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第 vx卷 第 x期t | | |年 | 月
林 业 科 学
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银杏非根尖细胞的染色体观察
王玉梅 李懋学 尤瑞麟
k北京大学生命科学学院 北京 tss{ztl
摘 要 } 由于雌雄异株植物银杏的种子及幼苗无法区分性别 o因而在研究其性别时不能用传统的种子萌发取
根的方法来进行染色体制片 o而从雌 !雄成株上取根也不切实可行 ∀为解决该问题 o本文以银杏的幼小花药 !
叶 !胚珠以及小孢子 !雌配子体游离核为材料 o主要采用放线菌酮k≤¼¦¯²«¨ ¬¬°¬§¨ otss °ªr®ªl作预处理药物 o常
规制片均得到了优良的染色体标本 ∀
关键词 } 银杏 o放线菌酮 o染色体
ΟΒΣΕΡ ς ΑΤΙΟΝ ΟΝ ΧΗΡ ΟΜΟΣΟΜΕΣ ΟΦ ΓΙΝΚΓΟ ΒΙΛΟΒΑ
ΒΨ ΥΣΙΝΓ ΜΑΤΕΡΙΑΛΣ ΡΑΤΗΕΡ ΤΗΑΝ Ρ ΟΟΤ2ΤΙΠ ΧΕΛΛΣ
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( Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχεσ, Πεκινγ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtss{zt)
Αβστραχτ : ׫¨ ¶¨¬²©¤±¼²±¨ ²©¶¨ §¨¶¤±§¶¨ §¨¯¬±ª¶²©§¬²¨ ¦¬²∏¶ Γινκγο βιλοβᦤ± ±²·¥¨ ¬§¨ ±·¬©¬¨§o¶² º¨
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Κεψ ωορδσ: Γινκγο βιλοβα qo≤¼¦¯²«¨ ¬¬°¬§¨ o≤«µ²°²¶²°¨
银杏k Γινκγο βιλοβα ql为我国特有的裸子植物 o具有较高的综合经济价值k韩宁林 ot||yl ∀由于
银杏为严格的雌 !雄异株植物 o而雌 !雄株的应用价值不同 o但其性别往往需 us多年后始花时方可辨
别 o因而成为合理栽培应用的难点k何 梅等 ot||yl ∀长期以来 o对银杏幼苗的早期性别鉴定一向为人
们所关注 ∀它不仅具有潜在的应用价值 o而且对探讨植物的性别分化也有重要的理论意义 ∀
在银杏的性别研究中 o尤以染色体的研究居多 o但至今仍是一个有争议的问题k何 梅等 ot||y ~
¨¨≤ ot|xw ~≤«¨ ± ∏¬2¼¤±ª ετ αλ. ot||vl ∀最近 o我们拟以 ⁄ 分子原位杂交k± ≥¬·∏ ¼¥µ¬§¬½¤2
·¬²±l技术对其性别分化进行研究 o碰到的首要技术难点便是染色体制片的取材问题 ∀种子根不能区分
性别 o因而不可用 o从雌 !雄成株上取根也不切实可行 o因此 o我们尝试以雌 !雄成株其他器官或组织为
材料 o进行染色体观察 o试验证明是可行的 o而且效果颇佳 ∀它不仅能提供用于性别研究的染色体标
本 o如以幼小花药 !幼小胚珠和幼叶材料 o也能提供更易于作核型分析的单倍染色体 o如以小孢子有丝
分裂和雌配子体游离核材料 ∀这对于难以获得种子或种子不易萌发的不少木本植物以及雌 !雄异株植
物的细胞遗传学研究而言 o可能具有重要的实用价值 ∀
t 材料和方法
111 材料
北京大学校园内的雌 !雄银杏成年植株 ∀
112 取材k见表 tl
表 1 取材时间 !方法及材料的形态特征
Ταβ .1 Τιµε ανδ µετηοδσ οφ χολλεχτινγ πλαντ µατεριαλσανδ τηειρ µορπηολογιχ χηαραχτεριστιχσ
材料
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取材时间k北京 ot||{l
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形态特征
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取材方法
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幼小花药
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v月上 !中旬k减数分裂以前l
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雄花膨大但芽鳞未展开
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于雄花基部约 x °° 处斜切 o将切面
插入预处理液中
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小孢子
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w月上旬k减数分裂后一周左
右l
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芽鳞完全展开 o花药呈黄绿色
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取整个花药固定
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幼叶
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v月中 !下旬至 w月上旬
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芽鳞尚未展开的营养枝幼芽
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剥去鳞片 o切取幼芽固定
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幼小胚珠
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w月上 !中旬
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雌株短枝上的芽鳞未展开至完全展
开 o花柄及胚珠呈嫩黄色至绿色
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从花柄基部切下处理
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雌配子体游离
核
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x月中 !下旬
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胚珠发育至直径 t¦°左右
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切除珠被部分 o只留雌配子体处理
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113 预处理
小孢子无需预处理 o直接用卡诺固定液固定 ∀雌配子体游离核用对二氯苯饱和水溶液 ots ε ∗
us ε o处理约 x «∀幼小花药 !叶 !胚珠用 tss °ªr®ª放线菌酮水溶液于室温避光活体处理 o时间分别约
为 uw «!| «和 { «∀水洗后用卡诺固定液固定 ∀
114 解离 !染色和压片
小孢子不必解离 o直接用乙酸洋红染色压片 ∀幼小花药与胚珠用 t°²¯r ≤¯于 ys ε 解离约 tx
°¬±∀雌配子体解离或不解离均可 ∀幼叶需强解离条件 }既可用浓 ≤¯p |x h乙醇ktΒtl o室温解离约
us °¬±o也可用 t °²¯r≤¯室温解离约 tx °¬±o充分水洗后 o再用u h纤维素酶 ) 果胶酶kwΒtl的混合
酶液于 vs ε ∗ vz ε 酶解约 y «o水洗去酶液 o固定 o卡宝品红染色及压片 ∀
u 结果
211 幼小花药与胚珠
银杏的雌花和雄花均分别着生于雌 !雄株的短枝顶部 o且均自叶腋间伸出 ∀雄花 荑花序状 o但实
际上仅为 t花 o无花被 o雄蕊多数 o每个雄蕊具 t短柄 o上载 t对长形小花粉囊k偶见 v ∗ w花粉囊者lk郭
善基 ot||vl ∀北京地区的 v月上 !中旬 o雄株短枝上的休眠芽明显膨大 o芽鳞稍微张开 o此时正是花药
快速发育时期 o药壁细胞和造孢细胞进行旺盛的有丝分裂k图版 ´ p tl ∀此时取材最为适宜 o可获得较
好的染色体图象ku± uwl ∀雌花较简单 o在细长的花柄上着生 t对裸露的胚珠 o胚珠下部具珠托k郭善
基 ot||vl ∀因其与幼叶混生 o需仔细识别 ∀取材既可与雄花同时进行 o也可延续至开花以后较长一段
时间 o因珠被和珠心细胞的有丝分裂活动仍在继续进行 o因此 o取材时间比雄花宽松得多 o而且经验表
明 o其分裂指数似比花药更高 o也更易获得较好的染色体图象ku± uwlk图版 ´ p x !zl o完全适用于核
型分析k图版 ´ p |l ∀在图象k图版 ´ p zl中 o明显可见那对大型的 染色体可能发生过不等易位 ∀
212 小孢子
小孢子母细胞经减数分裂所产生的小孢子经过 v次有丝分裂而发育为成熟花粉k郭善基 ot||vl o
理论上讲 o其间均可取材观察染色体 o但实际上只有单核小孢子第 t次分裂最为适合 o因此时的细胞空
间较大 o壁也薄 o染色和压片都易于操作 ∀通常在减数分裂后 y ∗ {天进入小孢子第 t次分裂 o此时花
v x期 王玉梅等 }银杏非根尖细胞的染色体观察
药呈黄绿色 o可大量取材k李懋学等 ot||tl ∀无需进行预处理和细胞的解离 o经固定后用乙酸洋红压
片 ∀同一花药内其小孢子分裂不同步 o可看到小孢子有丝分裂的各个不同时期 ∀其分裂中期的染色
体 o虽未用药物进行预处理 o也自行缩短而易于分散 o可准确计数 o其 ± tuk图版 ´ p u !vl ∀
213 幼叶
植物叶片在生长发育的早期 o主要以细胞的分裂活动来增加其体积 ∀春天 o银杏营养枝上的芽已
膨大但芽鳞尚未展开时取材处理 o也可获得较好的染色体图象k图版 ´ p wl o同样适用于核型分析k图
版 ´ p tsl ∀相对而言 o幼叶的组织结构复杂 o还有维管组织和某些分泌物的干扰 o在制片方法上 o以 t
°²¯r≤¯处理后再用酶处理较好 ∀
214 雌配子体
银杏胚珠内的大孢子母细胞减数分裂产生 w个大孢子 o其中 v个退化 o只有近合点端的 t个发育
为功能大孢子 ∀在北京地区 o从 w月中旬减数分裂完成至 y月中旬约 u个月时间内 o功能大孢子有丝
分裂 ts多次 o产生大量的游离核 ∀这些游离核都是单倍体k± tulk图版 ´ p yl o由于没有细胞壁 o故
而很易于制片 ∀
v 讨论
试验证明 o用银杏的非根尖材料观察染色体是完全可行的 o它不仅能提供作为性别研究的染色体
标本 o如以幼小花药 !幼小胚珠和幼叶为材料 o也能提供更易于作核型分析的单倍染色体 o如以小孢子
有丝分裂和雌配子体游离核为材料 ∀这对于难以获得种子或种子不易萌发的不少木本植物而言 o可能
具有重要的实用价值 ∀而对于雌 !雄异株植物的细胞遗传学研究 o也同样有借鉴作用 ∀
在上述试验材料中 o如以细胞分裂指数 !取材和制片操作的难易为指标比较 o则以幼小胚珠k在被
子植物中则为幼小子房l最佳 o其次为幼小花药和幼叶 ∀幼小子房作为染色体的观察材料在牡丹和芍
药中已有成功的报道k张赞平等 ot||s ~李懋学 ot|{ul o是除根尖外值得重视的首选材料 ∀诚然 o它受季
节性的限制而有不利之处 o但也有同时可获取大量材料的优点可以弥补 ∀经预处理后的材料可存于固
定液或乙醇中保存在冰箱里备用 ∀
幼小花药 !胚珠k或子房l !幼叶等 o其器官的表面往往覆以疏水的果胶类物质 !其它分泌物或附属
物 o不同植物之间其差别较大 o按通常的预处理方法操作 o药物渗透困难 o预处理条件相对难以掌握 o因
而其效果欠佳 ∀我们改用一种新的预处理液 ) ) ) 放线菌酮k≤¼¦¯²«¨ ¬¬°¬§¨ l对上述器官进行活体处理 o
即只将上述器官的基部切口浸入预处理液中进行处理 o因其未伤及器官本身而又排除了器官表面物质
的干扰 o使细胞能保持相对长时间处于活体状态 o更能耐受药物的毒害而不致死 o因而易于获得较好的
染色体图象 ∀试验证明 o这是非常有效的方法 ∀此外 o放线菌酮是一种蛋白质合成的抑制剂k李懋学
等 ot||yl o它不仅可抑制纺锤丝微管蛋白的合成和组装 o而且也可抑制有丝分裂过程中其他功能蛋白
的合成而导致晚前期和早中期的染色体提前浓缩k图版 ´ p {l o因而提高可计数染色体的细胞数量 ∀
这对于染色体计数统计或进行染色体 ⁄分子原位杂交都是有利的 ∀
参 考 文 献
郭善基主编 q中国果树志k银杏卷l q北京 }中国林业出版社 ot||v }wy ∗ w{
韩宁林 o张云跃编著 q银杏生产百事问 q北京 }中国农业出版社 ot||y }ut ∗ vt
何 梅 o李懋学 q银杏雌株染色体 ªp 的研究 q遗传 ot||y ot{kvl }v ∗ x
李懋学 o张 方编著 q植物染色体研究技术 q哈尔滨 }东北林业大学出版社 ot||t }tu
李懋学 q芍药花粉的二型性和雄核在体内的发育 q植物学报 ot|{u ouwktl }tz ∗ us
李懋学等 q作物染色体及其研究技术 q北京 }中国农业出版社 ot||y }u|
张赞平等 q牡丹染色体的 ≤ p带和 ªp 研究 q武汉植物学研究 ot||s o{ }tst ∗ tsz
≤«¨ ± ∏¬¼¤±ªo≥²±ª • ±¨ ¬´± o¬÷¬∏¯¤± o ετ αλ. ¶·∏§¼ ²±·«¨ ¶¨¬¦«µ²°²¶²° ¶¨²© Γινκγο βιλοβα . ≤¤·«¤¼¤ot||v ox }wt ∗ w{
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w 林 业 科 学 vx卷
王玉梅等 }银杏非根尖细胞的染色体观察ktzss ≅ l 图版 ´
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µ¤·«¨µ·«¤±µ²²·2·¬³¦¨¯¯¶ktzss ≅ l °¯ ¤·¨ ´
t q花药细胞中期分裂相k未经预处理 ou± uwl ~u !v q小孢子中期分裂相k± tul ~w q雄银杏幼叶细胞中期分裂相ku± uwl ~x q幼嫩胚
珠细胞中期分裂相ku± uwl ~y q雌配子体游离核中期分裂相k± tul ~z q幼嫩胚珠细胞中期分裂相ku± uw o示大型 染色体不等
易位l ~{ q前期染色体超期浓缩图象 ~| q雌银杏核型k对应于图版 ´2xl ~ts q雄银杏核型k对应于图版 ´2wl ∀
t q ¬·²¶¬¶° ·¨¤³«¤¶¨ ²©·«¨ ¤±·«¨µ¦¨¯¯ kº¬·«²∏·³µ¨·µ¨¤·° ±¨·ou± uwl ~u !v q ·¨¤³«¤¶¨ ²©·«¨ °¬¦µ²¶³²µ¨¶k± tul ~w q ·¨¤³«¤¶¨ ²©
·«¨ °¤¯¨¼²∏±ª¯¨ ¤©¦¨¯¯ku± uwl ~x q ¬·²¶¬¶° ·¨¤³«¤¶¨ ²©·«¨ ¼²∏±ª²√∏¯¨¦¨¯¯ ku± uwl ~y q ·¨¤³«¤¶¨ ²©©µ¨ 2¨±∏¦¯ ¤¨µ²©·«¨ ª¤° ·¨²2
³«¼·¨ k± tul ~z q ¬·²¶¬¶° ·¨¤³«¤¶¨ ²©·«¨ ¼²∏±ª²√∏¯¨¦¨¯¯ ku± uw o¶«²º¬±ª∏±¨ ∏´¤¯ ·µ¤±¶¯²¦¤·¬²± ²© ¦«µ²°²¶²° ¶¨l ~{ q≥«²º¬±ª
³µ¨¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©·«¨ ³µ²³«¤¶¨ ¦«µ²°²¶²° ¶¨~| q ׫¨ ®¤µ¼²·¼³¨ ²© Γινκγο βιλοβα k α l ~ts q ׫¨ ®¤µ¼²·¼³¨ ²© Γ . βιλοβα k ⎯ l q