全 文 ： 收稿日期 }t||y2sz2uv q
3 参加工作的还有复旦大学生命科学学院病毒研究室的乐云仙和苏德明同志 o云南林业科学研究所陈世维 !广东
省茂名林业科学研究所邓常发参加本研究部分工作 o特此一并致谢 ∀
马尾松毛虫质型多角体病毒
单克隆抗体的制备和应用 3
朱光旦 林 军 沈中建 钟 江
k复旦大学生命科学学院病毒研究室 上海 usswvvl
陈昌洁
k中国林业科学院森林保护研究所 北京 tsss|tl
摘 要 } 纯化的马尾松毛虫质型多角体病毒k⁄³≤°∂l云南文山株的病毒粒子经 ≥⁄≥2°„Š∞分析 o其结构蛋白有
tus®§!tty®§!tts®§!yy®§和 vv®§x 个组分 o而它的多角体蛋白含 vs®§和 u{®§两个主要组分 ∀以纯化的
⁄³≤°∂ 粒子为抗原制备了 u⁄x !u⁄ts !v⁄w和 y…v共 w种单克隆抗体 o并测定了它们的亚类 ∀制得的单克隆抗体用
于 ⁄³≤°∂ 的 ∞Œ≥„检测 ∀对 ⁄³≤°∂ 在棉铃虫卵巢细胞系 ≥ƒ∞2‹„2{utu和 ≥ƒ∞2‹„2{vt中增殖动态的检测结果
表明 o⁄³≤°∂ 感染培养细胞具有释放病毒量小和呈现持续感染等特点 ∀用 • ¶¨·¨µ±印迹法在 ≥ƒ∞2‹„2{vt细胞感
染 ⁄³≤°∂ 后第 t{«检测到病毒抗原的合成 ∀运用所建立的免疫学检测方法 o对几批采自 ⁄³≤°∂ 防治林区的幼
虫样品进行分析 o结果表明 o该方法适用于对 ⁄³≤°∂ 的防治效果及其自然流行进行长时期 !大规模的监测 ∀
关键词 } 马尾松毛虫质型多角体病毒 o单克隆抗体 o生物防治
ΠΡΕΠΑΡ ΑΤΙΟΝ ΑΝ∆ ΑΠΠΛΙΧΑΤΙΟΝ ΟΦ ΜΟΝΟΧΛΟΝΑΛ ΑΝΤΙΒΟ∆ΙΕΣ ΑΓΑΙΝΣΤ
∆ΕΝ∆Ρ ΟΛΙΜΥΣ ΠΥΝΧΤΑΤΥΣ ΧΨΤΟΠΛΑΣΜΙΧ ΠΟΛΨΗΕ∆Ρ ΟΣΙΣ ςΙΡ ΥΣ
«∏ Š∏¤±ª§¤± ¬± ∏± ≥«¨ ± «²±ª­¬¤± «²±ª¬¤±ª
( ςιρολογψ Ρεσεαρχη Υνιτ , Σχηοολοφ Λιφε Σχιενχεσ, Φυδαν Υνιϖερσιτψ Σηανγηαιusswvv)
≤«¨ ± ≤«¤±ª­¬¨
( Χηινεσε Αχαδε µ ψ οφ Φορεστρψ Βειϕινγtsss|t)
Αβστραχτ : ƒ¬√¨¶·µ∏¦·∏µ¤¯ ³²¯¼³¨ ³·¬§¨¶oº¬·« °²¯ ¦¨∏¯¤µº ¬¨ª«·¶²©tus ®§otty ®§otts ®§oyy ®§¤±§vv
®§oµ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ oº µ¨¨ ©²∏±§¬± ≥⁄≥2°„Š∞ ³µ²©¬¯¨ ²©³∏µ¬©¬¨§√¬µ∏¶³¤µ·¬¦¯ ¶¨²© ∆ενδρολι µ υσ πυνχτατυσχψ2
τοπλασµιχ πολψηεδροσισ ϖιρυσ k⁄³≤°∂ l o• ±¨¶«¤± k≠∏±±¤± °µ²√¬±¦¨l ¶·µ¤¬±q⁄³≤°∂ ³²¯¼«¨ §µ²± ¦²±·¤¬±¶
·º² °¤­²µ³²¯¼³¨ ³·¬§¨¶²© ° qº qvs ®§¤±§u{ ®§q ƒ²∏µ°²±²¦¯²±¤¯ ¤±·¬¥²§¬¨¶o¤¶u⁄x ou⁄ts ov⁄w ¤±§
y…v oº µ¨¨ ³µ¨³¤µ¨§¤ª¤¬±¶·³∏µ¬©¬¨§ ⁄³≤°∂ ³¤µ·¬¦¯ ¶¨o¤±§·«¨¬µ¶∏¥¦¯¤¶¶¨¶º µ¨¨ §¨·¨µ°¬±¨ §q ׫¨ ¶¨ °²±²2
¦¯²±¤¯ ¤±·¬¥²§¬¨¶º µ¨¨ ∏¶¨§¬± ⁄³≤°∂ §¨·¨¦·¬²± ¥¼ ∞Œ≥„ q • ¶¨∏¯·¶²¥·¤¬±¨ §¬± √¬·µ² ⁄³≤°∂ µ¨³¯¬¦¤·¬²±¬±
≥ƒ∞2‹ „2{utu ¤±§ ≥ƒ∞2‹ „2{vt ¦¨¯¯¶k²√¤µ¬¤± ¦¨¯¯ ¬¯±¨ ¶©µ²° Ηελιχοϖερπα αρµιγεραl ¶«²º §¨·«¤··«¨ ¶¨
¦¨¯¯¶º µ¨¨ ³¨µ¶¬¶·¨±·¯¼¬±©¨¦·¨§o«²º √¨ µ¨o·«¨ µ¨¯¨ ¤¶¨ ²©√¬µ∏¶³¤µ·¬¦¯ ¶¨¬±·²·«¨ ¦∏¯·∏µ¨ ° §¨¬∏° º¤¶¶¨ §¯²°
§¨ °²±¶·µ¤·¨§qŒ± • ¶¨·¨µ± ¥¯²··¬±ªo·µ¤¦¨¶²©√¬µ¤¯ ¤±·¬ª¨ ±¶º µ¨¨ §¨·¨¦·¨§¬± ≥ƒ∞2‹ „2{vt ¦¨¯¯¶t{ «²∏µ¶¤©2
·¨µ⁄³≤°∂ ¬±©¨¦·¬²±q…¤·¦«¨¶²© ∆ενδρολι µ υσ ¤¯µ√¤¨ ¦²¯¯¨ ¦·¨§©µ²° ³¬±¨ ©²µ¨¶·¶¬± Š∏¤±ª§²±ª¤±§≠∏±±¤±
³µ²√¬±¦¨¶º µ¨¨ ¬¨¤°¬±¨ §¥¼ ·«¨ ¬°°∏±²¯²ª¬¦¤¯ §¨·¨¦·¬²± ·¨¦«±¬´∏¨ §¨¶¦µ¬¥¨ § «¨ µ¨ q • ¶¨∏¯·¶¦²±©¬µ° §¨¬·¶
©¨©¬¦¤¦¼¬± ²¯±ª2·¨µ° °²±¬·²µ¬±ª²© ⁄³≤°∂ ¬± ∆ενδρολι µ υ󦲱·µ²¯ ¤±§¬·¶ ³¨¬§¨ °¬¦¶¬± ±¤·∏µ¨ q
Κεψ ωορδσ: ∆ενδρολιµυσ πυνχτατυσχψτοπλασµιχ πολψηεδροσισϖιρυσ, ²±²¦¯²±¤¯ ¤±·¬¥²§¼o…¬²¯²ª¬¦¤¯ ¦²±·µ²¯
质型多角体病毒( Χψτοπλασµιχ πολψηεδροσισ ϖιρυσεσ,≤°∂¶l是呼肠孤病毒科k• ²¨√¬µ¬§¤¨ l中一个相当
第 vx卷 第 t期t | | |年 t 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤ „∞
∂ ²¯1vx o ‘²1t
¤± qot | | |
于属一级的分类阶元 o即 Χψποϖιρυσ∀ ≤°∂¶的寄主仅限于昆虫 o能在宿主中肠细胞的细胞质内形成蛋
白质多角体 o成熟的病毒粒子即包埋在其中 ∀幼虫感染 ≤°∂ 后 o食欲减退 !发育缓慢 o甚至死亡 ∀由于
≤°∂¶在害虫防治方面有广阔前景 o加上其本身较独特的分子生物学特性 o在国内外都已有了许多研究
k…¨ ¯¯²±¦¬® ≥ ot|{| ~°¤¼±¨ ≤≤ ετ αλ. ot|{v ~苏德明 ot|{{l≈t ∗ v  ∀
≤°∂ 感染力强 o其慢性感染有利于虫口内部个体间的传播 o也有很好的传代感染效果 o因此作为病
毒制剂应用能体现出持效优势 o特别适用于森林害虫的防治 ∀国内外应用 ≤°∂ 防治林业害虫已有了
许多成功的例子 o其中 o松毛虫质型多角体病毒的应用已成为松毛虫综合防治工作中的重要一环 ∀从
zs年代开始 o国内学者对松毛虫 ≤°∂ 进行了大量研究 o同时在野外防治中也取得了丰富的经验k陈昌
洁 ot||s ~刘润忠等 ot||u ~沈中建等 ot||wl≈w ∗ y  ∀
为了对松毛虫质型多角体病毒在虫体内和昆虫细胞系中的增殖过程作进一步研究 o同时对松毛虫
≤°∂ 在林间的持续防治效果进行系统的监测 o我们制备了该病毒的单克隆抗体 o建立了一套灵敏 !专一
性强 !简便有效的确定病毒相对数量的 ∞Œ≥„检测方法 ∀
t 材料与方法
1 q1 病毒粒子和多角体蛋白的纯化
试验病毒为马尾松毛虫质型多角体病毒( ∆ενδρολι µ υσ πυνχτατυσ χψτοπλασµιχ πολψηεδροσισ ϖιρυσεσ,
⁄³≤°∂ l文山株 o由云南省堰心林场惠赠 ∀
多角体的纯化 !多角体蛋白的分离纯化及多角体蛋白和病毒粒子结构蛋白的电泳分析按徐左宇等
方法kt|{yl≈z  ~病毒粒子的分离纯化参考巫爱珍等的方法kt|z{l≈{  ∀
1 .2 ∆πΧΠς 单克隆抗体的制备
单抗的制备和生产 以纯化的病毒粒子为抗原制备单抗 o参考于善谦等的方法k于善谦等 o
t|{yl≈|  ∀
腹水效价测定 使用间接 ∞Œ≥„方法 ∀usΛªr°抗原 tssˏ包被酶标板k华美生物工程公司l o
一抗为不同稀释度腹水 o二抗为辣根过氧化物酶联羊抗鼠 ŒªŠk华美生物工程公司l o邻苯二胺 s qw °ªr
°为底物 ou‘‹u≥’wxsˏ终止酶反应 o用 ⁄Š2Œ型酶联免疫吸附试验检测仪测 w|s ±°处 Ο . ∆ .值 ∀
单克隆抗体亚类鉴定 杂交瘤细胞置于无血清 ⁄ ∞ kŠŒ…≤ ’l培养液中培养 o其上清用于单抗
亚类鉴定 ∀亚类鉴定使用间接 ∞Œ≥„方法 o一抗为待测抗体 o二抗为辣根过氧化物酶联羊抗鼠各亚类
ŒªŠk上海生物制品研究所l ∀
1 .3 ∆πΧΠς 感染两株棉铃虫细胞系后病毒抗原合成和病毒增殖动态检测
细胞系 棉铃虫卵巢细胞系 ≥ƒ∞2‹ „2{vtk≥∏⁄ ετ αλ. ot|{zl≈ts  ≥ƒ∞2‹ „2{utu为本实验室建
立 ∀使用 … 2× ≤2ts培养基kŠŒ…≤ ’l o加 tx h小牛血清 ∀
病毒感染试验参考沈中建等的方法kt||wl≈y  ∀
⁄³≤°∂ 在细胞系中增殖动态的检测 细胞感染病毒后 o间隔一定时间取样 o用生理盐水洗涤细
胞 o加 t °包被液ks qsx °²³‹| q{碳酸盐缓冲液l悬浮细胞 o反复冻融 owsssµr°¬±离心 x °¬±o取 tss
ˏ上清液用 ∞Œ≥„方法检测 o以未感染病毒的细胞作阴性对照 ∀
• ¶¨·¨µ±印迹法检测感染细胞中病毒抗原的合成 细胞感染病毒后 o间隔一定时间取样 o用生理盐
水悬浮细胞并离心 o细胞沉淀加 tssˏ样品缓冲液 o沸水浴 v °¬±o电泳试验参考徐左宇等方法
kt|{yl≈z  ∀取下胶 o使用 • ¶¨·¨µ±印迹法测定病毒抗原 o方法参考 ≥¤°¥µ²²® kt|{|l≈tt  ∀一抗为
⁄³≤°∂ 多角体蛋白多抗和几株病毒粒子单抗的混和抗体 ∀
1 .4 ∆πΧΠς 感染室内培养的松毛虫后增殖动态的检测
松毛虫幼虫感染病毒后 ox§内每天取 ts条 o剖出中肠 o加 s qx °包被液充分研磨 owsssµr°¬±离
心 x °¬±o取 tssˏ上清液k其中含有游离在多角体外的病毒粒子l用 ∞Œ≥„ 方法检测 ∀沉淀k含有多
角体l加 s qx °碱液ks qsx °²‘¤≤¯os qsu °²‘¤u≤ ’v o³‹ts q{l充分悬浮 ovx ε 水浴 t«o加 s qt °²
³‹y qs磷酸缓冲液调节 ³‹ 至 | qy owsssµr°¬±离心 ts °¬±o取 tssˏ上清k含有从多角体内释放出的
病毒粒子l用 ∞Œ≥„方法检测 ∀一抗为各病毒粒子单抗的混和抗体 ∀
ty t期 朱光旦等 }马尾松毛虫质型多角体病毒单克隆抗体的制备和应用
1 .5 林区采集的虫样体内 ∆πΧΠς 的检测
单条虫加少量重蒸水充分研磨 o弃虫渣 ∀悬液 wsssµr°¬±离心 x °¬±o取沉淀 o用重蒸水再离心洗
涤一次后加 s qx °碱液 ∀以后步骤同 t qw ∀
图 t 纯化的 ⁄³≤°∂ 多角体蛋白和病毒粒子 ≥⁄≥2
°„Š∞
ƒ¬ªqt ≥⁄≥2°„Š∞ ²©³∏µ¬©¬¨§ ⁄³≤°∂ ³²¯¼«¨ §µ¬± ¤±§
√¬µ∏¶³¤µ·¬¦¯ ¶¨
t q虫体内提取的多角体蛋白 ~u q标准分子量蛋白 }|w ®§!yz
®§!wv ®§!vs ®§!us qt ®§和 tw qw ®§~v q在 ≥ƒ∞2‹ „2{utu中
增殖的 ⁄³≤°∂ 的多角体蛋白 ~w q纯化 ⁄³≤°∂ 粒子的蛋白 ∀
t q °²¯¼«¨ §µ¬± ¬¨·µ¤¦·¨§ ©µ²° ¬±©¨ ¦·¨§ ¤¯µ√¤¨ ~u q≥·¤±§¤µ§
³²¯¼³¨ ³·¬§¨¶}|w ®§oyz ®§owv ®§ovs ®§ous qt ®§¤±§tw qw
®§~v q°²¯¼«¨ §µ¬± ¬¨·µ¤¦·¨§ ©µ²° ⁄³≤°∂2¬±©¨ ¦·¨§ ≥ƒ∞2‹ „2
{utu ¦¨¯¯¶~w q°µ²·¨¬±¶²©³∏µ¬©¬¨§⁄³≤°∂ ³¤µ·¬¦¯ ¶¨q
u 结果
2 q1 病毒粒子和多角体蛋白的纯化
从电泳结果可以看出 o多角体蛋白有 vs®§和 u{®§两个主要成分 o而病毒粒子结构蛋白经电泳分
离出 tus®§!tty®§!tts®§!yy®§和 vv®§x个组分k图 tl o这一结果与家蚕 ≤°∂ t型结构蛋白的研究相
一致k„µ¨¯¯¤  ετ αλ. ot|{wl≈tv  o具有典型 ≤°∂ 粒子结构蛋白组成的特征 ∀
2 .2 ∆πΧΠς 单克隆抗体的制备和亚类的鉴定
经免疫的 …„…r¦小鼠脾脏细胞与 ≥°urs骨髓瘤细胞融合后 o经 ‹ „× 培养液选择培养 oz§后改
换成 ‹ × 培养液 otw§后杂交瘤细胞形成肉眼可见的群落 o杂交瘤孔率为 ys qy h o经间接 ∞Œ≥„ 法测
定 o阳性率为 vy h ∀抗体活性高的杂交瘤再用有限稀释法克隆 o复筛后获得 w株分泌 ⁄³≤°∂ 单抗的杂
交瘤细胞株 o命名为 u⁄x !u⁄ts !v⁄w和 y…v ∀
w株杂交瘤细胞植入致敏的 …„…r¦小鼠腹腔内 o两周后抽取腹水 ∀ ∞Œ≥„ 法测 u⁄x !u⁄ts !v⁄w
和 y…v w株腹水的效价分别是 tΒtsx !tΒtsx !tΒwsss和 tΒ{sss ∀
用间接 ∞Œ≥„ 方法测各单抗的亚类 o发现每种单抗只与酶标抗小鼠 ŒªŠt !ŒªŠu¤!ŒªŠu¥和 ŒªŠv
中的一种结合并有鲜明显色反应 ∀测定结果表明 u⁄x !u⁄ts和 v⁄w属 ŒªŠt o而 y…v属 ŒªŠu¥∀
2 .3 ∆πΧΠς 在 ΣΦΕ2ΗΑ28212 和 ΣΦΕ2ΗΑ2831 细胞系中增殖动态的检测
⁄³≤°∂ 感染 ≥ƒ∞2‹ „2{utu和 ≥ƒ∞2‹ „2{vt细胞
后 o细胞内病毒抗原的合成动态用 ∞Œ≥„ 方法检测 ∀
结果如图 u !v所示 ∀各种抗体的检测结果都显示基
本一致的病毒抗原消长动态 ∀在 ≥ƒ∞2‹ „2{utu细胞
中病毒抗原的增长比较快 o在 ws«左右达到高峰 o在
≥ƒ∞2‹ „2{vt细胞中 o高峰值出现在 ys«左右 ∀值得
注意的是 o测得的病毒抗原量在感染两种细胞后约
vs«都呈一低谷 o这可能是由于细胞对 ≤°∂ 感染的
病变反应所致 ∀文献k…¨ ¯¯²±¦¬® ≥ ot|{| ~°¤¼±¨ ≤≤ ετ
αλ. ot|{v ~苏德明 ot|{{ ~陈昌洁 ot||s ~刘润忠等 o
t||u ~沈中建等 ot||wl≈t ∗ y 曾提及 ≤°∂ 感染 t ∗ u§
时 o细胞贴壁能力下降 o并有其他病变现象 ∀由于实
验中只收集了贴壁细胞 o这一结果应反映感染初期病
毒对细胞的毒性 o并值得进一步研究 ∀高峰过后测得
病毒抗原减少与光镜观察到多角体形成在时间上正
相吻合 o这反映了病毒抗原被包埋入多角体中 ∀ Ο .
∆ .值在第一轮多角体形成后又有回升 o这说明细胞
可以不断地被重复感染 o≤°∂ 感染是非烈性的 ∀在细
胞培养中 o≤°∂ 可以形成持续感染 k …¨ ¯¯²±¦¬® ≥ o
t|{|l≈t  ∀用同样方法检测细胞培养上清液中的病毒
抗原 o所得结果均为阴性 o说明很少有病毒粒子或抗
原释放到胞外 o这与 „µ¨¯¯¤等k„µ¨¯¯¤ot|{wl≈tv 结果相
符 ∀
uy 林 业 科 学 vx卷
图 u ⁄³≤°∂ 抗原在 ≥ƒ∞2‹ „2{utu细胞中的合成
ƒ¬ªqu ∂¬µ¤¯ ¤±·¬ª¨ ± ¶¼¶±·«¨¶¬¶¬± ⁄³≤°∂2¬±©¨ √·¨§ ≥ƒ∞2
‹ „2{utu ¦¨¯¯¶
t qu⁄x ~u qu⁄ts ~v q多角体蛋白多克隆抗体 °²¯¼¦¯²±¤¯ ¤±·¬¥²§¼
¤ª¤¬±¶·³²¯¼«¨ §µ¬±~w qy…v ~x qv⁄w q
图 v ⁄³≤°∂ 抗原在 ≥ƒ∞2‹ „2{vt 细胞中的合成
ƒ¬ªqv ∂¬µ¤¯ ¤±·¬ª¨ ± ¶¼¶±·«¨¶¬¶¬± ⁄³≤°∂2¬±©¨ √·¨§ ≥ƒ∞2
‹ „2{vt ¦¨¯¯¶
t qy…v ~u qu⁄x ~v q多角体蛋白多克隆抗体 °²¯¼¦¯²±¤¯ ¤±·¬¥²§¼
¤±¤¬±¶·³²¯¼«¨ §µ¬±~w qv⁄w ~x qu⁄ts q
2 .4 ΣΦΕ2ΗΑ2831 细胞感染 ∆πΧΠς 后病毒特异蛋白合成动态的 Ωστερν印迹法检测
如图 w o参照图 t ovv®§病毒颗粒结构蛋白在感染后 t{«被检测到 ∀这种病毒颗粒结构蛋白质的
量随时间进程不断增加 o并一直保持到感染后第 |y«∀tts®§和 tus®§病毒粒子结构蛋白在第 uw«被
检测到 o它们的数量在第 w{«达到高峰 o随后有所下降 ∀感染后第 t{«分子量分别为 u{®§和 vs®§的
两种多角体蛋白主要组分开始大量合成 o随后其数量维持在一个较高水平上 ∀同图 v结果相比较 o
• ¶¨·¨µ±印迹法对病毒抗原合成动态的定量描述不如 ∞Œ≥„ 方法灵敏 ∀但 • ¶¨·¨µ±印迹检测结果表
明 ow种单抗所对应的决定簇分别在 vv®§otts®§和 tus®§v种病毒颗粒结构蛋白上 ∀
2 q5 病毒粒子抗原在松毛虫幼虫体内增殖动态的检测
在幼虫中肠 o多角体的形成在第 t ∗ u§增长最快 o第 v§到达高峰值 ∀多角体外游离的病毒粒子的
高峰在第 u§∀随后 o多角体内外的病毒抗原量都大幅下降k如图 xl ∀这显然是因为在感染后期 o大量
中肠上皮细胞破裂 o病毒随粪便排出体外之故 ∀
图 w ⁄³≤°∂ 感染 ≥ƒ∞2‹ „2{vt细胞后不同时间病毒特
异蛋白合成的 • ¶¨·¨µ±印迹法检测结果
ƒ¬ªq w • ¶¨·¨µ± ¥¯²··¬±ª ²© ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨·¬¦¤¯ ¼¯ ¶¨³¤µ¤·¨§
³²¯¼³¨ ³·¬§¨¶²© ⁄³≤°∂2¬±©¨¦·¨§≥ƒ∞2‹ „2{vt ¦¨¯¯¶
≤ }未感染细胞 ~下排数字显示感染后的小时数 ~标准分子量蛋
白条带的位置标于右侧k®§l ∀ ≤ }∏±¬±©¨ ¦·¨§¦¨¯¯¶q‘∏°¥¨µ¶¥¨ ²¯º
·«¨ ³µ²©¬¯¨ ¬±§¬¦¤·¨·¬°¨²©³²¶·2¬±©¨ ¦·¬²±¬± «²∏µ¶q≥·¤±§¤µ§³²¯¼³¨ ³2
·¬§¨¶¤µ¨ ¬±§¬¦¤·¨§¬± ®¬¯²§¤¯·²±¶q
图 x 病毒粒子抗原在松毛虫体内增殖动态的 ∞Œ≥„ 检
测结果
ƒ¬ªqx ⁄¼±¤°¬¦¶²© ⁄³≤°∂ °∏¯·¬³¯¬¦¤·¬²±¬±¬±©¨ ¦·¨§ ¤¯µ√¤¨
每一数据为 ts个样品的平均值 ~∞¤¦«√¤¯∏¨ ¬¶·«¨ ¤√ µ¨¤ª¨ ²©·¨±
t q包埋在多角体内病毒粒子的抗原 „∏·¬ª¨ ∏¶²© ³²¯¼«¨ §µ²±2§¬¶2
¶²¯√ §¨√¬µ∏¶³¨µ·¬¦¯ ¶¨~u q游离病毒粒子的抗原 „±·¬ª¨ ∏¶²©©µ¨¨
√¬µ∏¶³¤µ·¬¦¯ ¶¨q
vy t期 朱光旦等 }马尾松毛虫质型多角体病毒单克隆抗体的制备和应用
2 .6 林区采集的虫样体内 ∆πΧΠς 相对数量的 ΕΛΙΣΑ检测结果
用 ∞Œ≥„方法检测了几批来自云南省和广东省的 ⁄³≤°∂ 防治林区的虫样 o结果如表 t和表 u所
示 ∀
以上结果与实际情况吻合得很好 ∀ µ号样品高于 ´号样品 o原因在于 µ号样品的防治晚 t年 o而
且林地条件好 o灌木多 o有利于病毒存活 ∀ ·号样品采自 t||v年自然感病的林区 o平均检测值达 s q{ o
说明云南省林间 ≤°∂ 自然流行现象较多 o是控制松毛虫消长的主要因素之一 ∀
表 1 云南林区 5 组虫样体内 ∆πΧΠς 数量的 ΕΛΙΣΑ检测结果
Ταβ .1 ∆πΧΠς δετεχτιον ιν λαρϖαε χελλεχτεδ φροµ πινεφορεστ ιν Ψυνναν Προϖινχε
种 类
≥³¨ ¦¬¨¶²©
¬±¶¨¦·
样品号
‘²q
喷施病毒日期
⁄¤·¨ ²© ≤°∂
¤³³¯¬¦¤·¬²±
采集日期
⁄¤·¨ ²©
¦²¯¯¨ ¦·¬²±
虫 数
‘∏°¥¨µ²©
¤¯µ√¤¨
ᬦᬤ
平均检测值 ≠
„√ µ¨¤ª¨ Ο . ∆ .
文山松毛虫
∆ . πυνχτατυσ
ωενσηανενσισ
׶¤¬ ·¨¬∏
´ t||s年 v月 tx日 t||w年 u月 t{日 uw s qus
µ t||t年 v月 uw ∗ uy日 t||w年 u月 us日 vs s qxu
¶ t||u年 w月 us ∗ uy日 t||w年 v月 u日 vs s q|w
德昌松毛虫
∆ . πυνχτατυσ
τεηχηανγενσισ
׶¤¬ ·¨¬∏
· t||v年 w月自然感病 t||w年 u月 uy日 vs s q{u
∏ t||v年 w月 ty日 t||w年 u月 uy日 vs s qz{
≠空白对照的 Ο . ∆ .值调整为 s ∀ ׫¨ Ο . ∆ . √¤¯∏¨ ²© ≤Ž¬¶s q
表 2 广东林区 6 组虫样体内 ∆πΧΠς 数量的 ΕΛΙΣΑ检测结果
Ταβ . 2 ∆πΧΠς δετεχτιον ιν λαρϖαε χολλεχτεδ φροµ πινεφορεστ ιν Γυανγδονγ Προϖινχε
采集地点
°¯ ¤¦¨ ²©
¦²¯¯¨ ¦·¬²±
样品号
‘²q
喷施病毒时间
⁄¤·¨ ²© ≤°∂
¤³³¯¬¦¤·¬²±
采集时间
⁄¤·¨ ²©
¦²¯¯¨ ¦·¬²±
虫 数
‘∏°¥¨µ²©
¤¯µ√¤¨
ᬦᬤ
平均检测值 ≠
„√ µ¨¤ª¨
Ο . ∆ .
石岭林场王屋
≥«¬¯¬±ª©²µ¨¶·
©¤µ° ¤·• ¤±ªº∏
´ t|{{年 |月 t||w年 v月 uv日 tv s qxv
µ t|{{年 !t|{|年 t||w年 v月 uw日 | s qz|
¶ t|{z年 !t|{{年 t||w年 v月 u日 ts s qyx
· 毒喷施区外 t||w年 v月 uw日 ty s qv{
石岭林场
河背岭
≥«¬¯¬±ª©²µ¨¶·
©¤µ° ¤·‹ ¥¨¨¬¯¬±ª
∏ t|{|年 x月 t||w年 v月 uw日 y s quw
√ t||s年 w月 t||w年 v月 uv日 { s qyz
≠空白对照的 Ο . ∆ .值调整为 s ∀ ׫¨ Ο . ∆ . √¤¯∏¨ ²© ≤Ž¬¶s q
比较样品 ∏和样品 √ o可以看出 o对于同时采集的幼虫 o喷施病毒的日期越晚 o效果越明显 ∀另外
样品 ´ !µ !¶的结果都证实了松毛虫病毒病的流行 o这几个样品喷药和采样日期相隔 y年左右 o体现
了 ≤°∂ 防治在林间有良好的持效 ∀
v 讨论
运用传统的血清学技术对 ≤°∂ 进行研究已经取得了许多进展 o特别是在探讨 ≤°∂¶的血清学关系
方面k°¤¼±¨ ≤≤ ετ αλqot|{vl≈u  o也有利用多角体蛋白或病毒粒子的抗血清开展 ∞Œ≥„ 检测工作的
k°¤¼° ±¨·° ετ αλ. ot|{u ~高志和等 ot|{zl≈tw otx  o但是 o制备 ≤°∂ 单克隆抗体的工作还不多 ∀和多克隆
抗体相比 o单抗灵敏度更高 o专一性更强 o能够避免检测中的假阳性现象 ∀单抗的生产耗时短 o性质均
一 o不象多抗那样每次制备都需要一到 u个月的时间 o而且每次制得的多抗在特异性上都有差异 ∀借
助于单抗技术 o我们还可以确定 w 株单抗对应的抗原决定簇所处的病毒多肽 o并探讨各种 ≤°∂ 和
⁄³≤°∂ 各株系在抗原上的异同 ∀本文所建立的免疫学检测方法十分简便 o如果试剂齐备 o整个操作过
程不超过 ts«∀实验结果是定量表示的 o而且容易做到实验条件的规范化 o因此适用于对 ⁄³≤°∂ 防治
wy 林 业 科 学 vx卷
作用进行长期和较大规模的监测 o并得到科学的 !可比较的数据 ∀免疫学方法的另一优势在于它能在
感病初期尚未出现病征的虫体内发现病毒的存在 o这对于真实把握林区内病毒流行情况和趋势有很大
意义 ∀
这套方法也同样适用于对 ⁄³≤°∂ 致病进程和条件的基础性研究 ∀通过创造单一的 !人为控制的
温度 !光照等环境条件 o试验在不同条件下 ⁄³≤°∂ 的防治效果 o以便获得虫体内病毒数量随环境参数
变化的一整套定量关系 o为野外工作提供理论指导 ∀
需要注意的是 o∞Œ≥„反应结果直接显示的是单条虫体内病毒的数量 o而我们希望获得的信息是
病毒病的流行情况 ∀单条虫体内病毒数量与虫体大小 !感病早晚有关 o因此 o对检测数据进行分析时必
须慎重对待平均值 ∀只有当一组样品中的供试虫数很多时 o平均值才是可靠的 ∀我们认为 o在实际检
测中应同时检测一批采自条件相似的林地 o但尚无 ≤°∂ 流行的松毛虫样品k或室内未感病虫样l作为
参考 o这样所获得的数据将具有更好的应用效果 ∀
参 考 文 献
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v 苏德明 q质型多角体病毒 q见 }张立人主编 o中国昆虫病毒电子显微镜图谱 q第 t版 o北京 }科学出版社 ot|{{ ouy ∗ vt
w 陈昌洁 q松毛虫细胞质多角体病毒的应用 q见 }陈昌洁主编 o松毛虫综合管理 q第 t版 o北京 }中国林业出版社 ot||s ou{u ∗ vss
x 刘润忠等 q文山松毛虫质型多角体病毒形态结构及理化性质的研究 q中国病毒学 ot||u oz }y| ∗ z{
y 沈中建等 q马尾松毛虫质型多角体病毒在昆虫细胞系中的离体增殖研究 q病毒学报 ot||w otsktl }ww ∗ xs
z 徐左宇等 q棉铃虫质型多角体病毒的某些生物化学及生物物理特性研究 q病毒学报 ot|{y ou }uvx ∗ uwv
{ 巫爱珍等 q以双链核糖核酸为基因组的病毒的研究 ´ q家蚕细胞质多角体病毒的简易纯化及其性质 q生物化学与生物物理学报 o
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| 于善谦等 q黄瓜花叶病毒单克隆抗体的制备及其对株系特异性的研究 q中国科学k…辑l ot|{y otuyy ∗ tuzs
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tx 高志和等 q酶联免疫吸附法检测松毛虫 ≤°∂ 的研究 q森林病虫通讯 ot|{z okwl }z ∗ |
xy t期 朱光旦等 }马尾松毛虫质型多角体病毒单克隆抗体的制备和应用