物 o
正向引物 ©¬ΓβΙσπΦ} xχ2„×≤„Š„
„≤×≤„××≤Š×„×××≤×≤≤2vχ o反向
引物 µ¬ΓβΙσπΦ}xχ2Š×„„„ŠŠ×≤„
ׄŠ×„„׊ŠŠ≤≤2vχ o克隆获得
物理全长 ¦⁄‘„序列 ∀
t1u1w 序列分析 序列比对均
使用 ∂ ¦¨·²µ‘׌≥∏¬·¨ {1s软件和
…¯¤¶·°u1u1v k «·³}ΠΠººº q ±¦¥¬q
±¯ ° q±¬«qª²√l进行分析 ~’• ƒ的
查找和核苷酸的翻译在 «·³}ΠΠ
ººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√ 网站的
’• ƒ ƒ¬±§¨µ 上 完 成 ~ 用
≤˜÷ׄ÷ k ׫²°³¶²± ετ αλqo
t||zl进行多重序列比对 o用
∞Š„v1skŽ∏°¤µ ετ αλqo usswl
中的 临 位 相 联 法 k ±¨ ¬ª«¥²µ2
­²¬±¬±ªo‘l构建进化树 ~蛋白质
基本性质及转运肽的分析使用
«·³}ΠΠººº q¨¬³¤¶¼q²µª网站提供
的相关生物信息学分析软件进
行 ∀
t1u1x 组织差异表达分析 以
银杏根 !茎 !叶 !果 • ‘„为材料 o
利用看家基因 t{≥ µ• ‘„kt{≥ƒ }
xχ2„׊„ׄ„≤×≤Š„≤ŠŠ„×≤Š≤2
vχ和 t{≥• } xχ2≤×׊Š„׊׊Š×
„Š≤≤Š×××2vχl为内参照 o调整
各样品 • ‘„ 浓度 o采用半定量
²±¨ 2¶·¨³ • ×2°≤• kפŽ¤•¤l研究
ΓβΙσπΦ在不同组织中的表达情
况 o正 向 引 物 ©ΓβΙσπΦ} xχ2
„׊Š≤׊≤≤Š≤„××≤×≤׊≤ 2vχ o
反向引物 µΓβΙσπΦ}xχ2×≤„≤××≤
××≤„×≤„„„„Š×„≤„„×׊2vχ ∀
°≤• 反应条件为 xs ε vs °¬±o
|w ε u °¬±~然后 |w ε vs ¶o
xx ε vs ¶ozu ε u °¬±o共 vs个循环 ~最后 zu ε 总延伸 ts °¬±∀
t1u1y ΓβΙσπΦ基因的功能验证 设计带 Βγλ µ !Εχο• ´酶切位点的引物 o用高保真 פ´ 酶扩增 ΓβΙσπΦ ’• ƒ
片段 o连 ×载体转化 ⁄‹xΑ∀上游引物为 ©ΓβΙσπΦ}xχ2≤≤„Š„×≤ׄ׊Š≤׊≤≤Š≤„××≤×≤׊≤2vχk画线处为 Βγλ
µ酶切位点l ~下游引物为µΓβΙσπΦ}xχ2≤≤Š„„××≤×≤„≤××≤××≤„×≤„„„„Š×„≤„„×׊2vχk画线处为 Εχο• ´酶
切位点l ∀抽提质粒 !双酶切 !回收小片段获得 ΓβΙσπΦo将本实验室保藏的质粒 ³×µ¦„·Œ°Œo用 Βγλµ !Εχο• ´双
酶切后回收大片段骨架 o连接构建好 ³×µ¦2 ΓβΙσπΦo转化携带了 ³„≤2…∞ׄ质粒的大肠杆菌 ÷t2…¯ ∏¨ o在 …n
tss °ª#2t „°³n xs °ª#pt ≤°的双抗平板上筛选阳性克隆获得携带 ³×µ¦2Š¥Œ¶³ƒ2³„≤2…∞ׄ的工程菌 ∀用拟
南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναlŒ¶³ƒ基因导入 ³×µ¦获得 ³×µ¦2„·Œ¶³ƒ o将 ³×µ¦2„·Œ¶³ƒ和 ³„≤2…∞ׄ导入 ÷t2…¯ ∏¨ 获得
tx 第 ts期 彭梅芳等 }银杏 Œ¶³ƒ基因的克隆与功能分析
图 w 预测的 Š¥Œ¶³ƒ二级结构
ƒ¬ªqw ׫¨ ³∏·¤·¬√¨¶¨¦²±§¤µ¼ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ²© Š¥Œ¶³ƒ
«qΑp螺旋 „¯ ³«¤ «¨ ¬¯¬~¦q随机卷曲 • ¤±§²° ¦²¬¯~
¨q延伸链 ∞¬·¨±§¨§¶·µ¤±§q
图 x 银杏 Š¥Œ¶³ƒ与其他物种 Œ¶³ƒ¶的分子进化树聚类分析
ƒ¬ªqx „ ³«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²© Š¥Œ¶³ƒ ¤±§²·«¨µ¶³¨¦¬¨¶Œ¶³ƒ¶
细菌分支用 ρ表示 o植物分支用 σ表示 ∀分支上的数字为自引导值 o
重复次数为 t sss次 ∀Œ¶³ƒ¶©µ²° ¥¤¦·¨µ¬¤¤µ¨ °¤µ®¨ §º¬·« / ρ 0
¤±§Œ¶³ƒ¶©µ²° ³¯¤±·¶º¬·« / σ 0 q׫¨ ±∏°¥¨µ¶²±·«¨ ¥µ¤±¦«¨¶
µ¨³µ¨¶¨±··«¨ ¥²²·¶·µ¤³√¤¯∏¨¶¶∏³³²µ·¨§©²µt sss µ¨³¯¬¦¤·¨¶q
工程菌作为阳性对照 ∀
用限制性内切酶 Πστ ´单酶切 ³×µ¦„·Œ°Œ质
粒 o切去 ³×µ¦„·Œ°Œ质粒携带的来源于拟南芥的
Œ°Œ基因编码区 o回收大片段 o按照 ⁄‘„ ‹¬ª«
¬ª¤·¬²±试剂盒方案自连该大片段获得不带 Œ°Œ
基因的空质粒 ³×µ¦o转化 ⁄‹xΑ感受态 o涂布在
…n tss °ª#pt „°³平板上 o挑取阳性菌斑扩
大培养 o质粒纯化试剂盒抽提质粒并进行酶切
检测 o获得 ³×µ¦空菌 o按照上述转化方法 o分别
将 ³×µ¦n ³„≤2…∞ׄ !³×µ¦2Š¥Œ¶³ƒ 导入 ÷t2…¯ ∏¨
菌株 o获得对照菌株 ∀
在平板上挑取 ÷t2…¯ ∏¨ !÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦2Š¥Œ¶³ƒ !÷t2…¯ ∏¨ n ³„≤2…∞ׄ !÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦n ³„≤2…∞ׄ !÷t2
…¯ ∏¨ n ³×µ¦2Š¥Œ¶³ƒ n ³„≤2…∞ׄ的单菌落 o在…n tss °ª#pt „°³n xs °ª#pt ≤°的双抗平板上划线 ou{ ε 倒
置暗培养 zu «o获得颜色互补平板 o以验证其功能 ∀
u 结果与分析
211 基因 ΓβΙσπΦ的克隆
银杏总 • ‘„反转录为 ¦⁄‘„后 o以 §©ΓβΙσπΦ和 §µΓβΙσπΦ为引物 o¦⁄‘„为模板进行 °≤• 扩增 o获得一条
特异性扩增的条带 o回收目的片段 o亚克隆后测序 o结果表明该片段长 ztz ¥³o经 …„≥×分析初步鉴定为银杏
Œ¶³ƒ基因核心片段 o并命名为 ΓβΙσπΦ∀根据所得片段设计基因特异性引物用于扩增 ΓβΙσπΦ的 ¦⁄‘„末端 o通
过 vχ2• „≤∞和 xχ2• „≤∞分别获得 vyu ¥³的 vχ p末端和 xxv ¥³xχ p末端 ∀将 ΓβΙσπΦ基因的 v个片段拼接后获
得其全长 ¦⁄‘„并最终扩增获得其物理全长 o测序结果表明 ΓβΙσπΦ基因全长 {|z ¥³k图 ul oŠ¨ ±…¤±®登录号
为 ∞ƒsyuxz| ∀
212 基因 ΓβΙσπΦ的生物信息学分析
ΓβΙσπΦ全长 ¦⁄‘„包含一个长度为 zus ¥³的 ’• ƒ o编码含 uv|个氨基酸残基的蛋白kŠ¥Œ¶³ƒl ∀ Š¥Œ¶³ƒ分
子量预测为 zw1{xw ®∏o等电点为 x1tt ∀ Š¥Œ¶³ƒ的 …¯¤¶·°分析结果表明 o该序列与 Š¨ ±…¤±®中的甜菊k Στεϖια
ρεβαυδιαναl !长春花 k Χατηαραντηυσ
ροσευσl !橡胶树k Ηεϖεα βρασιλιενσισl !
三尖杉 k Χεπηαλοταξυσ φορτυνειl 的
Œ¶³ƒ 氨基酸序列一致性分别为
{x h !{x h !{u h !zy h o初步表明
ΓβΙσπΦ是银杏内酯生物合成途径
上的功能基因 o编码 u p ≤ p甲基 p
⁄p赤藓醇 p u ow p 环焦磷酸合成
酶 ∀
Š¥Œ¶³ƒ与其他植物来源的 Œ¶³ƒ
具有较高的同源性 o但在蛋白质不
同区域表现出不同的相似度 o在该
类蛋白质 ‘端即转运肽区域 o相似
度极小 ~而在催化功能区域 o相似
度很高k图 vl ∀ Š¥Œ¶³ƒ与其他用于
比对的 Œ¶³ƒ 序列均包含典型的
Œ¶³ƒ蛋白最保守活性位点 ⁄{ !‹ts !
‹wu k±un 结合位点l !∞tvx k ªun
或 ±un 结合位点l k¤µ¦«¯ µ¨2…¤∏¨µ
ετ αλqousswl ∀用 פµª¨·°和 ≤«¯²µ²°
ux 林 业 科 学 ww卷
对 Š¥Œ¶³ƒ进行亚细胞定位预测 o发现 Š¥Œ¶³ƒ在 ‘端带有 x|个氨基酸残基的质体转运肽 o与 ∞°途径定位
于质体的理论相符k¤∏¯¨ ετ αλqoussvl k图 ul ∀在 ∞¬³¤¶¼中进一步预测 Š¥Œ¶³ƒ的二级结构 o显示 Š¥Œ¶³ƒ中
随机卷曲占 yx1uz h oΑp螺旋占 ux1xu h o延伸链占 |1ut h k图 wl ∀
用 ≤˜≥ׄ÷ 和 ∞Š„v1s软件对 Š¥Œ¶³ƒ进行分子系统发育树分析 o结果显示 oŒ¶³ƒ¶在进化树上分为 u
支 }一支为细菌类 o另一支为植物类 o表明细菌和植物中 Œ¶³ƒ差异较大 ∀其中 Š¥Œ¶³ƒ与来源于三尖杉和曼
地亚红豆杉k Ταξυσ µεδιαl的Œ¶³ƒ在进化树上最接近 o表明Œ¶³ƒ在裸子植物中分子进化水平较为一致 k图 xl o
都是较为古老的植物 ∀
图 y ΓβΙσπΦ在银杏不同组织中的差异表达
ƒ¬ªqy ∞¬³µ¨¶¶¬²± ³µ²©¬¯¨ ²© ΓβΙσπΦ¬± §¬©©¨µ¨±·
·¬¶¶∏¨¶²© Γ q βιλοβα
213 ΓβΙσπΦ的组织差异表达分析
根据 ΓβΙσπΦ编码区设计特异性引物 o以 t{≥ µ• ‘„为内参 o
对该基因在银杏茎 !叶 !果实 !根中的表达情况进行组织表达谱
分析 ∀显示 ΓβΙσπΦ在上述组织中均有表达 o但表达量存在较大
差异 o在叶中的表达量最高 o其次为果实和茎 o在根中表达量最
低k图 yl ∀表明 ΓβΙσπΦ的表达具有很强的组织特异性 o表达量
图 z ΓβΙσπΦ在大肠杆菌
÷t2…¯ ∏¨ 中的颜色互补
ƒ¬ªqz ׫¨ ©∏±¦·¬²±¤¯ ¦²°³¯ °¨ ±¨·¤·¬²± ²©
ΓβΙσπΦ¬± Ε q χολι ¶·µ¤¬± ÷t2…¯ ∏¨
÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ n ³„≤2…∞ׄ 超表达推动
代谢 流 o生 成 黄 色 的 类 胡 萝 卜 素 ∀ ׫¨
±¨ª¬±¨ µ¨¨§ ÷t2…¯ ∏¨ «¤¥²µ¬±ª³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ ¤±§³„≤2
…∞ׄ ¦²∏¯§²√¨ µ¨¬³µ¨¶¶¤±§³µ²°²·¨ ·«¨ Β2¦¤µ²·¨±¨
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最高的叶中银杏内酯含量也最高k≤¤µ·¤¼µ¤§¨ ετ αλqot||zl o初步说明
ΓβΙσπΦ可能是银杏内酯生物合成中的关键酶基因 ∀
214 基因 ΓβΙσπΦ的遗传功能互补分析
大肠杆菌本身不能产生 Βp胡萝卜素 o但能提供其 x碳前体 Œ°°
和 ⁄„°°∀ ≤∏±±¬±ª«¤°等kusssl把与 Βp胡萝卜素生物合成相关的 w
个基因构建到 ³„≤2…∞ׄ质粒上 o该质粒导入大肠杆菌中就可以在菌
中重建 Βp胡萝卜素生物合成途径 o但只能在本底水平上表达 o其原因
是上游限速步骤的存在 ∀将 ³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ导入该菌后 o在原核表达强启
动子 ×µ¦的驱动下 oΓβΙσπΦ在大肠杆菌中过量表达 o突破了上游代谢瓶
颈 o推动萜类代谢流向 Βp胡萝卜素合成的方向流动 o使该菌能大量生
产 Βp胡萝卜素 ∀
在获得的颜色互补平板上 o作为对照的 ÷t2…¯ ∏¨ 空菌 !÷t2…¯ ∏¨ n
³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ和 ÷t2…¯ ∏¨ n ³„≤2…∞ׄ由于不是双抗菌株 o不能在双抗平
板上生长 ~÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦n ³„≤2…∞ׄ虽然能在双抗平板上生长 o但
仅能在本底水平上表达 Βp胡萝卜素 o菌体仍然呈现大肠杆菌本身的
白色 ~只有 ÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦Š¥Œ¶³ƒ n ³„≤2…∞ׄ由于突破了上游限速步
骤 o可以大量积累 Β2胡萝卜素 o经过 zu «的培养 o菌体呈现 Βp胡萝卜
素特有的橘黄色 o同时作为阳性对照组的 ÷t2…¯ ∏¨ n ³×µ¦„·Œ¶³ƒ n ³„≤2
…∞ׄ的菌体也呈现出特有的橘黄色k图 zl ∀从而证明了在 ΓβΙσπΦ和
³„≤2…∞ׄ上携带的几个外源基因的共同作用下 o可以推动代谢流向
Βp胡萝卜素合成的方向流动 o表明 ΓβΙσπΦ是一个与拟南芥 ΙσπΦ功能相同的基因 ∀
v 讨论
银杏是植物中的/活化石0 o是连接远古植物和现代植物的纽带 ∀银杏提取物中含有多种药用次生代谢
产物 o其活性成分研究最多的是银杏黄酮和萜类化合物 o随着研究的进一步深入 o证实属于二萜类天然代谢
产物的银杏内酯是治疗心血管疾病最有效的天然药物之一 o但在天然银杏中含量很低 ∀基因工程技术是提
高包括银杏内酯在内的植物次生代谢产物含量的最有效手段之一 ∀本文采用 • „≤∞技术从银杏中克隆了银
杏内酯生物合成途径上的 ΓβΙσπΦo为进一步研究萜类代谢途径提供一定依据 o为今后利用基因工程技术提高
银杏内酯含量打下一定基础 ∀
 ∂ „途径作为经典的萜类前体生物合成途径 o一直被认为是萜类 x碳前体合成的唯一通道 ~us世纪 |s
年代 o独立于  ∂ „途径的 ∞°途径k•²«°¨ µετ αλqot||vl才首先在细菌和植物中被发现 o该途径也能提供萜
类 x碳前体 ∀该途径的发现为阐明银杏内酯的化学起源提供了依据 o证实作为二萜类的银杏内酯是由定位
于质体的 ∞°途径提供 x碳前体 Œ°°和 ⁄„°°∀韩国一个研究组先后从银杏中克隆了 ∞°途径中的前 v
vx 第 ts期 彭梅芳等 }银杏 Œ¶³ƒ基因的克隆与功能分析
个酶 }Š¥⁄÷≥tkŽ¬° ετ αλqoussxl oŠ¥⁄÷≥ukŽ¬° ετ αλqoussy¤l oŠ¥⁄÷• kŽ¬° ετ αλqoussy¤l和 Š¥∞≤×kŽ¬° ετ
αλqoussy¥l ∀而银杏 ∞°途径中的第 x个酶 Œ¶³ƒ少有报道 o该酶催化 ≤⁄°2∞°转变为 u p甲基 p ⁄p赤藓
醇 p u ow p环焦磷酸ku2≤2°¨ ·«¼¯ µ¨¼·«µ¬·²¯ u ow2¦¼¦¯²§¬³«²¶³«¤·¨o ∞2¦°°l ∀在长春花中过量表达 ΙσπΦ有利于代
谢流向更下游的方向 o其表达量与长春花中单萜吲哚生物碱k°²±²·¨µ³¨ ±²¬§¬±§²¯¨¤¯®¤¯²¬§¶l的积累呈正相关
k∂ ¤¨∏ ετ αλqousssl o可以预测在银杏中过量表达 ΙσπΦ有可能提高其银杏内酯的含量 ∀本研究从银杏中成功
克隆出 {|z ¥³的基因 ΓβΙσπΦ全长序列 o采用基于遗传功能互补的策略 o验证了 ΓβΙσπΦ的功能 o为同类基因功
能分析提供了一种简便快速 !结果易于分析的方法 ∀银杏 Œ¶³ƒ基因的克隆和功能分析为进一步在分子水平
和生物化学水平阐明该基因及其编码的酶在银杏内酯合成中的作用提供目的基因 o也可为实现银杏内酯代
谢工程提供候选基因 ∀
参 考 文 献
韩金玉 o李海静 o褚巧伟 o等 qusss1 天然药物银杏内酯研究进展 q化工进展 okul }uv p ux q
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k责任编辑 徐 红l
wx 林 业 科 学 ww卷