全 文 ：园艺学报，2015，42 (10)：2075–2082.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0308；http：//www. ahs. ac. cn 2075
砧木南瓜硅转运蛋白基因CmLsi3 的克隆与表达
分析
王 慧 1，赵 升 1，魏 珉 1,2,*，王秀峰 1,2，史庆华 1,2，杨凤娟 1,2
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018；2 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：以用于黄瓜嫁接的砧木南瓜‘云南黑籽南瓜’（Cucurbita ficifolia，去蜡粉能力弱）和‘黄
诚根 2 号’（C. moschata，去蜡粉能力强）为试材，采用同源克隆与 RACE 相结合的方法克隆到硅转运
蛋白基因 cDNA 全长，命名为 CmLsi3（GenBank 登录号分别为 KM203110 和 KM359142）。两种砧木南瓜
CmLsi3 基因 cDNA 全长为 1 206 bp，开放阅读框为 795 bp，编码 264 个氨基酸，两者仅有 4 个位点的氨
基酸不同，但与黄瓜、玉米、大麦等作物硅转运蛋白氨基酸序列同源性均在 50%以上。CmLsi3 蛋白含有
2 个 NPA 模体、6 个跨膜结构域以及 1 个由 Gly（G）、Ser（S）、Gly（G）和 Arg（R）组成的 ar/R 选择
性过滤器，属于水通道蛋白 NIPⅢ亚家族。实时荧光定量分析表明，CmLsi3 基因在砧木南瓜根、茎、叶
中均有表达，且‘云南黑籽南瓜’各器官 CmLsi3 基因的表达水平高于‘黄诚根 2 号’。
关键词：南瓜；硅转运蛋白基因；克隆；表达分析
中图分类号：S 642.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）10-2075-08

Cloning and Expression Analysis of Silicon Transporter Gene CmLsi3 in
Roots of Pumpkin
WANG Hui1，ZHAO Sheng1，WEI Min1,2,*，WANG Xiu-feng1,2，SHI Qing-hua1,2，and YANG Feng-juan1,2
（1College of Horticultural Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；
2State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：Two pumpkin cultivars for cucumber grafting‘Yunnan Figleaf Gourd’（Cucurbita ficifolia）
and‘Huangchenggen 2’（C. moschata），which have weak and strong de-blooming abilities respectively，
were used in this study，and the full length cDNA of the silicon transporter gene were cloned by RT-PCR
and RACE，and named CmLsi3（GenBank accession numbers are KM203110 and KM359142）. The
full-length of cDNA was 1 206 bp，and the open reading frame（ORF）was 795 bp，encoding 264 amino
acids，and only four amino acids were different in‘Yunnan Figleaf Gourd’and‘Huangchenggen 2’，
However the amino acid sequences shared at least 50% identity with those in cucumber，maize and barley.
The transporter encoded by CmLsi3 contained typical two sparagine-proline-alanine（NPA）motifs，six
transmembrane domains and a distinct ar/R（aromatic/arginine）selectivity filter composed from Gly（G），
Ser（S），Gly（G）and Arg（R），belonging to nodulin 26-like intrinsic membrane protein Ⅲ（NIP Ⅲ）
subgroup of plant aquaporin. The expression of Cmlsi3 was investigated by using fluorescence quantitative

收稿日期：2015–07–23；修回日期：2015–10–08
基金项目：国家自然科学基金项目（31272211）；山东省现代农业产业技术体系建设专项（SDAIT-02-022-08）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：minwei@sdau.edu.cn）
Wang Hui，Zhao Sheng，Wei Min，Wang Xiu-feng，Shi Qing-hua，Yang Feng-juan.
Cloning and expression analysis of silicon transporter gene CmLsi3 in roots of pumpkin.
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RT-PCR and the result showed that the CmLsi3 gene was expressed in roots，stems and leaves of pumpkin
and the expression level in organs were higher in‘Yunnan Figleaf Gourd’than in‘Huangchenggen 2’.
Key words：pumpkin；silicon transporter gene；clone；expression analysis

在中国，黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia）一直是黄瓜嫁接的首选砧木，但由于利用它嫁接的黄瓜
果实表面往往带有一层蜡粉，严重降低了果实的商品品质（Lee & Oda，2003；李红丽 等，2006）。
因此，近年来人们越来越倾向于选择去蜡粉能力较强的白（黄）籽南瓜嫁接黄瓜。与此同时，关于
黄瓜果面蜡粉形成的机理成为研究热点（Sakata et al.，2008）。
前人的研究表明，黄瓜果面蜡粉的形成在一定条件下取决于对硅的吸收和分配特性（山本幸彦，
1989；Samuels et al.，1993）。无论黄瓜还是南瓜，对硅的吸收转运都是一个依赖于硅转运蛋白的主
动过程（Liang et al.，2005；Mitani et al.，2011a）。Ma 等（2006，2007）首次在水稻中克隆了硅输
入蛋白基因 Lsi1 和硅输出蛋白基因 Lsi2。此后，Yamaji 等（2008）又在水稻中分离到另一个硅转
运蛋白基因 Lsi6。大麦、玉米中的硅转运蛋白基因 Lsi1、Lsi2 和 Lsi6 也相继被发现（Chiba et al.，
2009；Mitani et al.，2009a，2009b；Yamaji et al.，2012）。在双子叶植物中，硅转运蛋白基因 CmLsi1
和 CmLsi2 首先在去蜡粉能力较弱的砧木南瓜‘Shintosa’（Cucurbita maxima × C. moschata）和去蜡
粉能力较强的砧木南瓜‘Super-unryu’（C. moschata）中被发现（Mitani et al.，2011a，2011b）。此
后，王东旭（2013）在黄瓜中克隆了硅转运蛋白基因 CsiT-1 和 CsiT-2，发现这两个基因序列与南瓜
中 Lsi1 和 Lsi2 基因序列不同，但与南瓜 CmLsi1 同源性都较高。由此看来，不同物种间硅转运蛋白
基因存在一定的差异，相同物种硅转运蛋白基因也不同。砧木南瓜中是否还有新的硅转运蛋白基因？
其功能与嫁接黄瓜果面蜡粉形成机理关系如何？值得探究。
本研究中以去蜡粉能力不同的两种砧木南瓜为试材，采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆硅转运蛋
白基因 CmLsi3，并研究 CmLsi3 基因的表达模式，以期探明砧木南瓜吸收转运硅的分子机制，为进
一步研究砧木影响黄瓜果面蜡粉形成机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料及处理
试验于 2013—2015 年在山东农业大学玻璃温室内进行。试验材料为‘云南黑籽南瓜’（Cucurbita
ficifolia）和‘黄诚根 2 号’（C. moschata），分别由云南农作物资源开发研究所和青岛市农业科学研
究院提供。
采用基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩 = 2∶1∶1）育苗，一片真叶期挑选生长一致的幼苗各 40 株，轻
轻洗根，转入装有 120 L 不断通气的山崎黄瓜专用营养液水培箱中，3 d 更换 1 次。待幼苗长至三叶
一心时取根、茎、叶用液氮固定，–80 ℃保存备用。
1.2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成
采用超纯 RNA 提取试剂盒（CW0581，北京康为世纪生物科技有限公司）提取各样品总 RNA。
经紫外分光光度计和 1%琼脂糖电泳检测 RNA 纯度和完整性后，参照 PrimeScriptTM RT reagent Kit
（RR047A，TaKaRa）说明书进行反转录。
王 慧，赵 升，魏 珉，王秀峰，史庆华，杨凤娟.
砧木南瓜硅转运蛋白基因 CmLsi3 的克隆与表达分析.
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1.3 CmLsi3 基因的克隆
1.3.1 RT-PCR扩增同源片段
根据水稻、大麦、玉米等硅转运蛋白氨基酸的保守序列设计简并引物 3J-F 和 3J-R（表 1），以
‘云南黑籽南瓜’根系 cDNA为模板，扩增同源片段。反应体系为 20 μL：其中TransStart® FastPfu DNA
Polymerase 0.4 μL，5 × TransStart® FastPfu Buffer 4 μL，2.5mmol · L-1 dNTPs 1.6 μL，反转录产物 1 μL，
上、下游引物各 0.4 μL，ddH2O 12.2 μL。PCR 扩增程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，
72 ℃ 15 s，40 个循环；72 ℃ 10 min。扩增后经 1%琼脂糖凝胶回收目的片段，连接到 pEASY-Blunt
载体（CB101-01，北京全式金生物技术有限公司），并转化到 Trans1-T1 感受态细胞（CD501-01，
北京全式金生物技术有限公司），在氨苄板上筛选阳性克隆后测序，测序由上海生工生物工程技术服
务有限公司完成。
1.3.2 RACE扩增
根据已经得到的中间片段，利用 Primer Premier 5.0 设计 3′-RACE 特异性扩增引物 Cm3′race-F
（表 1），并与通用引物 UPM（表 1）进行 3′cDNA末端扩增。设计 5′-RACE 特异性扩增引物 Cm5′race-R
（表 1），并与通用引物 UPM 进行 5′cDNA 末端扩增。操作步骤参照 SMARTer™ RACE cDNA
Amplification Kit（634923，Clontech）试剂盒说明书。
1.3.3 CmLsi3基因编码区全长的扩增
将上述获得的中间序列、3′-RACE 序列和 5′-RACE 序列进行拼接。根据拼接序列，设计扩增
CmLsi3 基因编码区全长序列的特异性引物 CmLsi3-F 和 CmLsi3-R（表 1）。分别以‘云南黑籽南瓜’
和‘黄诚根 2 号’根系 cDNA 为模板克隆 CmLsi3 基因编码区全长。
表 1 PCR 扩增所用引物序列
Table 1 Primes sequence used in PCR amplification
用途
Use
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
3J-F 5′-TTT GMY GAM CTY TWC CCG CCC GA-3′ 中间片段的克隆
Amplification of fragments 3J-R 5′-GCR AGR WCV MTA GGA CCA GC-3′
Cm3′race-F 5′-AGGTATAGCAGTAGGCTCCTCTGTATGC-3′
Cm5′race-R 5′-GGACGTGATGCATACAGAGGAGCCT-3′
RACE
UPM 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′
CmLsi3-F 5′-ATGGCGACTGCTAATTGGAGC-3′ 全长的扩增
Full-length amplification CmLsi3-R 5′-TCATTGTAGAGAAAGCTGATGTCCATG-3′
Cm3-F 5′-ATGGCGACTGCTAATTGGAGC-3′ 荧光定量 PCR 引物
Real-time RT-PCR of CmLsi3 Cm3-R 5′-GAGGGCAGAGTTGTTGAAATCGG-3′
荧光定量 PCR 内参引物 β-Actin-F 5′-GTGCCTGCTATGTATGTTGCC-3′
Real-time RT-PCR of Actin β-Actin-R 5′-GGTCCAAACGGAGAATGGCATG-3′

1.4 生物信息学分析
测序结果除去载体序列后，利用 ORF（Open Reading Frame，ORF）软件寻找开放阅读框；利
用 TMpred 服务器（http：//www. ch. embnet.org/ software/ TMPRED_form. html）进行跨膜区的预测；
应用 ProtParam 软件（http：//web. expasy. org/ protparam/）分析氨基酸基本理化特性；利用 ProtComp9.0
程序（http：//linux1. softberry. com/）对蛋白进行亚细胞定位预测；利用 SignalP4.1 服务器（http：//www.
cbs. dtu. dk/ services/ SignalP/）预测蛋白信号肽；用 DNAMAN 软件进行不同物种硅转运蛋白氨基酸
序列的比对，并用 MEGA6.0 构建系统进化树。

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1.5 CmLsi3 基因表达分析
砧木南瓜根、茎、叶总 RNA 的提取、纯化和反转录方法同上。反应体系为 25 μL：其中 2×
TransStart® TipGreen qPCR SuperMix 12.5 μL，反转录产物 2.0 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 9.5
μL。qRT-PCR 扩增程序为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。以 β-Actin 为内参，
Cm3-F 和 Cm3-R 为 CmLsi3 基因荧光定量 PCR 引物（表 1）。在 BIO-RAD iQ5 荧光定量 PCR 仪上
进行荧光定量 PCR 检测，3 次生物学重复。按照 2-∆∆CT 公式计算 CmLsi3 基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增与克隆
参照水稻、黄瓜等硅转运蛋白基因的保守序列设计简并引物，以‘云南黑籽南瓜’根系 cDNA
为模板用于 RT-PCR 反应，获得 1 条 526 bp 的扩增片段（图 1，A），经 BLAST 搜索发现其与已知
硅转运蛋白基因相似度较高，其中与黄瓜硅转运蛋白基因 CsiT-2 相似度高达 84%。
用引物 Cm3′race-F、Cm5′race-R 和 UPM，分别进行 5′-RACE 和 3′-RACE 反应，扩增得到的片
段分别为 699 bp（图 1，B）和 544 bp（图 1，C）。将中间片段序列、5′端序列和 3′端序列进行拼接
得到全长为 1 206 bp 的 cDNA 序列。其中，编码区（开放阅读框）全长为 795 bp。
根据拼接所得到的编码区全长序列设计引物，以‘云南黑籽南瓜’根系 cDNA 为模板，扩增得
到 1 个 795 bp 的片段（图 1，D），测序后得到的序列与上述拼接得到的编码区（开放阅读框）序列
一致，命名为 CmLsi3（GenBank 注册号为 KM203110）。以‘黄诚根 2 号’根系 cDNA 为模板，同
样扩增得到 795 bp 片段（GenBank 注册号为 KM359142）。


图 1 ‘云南黑籽南瓜’CmLsi3 基因同源片段（A）、5′RACE 片段（B）、3′RACE 片段（C）、编码区全长片段（D）和
‘黄诚根 2 号’CmLsi3 基因编码区全长（E）扩增结果
Fig. 1 PCR products of CmLsi3 homologous fragment（A），5′-RACE（B），3′-RACE（C），the full-length CDS of CmLsi3（D）
from‘Yunnan Figleaf Gourd’and the full-length CDS of CmLsi3（E）from‘Huangchenggen 2’
M：DNA marker 2000.
2.2 CmLsi3 基因编码蛋白的生物信息学分析
2.2.1 核酸及氨基酸序列分析
CmLsi3 基因 cDNA 序列全长 1 206 bp，开放阅读框 795 bp，编码 264 个氨基酸，分子式为
C1268H1972N326O360S10。其中‘云南黑籽南瓜’CmLsi3 蛋白质分子量为 27.86 kD，等电点为 7.05，半
衰期为 30 h，不稳定参数为 28.44，属于稳定蛋白（小于 40 为稳定蛋白）。该蛋白相对含量较多的
氨基酸是丙氨酸 Ala（13.3%，35 个）、丝氨酸 Ser（9.8%，26 个）、甘氨酸 Gly（8.7%，23 个），缬
氨酸 Val（8.7%，23 个）。‘黄诚根 2 号’CmLsi3 蛋白质分子量为 27.94 kD，等电点为 6.65，半衰期
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为 30 h，不稳定参数为 28.37，也属于稳定蛋白。该蛋白相对含量较多的氨基酸是丙氨酸 Ala（12.9%，
34 个）、丝氨酸 Ser（10.6%，28 个）、缬氨酸 Val（8.7%，23 个），甘氨酸 Gly（8.3%，22 个）。
利用 TMpred 预测到 CmLsi3 蛋白有 6 个跨膜结构域，属于跨膜蛋白。利用 SignalP 4.1Server 预
测 CmLsi3 蛋白没有明显的信号肽，为膜整合蛋白。通过 Protcomp9.0 软件对 CmLsi3 蛋白进行亚细
胞定位预测，该蛋白可能定位在细胞质膜。
2.2.2 CmLsi3同源氨基酸序列比对及系统进化树的构建
利用 DNAMAN 将 CmLsi3 编码的氨基酸序列与其他高等植物硅转运蛋白氨基酸序列进行比对。
结果（图 2）显示，各种植物硅转运蛋白氨基酸序列在一些位点都存在较高的保守性。


图 2 南瓜与其它物种硅转运蛋白氨基酸序列的比对
Hv：大麦；Zm：玉米；Os：水稻；Cm：南瓜；Cs：黄瓜。划线是预测的跨膜结构；方框是保守 NPA 模体（NPA1 和 NPA2）和
ar/R 选择性过滤残基（G，S，G，R）；–和 + 分别代表去蜡粉能力强和弱。
Fig. 2 Alignment of amino acid of silicon transporters from pumpkins and other plants
Hv：Hordeum vulgare；Zm：Zea mays；Os：Oryza sativa；Cm：Cucurbita moschata；Cs：Cucumis sativus. Predicted transmembrane domains
in CmLsi3 are underlined，and the conserved NPA motifs（NPA1 and NPA2）and the ar/R selectivity filter（G，S，G and R）are boxed.
“–”and“+”mean the strong and weak de-blooming ability.

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‘云南黑籽南瓜’CmLsi3 氨基酸序列与黄瓜 CsiT-2、南瓜 CmLsi1（B+）、南瓜 CmLsi1（B-）、
黄瓜 CsiT-1、大麦 HvLsi1、玉米 ZmLsi1 和玉米 ZmLsi6 氨基酸序列同源性分别为 78.03%、63.79%、
63.45%、63.19%、51.86%、50.83%和 50.68%。‘黄诚根 2 号’CmLsi3 氨基酸序列与黄瓜 CsiT-2、
南瓜 CmLsi1（B+）、南瓜 CmLsi1（B-）、黄瓜 CsiT-1、大麦 HvLsi1、玉米 ZmLsi6 和大麦 HvLsi6
氨基酸序列同源性分别为 77.27%、63.79%、63.45%、63.19%、52.20%、50.68%和 50.33%。对 CmLsi3
蛋白分析可知，CmLsi3 蛋白含有 2 个 NPA 模体和 6 个跨膜区域，并且含有由 Gly（G）、Ser（S）、
Gly（G）和 Arg（R）氨基酸残基组成的 ar/R 选择性过滤器。因此，CmLsi3 蛋白属于水通道蛋白
NIPⅢ亚家族。
将 CmLsi3 基因推导的氨基酸序列与其它高等植物硅转运蛋白氨基酸序列进行比对，并构建系
统进化树（图 3）。发现 CmLsi3 与黄瓜 CsiT-2（FJ595948）亲缘关系较近，与南瓜 CmLsi1（AB551949，
AB551950）、黄瓜 CsiT-1（FJ595947）亲缘关系次之，与水稻 OsLsi1（AB222272）、玉米 Zmlsi6
（NM001111550）等亲缘关系较远些。


图 3 不同植物硅转运蛋白的系统进化树分析
比例尺代表 0.05 个氨基酸差别；节点上数字表示 bootstrap 的校验结果。
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of silicon transporters from different plants
The 0.05 scale shows substitution distance and numbers at nodes indicate phylogeny test and options.








图 4 CmLsi3 基因在不同器官中的表达模式
以‘云南黑籽南瓜’根系 Cmlsi3 基因表达量为 1，作为对照。
Fig. 4 Expression pattern of CmLsi3 gene in different organs
The expression of Cmlsi3 gene in‘Yunnan Figleaf Gourd’
root was 1，as the control.
2.3 CmLsi3 基因表达特性
实时荧光定量 PCR 分析表明，CmLsi3 基
因在砧木南瓜根、茎、叶中均有表达（图 4）。
其中在叶中的表达量最高，其次是茎，在根中
的表达量最低。‘云南黑籽南瓜’叶中 CmLsi3
基因的表达量分别是根和茎中表达量的6.07倍
和 3.07 倍。‘黄诚根 2 号’叶中 CmLsi3 基因的
表达量分别是根和茎中表达量的 7.21倍和 3.73
倍。‘云南黑籽南瓜’各器官中 CmLsi3 基因的
表达量均高于‘黄诚根 2 号’各器官 CmLsi3
基因的表达量。
王 慧，赵 升，魏 珉，王秀峰，史庆华，杨凤娟.
砧木南瓜硅转运蛋白基因 CmLsi3 的克隆与表达分析.
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3 讨论
硅转运蛋白基因在高等植物吸收转运硅方面行使着重要功能。目前已从水稻等单子叶植物中发
现 Lsi1、Lsi2 和 Lsi6 等 3 个成员，它们在植物体内的功能各异，其中 Lsi1 主要负责将外部溶液中的
硅吸收到根系细胞内，Lsi2 主要负责将根系细胞内的硅转运到中柱细胞，而 Lsi6 主要负责木质部硅
的卸载和分配（Ma et al.，2006，2007；Yamaji et al.，2008）。Lsi1 和 Lsi6 属于水通道蛋白基因家族
且被划分为 NIPⅢ亚家族（Ma et al.，2006；Yamaji et al.，2008），Lsi2 为阴离子转运蛋白（Ma et al.，
2007）。
近期，Mitani 等（2011a，2011b）在双子叶南瓜‘Shintosa’（C. maxima × C. moschata）和
‘Super-unryu’（C. moschata）中克隆到两个硅转运蛋白基因 CmLsi1 和 CmLsi2，其功能与单子叶植
物 Lsi1 和 Lsi2 功能相同，且发现去蜡粉能力较强的‘Super-unryu’南瓜 CmLsi1 第 242 位氨基酸发
生了突变，影响了 CmLsi1 蛋白亚细胞的定位，导致硅吸收能力的丧失。本试验中在去蜡粉能力较
弱的砧木‘云南黑籽南瓜’和去蜡粉能力较强的砧木‘黄诚根 2 号’中克隆到 CmLsi3 基因，该基
因编码 264 个氨基酸，与黄瓜 CsiT-2、南瓜 CmLsi1 硅转运蛋白基因相似度达 78%和 63%。CmLsi3
蛋白含有 2 个 NPA 模体，6 个跨膜结构域以及 1 个由 G、S、G、R 残基构成的 ar/R 选择性过滤器，
因此，CmLsi3 蛋白属于水通道蛋白 NIPⅢ亚家族。系统进化树进一步分析表明，CmLsi3 蛋白与黄
瓜 CsiT-2 亲缘关系最近，推测其功能相似。比对‘云南黑籽南瓜’和‘黄诚根 2 号’CmLsi3 氨基
酸序列发现有 4 个氨基酸不同，这可能是造成两种砧木硅吸收能力不同的原因，而硅吸收能力的差
异最终导致嫁接黄瓜果面蜡粉发生情况不同。
硅转运蛋白基因的表达模式因植物种类或器官的不同而不同。在水稻、玉米、大麦中，Lsi1 和
Lsi2 基因主要在根系表达，地上部不表达（Ma et al.，2006，2007；Chiba et al.，2009；Mitani et al.，
2009a，2009b），Lsi6 基因则主要在地上部表达，根系中表达较少（Yamaji et al.，2008，2012；Mitani
et al.，2009b）；南瓜 CmLsi1 基因在根系和地上部均有表达，且去蜡粉能力较强的砧木根系和地上
部表达水平均高于去蜡粉能力较弱的砧木。南瓜 CmLsi2 基因在去蜡粉能力强和去蜡粉能力弱的砧
木茎中的表达水平相近，但在去蜡粉能力较弱的砧木根中表达水平高于去蜡粉能力较强的砧木南瓜
（Mitani et al.，2011a，2011b）。黄瓜植株中 CsiT-1 基因主要在根系中表达，而 CsiT-2 基因主要在
茎中表达（王东旭，2013）。本试验中利用荧光定量 PCR 检测发现，CmLsi3 基因在砧木南瓜根、茎、
叶等器官中均有不同程度的表达，且以叶中表达量最高，这与水稻等 Lsi6 基因的表达模式相似
（Yamaji et al.，2008），推测 CmLsi3 基因在南瓜地上部硅的转运过程中起重要作用。但是，CmLsi3
基因在嫁接黄瓜植株内的表达特性及与黄瓜果面蜡粉形成的关系，亟需开展更深入研究。

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