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Cloning,Sequence Alignment and Functional Analysis of AFS Gene Promoter in Apple and Pear Fruits

苹果和梨AFS基因启动子的克隆、序列比对及功能分析



全 文 :园艺学报,2015,42 (12):2353–2361.
Acta Horticulturae Sinica
doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0554;http://www. ahs. ac. cn 2353
苹果和梨AFS基因启动子的克隆、序列比对及功
能分析
邓 帅 1,*,成妮妮 2,*,丁瑞瑞 1,刘 宇 1,张元湖 1,**
(1 山东农业大学生命科学学院,作物生物学国家重点实验室,山东泰安 271018;2 临沂大学生命科学学院,山东临
沂 276000)
摘 要:苹果(Malus × domestica L.)和梨(Pyrus communis L.)果实在低温储存过程中虎皮病的发
生与果皮中受乙烯诱导的 α–法尼烯合酶基因(AFS)的表达及 α–法尼烯的积累密切相关。采用 TAIL-PCR
技术分别从‘富士’苹果和‘丰产’梨中克隆到了约 2 kb 的 α–法尼烯合酶基因(AFS)启动子序列,并
提交至 GenBank 中(登录号分别为 KM676083 和 KM676082)。序列比对发现两启动子同源性仅为 48.31%,
远低于其下游编码区 97%的相似度。顺式作用元件在线预测分析发现二者同时存在乙烯、脱落酸、茉莉
酸、水杨酸等激素响应元件,低温、厌氧、病原菌等胁迫响应元件,以及 3 个节律性表达元件和 2 个诱
导子响应元件。对‘丰产’梨中 AFS 基因表达模式的分析也证实了部分预测的诱导因素对其表达有调控
作用。将‘丰产’梨 AFS 基因启动子序列进行系列删除,与 GUS 报告基因构建融合表达载体转化烟草,
利用 GUS 染色方法分析了不同长度启动子的转录活性差异,发现缩短至 153 bp 的启动子片段仍具有较强
的转录活性,且长度在 276 bp 至 573 bp 的启动子片段其驱动下游基因转录的活性较其他片段更强。通过
后续对各作用元件尤其是乙烯响应元件的研究将有助于进一步从分子水平认识虎皮病的发生机制。
关键词:苹果;梨;AFS;启动子;顺式作用元件;虎皮病
中图分类号:S 661 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2015)12-2353-09

Cloning,Sequence Alignment and Functional Analysis of AFS Gene
Promoter in Apple and Pear Fruits
DENG Shuai1,*,CHENG Ni-ni2,*,DING Rui-rui1,LIU Yu1,and ZHANG Yuan-hu1,**
(1State Key Laboratory of Crop Biology,College of Life Sciences,Shandong Agricultural University,Tai’an,Shandong
271018,China;2College of Life Sciences,Linyi University,Linyi,Shandong 276000,China)
Abstract:Both apple(Malus × domestica L.)and pear(Pyrus communis L.)fruits are prone to suffer
superficial scald during storage at low temperature. Previous studies have proved that the occurrence of
superficial scald is closely related to the α-farnesene synthase gene(AFS)expression and accumulation of
α-farnesene in the fruit peel,but little is known about its promoter. By using TAIL-PCR we cloned
approximately 2 kb length promoter sequence of AFS gene from‘Fuji’apple and‘Fertility’pear

收稿日期:2015–08–19;修回日期:2015–12–16
基金项目:国家自然科学基金项目(31170255)
* 同等贡献作者
** 通信作者 Author for correspondence(E-mail:yhzhang9@163.com)
Deng Shuai,Cheng Ni-ni,Ding Rui-rui,Liu Yu,Zhang Yuan-hu.
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respectively and submitted them to GenBank(Accession number:KM676083 and KM676082). The
sequence alignment result showed that the homologous sequence of the two promoter is only 48.31%,is
far less than the 97% similarity of their downstream coding region. cis-acting elements predicting analysis
of the two promoters found that both promoters exist hormone response elements reponding to ethylene,
abscisic acid, jasmonic acid,salicylic acid and/or stress response elements that response to low
temperature,anaerobic environment and pathogen. Besides,three rhythmic expression elements and two
inducer response elements are also found in both promoters. The expression pattern analysis found that
some factors mentioned above have remarkable regulating effects on AFS gene transcription. Series
deletions fragments of the AFS promoter from‘Fertility’pear were inserted into the upstream sequence of
reporter gene in the expression vectors which were then used to transform the tobacco(NC89). Analysis of
the transcription activity of each fragment by GUS staining method indicated that the shortest 153 bp
promoter fragment still maintain its transcription activity and two shortened promoters with length
between 276 to 573 bp possess stronger transcription activity than other fragments. A more detailed
etiology of superficial scald is supposed to be discovered when these cis-acting elements,especially the
ethylene responsive element reported here shall have been thoroughly studied.
Key words:apple;pears;AFS;promoter;cis-acting elements;superficial scald

α–法尼烯是植物中广泛存在的一种挥发性倍半萜类物质,既是一种重要的植物香气成分,也
是一种重要的信号物质(Yan et al.,2003;Šobotník et al.,2008)。苹果和梨果皮中 α–法尼烯及其
氧化产物的积累还与其重大生理病害——虎皮病的发生紧密相关,其积累和氧化被认为是该病发生
的主要诱因(Huelin & Coggiola,1970;Rowan et al.,1995)。果皮中 α–法尼烯的合成是通过甲羟
戊酸(MVA)途径(Ju & Curry,2000;Rupasinghe et al.,2001),参与其代谢的酶有多种,其中
α–法尼烯合酶(AFS)位于该途径最末端,是调控其合成的关键酶,通过改变 AFS 的活性或功能
表达可以直接调控 α–法尼烯的产生。
Pechous 和 Whitaker(2004)首次从‘Law Rome’苹果中克隆得到 AFS 编码基因的 CDS 区全
序列,并进行了该基因的原核表达及活性研究,发现该酶不仅具有倍半萜合酶活性,还具有部分单
萜合酶活性。为确定其基因序列差异与虎皮病发生的关系,苑克俊等(2007)对苹果 α–法尼烯合
酶基因组结构和序列的多态性进行了分析,并认为 RxR 基序一个氨基酸的突变可能导致了品种间对
虎皮病抗性的差异,但 Beuning 等(2010)的研究结果不支持该设想。AFS 转录水平的差异往往关
系到品种对虎皮病的抗性,如‘Idared’和‘Law Rome’苹果在储藏的前 4 周里 AFS 的转录水平均
呈现相同的上升趋势,但抗性品种‘Idared’的转录水平仅仅是易感品种‘Law Rome’转录水平的
1/4(Pechous et al.,2005)。α–法尼烯合酶基因在品种间的转录水平差异很可能是由其启动子的差
异引起的,如启动子中乙烯等激素响应元件及低温等胁迫响应元件的差异,然而有关 AFS 基因启动
子方面的报道依然较少。苑克俊等(2010)最早获得 510 bp 的‘国光’苹果 AFS 基因启动子序列
(GenBank 登录号:FJ263961)并和已报道的‘皇家嘎拉’启动子(GenBank 登录号:AY786553)
进行比对,发现二者存在 6 个碱基的变异,且 1 个变异发生在热胁迫响应元件上,但由于所得序列
过短,其中并未发现乙烯响应元件等重要的顺式作用元件。
苹果和梨虎皮病的发生均与果皮中 α–法尼烯的积累及氧化有关,但其防治措施并不完全相同,
如胺类抗氧化物质二苯胺只对苹果虎皮病具有较好的防治效果,却对梨的效果较差。种间启动子的
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差异可能为解释防控措施的有效性差异提供参考,因此从 AFS 启动子的角度入手,通过对种间顺式
作用元件的分析比对中找到二者共同和特异的元件,对深入认识虎皮病发生的机理具有重要意义。
本试验中分别对‘富士’苹果和‘丰产’梨中 AFS 基因的启动子区域进行扩增,并对其作用元件进
行了比对分析,结合对西洋梨基因表达模式的分析及启动子系列删除片段的活性检测,意图从启动
子角度找到种间虎皮病发生的共性和特性,为从分子生物学水平研究虎皮病发生的机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
试验进行时间为 2013 年 9 月至 2015 年 3 月。苹果(Malus × domestica Borkh.)品种‘富士’(Fuji)
采自山东省泰安市郊区果园,西洋梨(Pyrus communis L.)品种‘丰产’(Fertility)组培苗来自山东
省果树科学研究所。烟草 NC89、植物表达载体 pCAMBIA1301/pCAMBIA1391、农杆菌菌株 LBA4404
由本实验室保存;大肠杆菌 DH5α、连接载体 pMD18-T、pfu DNA 聚合酶、DNAMarker、反转录试
剂盒购自宝生物(大连)有限公司;各种限制性内切酶、T4-DNA 连接酶购自 Fermentas 公司。
采用 CTAB 法提取果皮基因组 DNA,具体步骤参考苑克俊等(2007)的方法。
1.2 引物设计、TAIL-PCR扩增及验证
根据 GenBank 中已登录的西洋梨(登录
号:AY566286)和‘青香蕉’苹果(登录号:
AY563622)的 AFS 基因编码区序列设计 3 个
下游基因特异性引物 SP1、SP2、SP3,依据相
关文献(赵昶灵 等,2005)合成了 6 个上游简
并引物 AD1 ~ AD6(表 1)。
表 1 TAIL-PCR 中所用简并引物及基因特异性引物序列
Table 1 Sequences of degenerate primers and gene specific
primers used in TAIL-PCR
引物名称
Primer name
引物序列(5′–3′)
Sequence
AD1 NGTCGASWGANAWGAA
AD2 WGTGNAGWANCANAGA
AD3 AGWGNAGWANCAWAGG
AD4 GTNCGASWCANAWGTT
AD5 TCSTNCGNACNTWGGA
AD6 CAWCGNCNGANASGAA
SP1 CCATGCTGCCTGAGGATCTTGA
SP2 CTTGTGCCGAGATTGTCGCTTT
SP3 CAAGTAAGAGGCTTCAGGTTCGG
SPB1 GGATTGAAAGGGACTTCTCGTAT
SPB2 GAATGGCTTTTTGTTGGTCACT
SPB3 CTCTGGAAATGGTCCCGTT
以提取到的基因组 DNA 分别作为热不对
称交错 PCR( thermal asymmetric interlaced
PCR,TAIL-PCR)的模板进行 3 轮嵌套 PCR,
具体步骤参考 Liu 和 Whittier(1995)的方法稍
加改进。对第 2 轮和第 3 轮 PCR 的产物各取 5
μL 进行电泳,并对第 3 轮 PCR 产物进行纯化
回收和测序,测序引物为第 3 轮 PCR 的基因特
异性引物 SP3。依据测序所得序列设计上游特异引物与下游引物 SP3 配对进行 PCR 扩增,并测序以
验证所得序列的正确性。对测序正确的序列通过在线工具 Banklt 提交到 GenBank 中。
1.3 启动子比对与顺式作用元件分析
采用 DNAMAN 软件对所得启动子序列进行同源性比对。利用 plantCARE(http://bioinformatics.
psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)在线预测软件结合 PLACE(www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)
软件对所得‘丰产’梨和‘富士’苹果的启动子序列进行顺式作用元件预测和分析。对预测到的作
用元件进行统计并归纳出二者同时含有的作用元件,将共有元件根据其在‘丰产’梨启动子上的位
置标注在其启动子示意图中。

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1.4 诱导表达模式分析
取离体‘丰产’梨叶片置于培养皿中,分别进行乙烯(ETH,500 mg · L-1)、脱落酸(ABA,100
μmol · L-1)、茉莉酸甲酯(MeJA,1 mmol · L-1)、水杨酸(SA,500 μmol · L-1)、低温(4 ℃)等诱
导处理,除低温处理外其他处理均在 25 ℃光照培养箱中进行,并以蒸馏水处理作为对照,在不同时
间段取样,取样后立即进行液氮速冻并于–80 ℃冰箱保存。提取样品总 RNA,反转录为 cDNA 后
作为模板进行实时荧光定量 PCR 分析(引物 YPFSF:5-GCTTCCATCACACCGCAGAG-3,YPFSR:
5-CCCAGATTTGCCCACCACTTG-3)。
在表达量日变化的检测中,选则晴天于 7:00—19:00 间每 2 h 从同一棵健康‘丰产’梨植株
上取 5 ~ 7 片叶进行检测,每次所取叶片均位于植株同一部位的不同侧枝上,并确保叶片的大小、
颜色及长势相近,叶片的保存及表达量测定的方法同上。
1.5 ‘丰产’梨AFS基因启动子表达载体的构建及转化
表 2 系列删除 PcAFS 启动子克隆所用的引物序列
Table 2 Sequences of the primers used in
cloning of PcAFS promoters
引物名称
Primer
name
引物序列(5′–3′)
Sequence
片段大小/bp
Sequence
size
pAFSF1 CTGAGTAAGCTTGACCGGAAAAATGT 1 253
pAFSF2 TCATAGAAGCTTGAAGTCCCTTTCAATCCT 903
pAFSF3 ATAGAGAAGCTTTGCTTCCTCGGATTC 646
pAFSF4 GACGCGAAGCTTCAATATATCGTCCTTAT 349
pAFSF5 ATCATGAAGCTTACATCTCATCCACGCAT 226
pAFSR ATATGGCTGCAGTGAATACCTAATTTGGTG

选择在‘丰产’梨和‘富士’苹果中同时存在的顺式作用元件,根据这些元件在‘丰产’梨 AFS
基因启动子上的分布位置,设计系列引物(表 2)对启动子进行分段扩增,上游引物分别为 pAFSF1
(-1180)、pAFSF2(-830)、pAFSF3(-573)、pAFSF4(-276)、pAFSF5(-153),下游引物为 pAFSR
(+73)(起始密码子位于转录起始位点的下游
+74 bp 处)。将 5 个正向引物与 pAFSR 分别配
对扩增 ATG 上游的 5 个片段,通过引物在各片
段上游引入 HindⅢ位点,下游引入 PstⅠ位点,
各片段大小如表 2 所示。将上述片段分别与不
含启动子序列的 pCAMBIA1391 载体进行连
接、转化和筛选鉴定,并分别以不含启动子的
载体 pCAMBIA1391 和 35S 驱动的载体
pCAMBIA1301 作为阴性和阳性对照。
1.6 烟草转化与GUS染色分析
农杆菌感受态细胞的制备,表达载体导入农杆菌 LBA4404。农杆菌叶盘侵染及组织化学染色法
GUS 活性检测参考 Jefferson 等(1987)的方法。染色结果用体视显微镜拍摄。
2 结果与分析
2.1 AFS基因启动子序列的获得
以‘富士’苹果基因组 DNA 为模板,用 TAIL-PCR 对 α–法尼烯合酶基因(AFS)的上游序列
进行扩增。以 AD2 和 AD4 为简并引物时在第 3 轮扩增时得到明亮条带(图 1,A,泳道 4、8),其
中以 AD2 为简并引物时第 2 轮扩增的产物长度(图 1,A,泳道 3)长于第 3 轮扩增(图 1,A,泳
道 4),其最有可能是本次扩增的目的条带,回收产物连接到克隆载体中并测序,发现其 3端与下游
已知编码区序列重叠,证明该片段位于 AFS 基因的上游,去除编码区后得到 900 bp 的 AFS 启动子
区序列。进一步将该序列在 NCBI 中进行比对分析,发现其与已登录的‘皇家嘎拉’(登录号:
AY786553)和‘国光’苹果(登录号:FJ263961)的 α–法尼烯合酶基因启动子序列高度一致,但
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比上述两个序列更长。由于苹果基因组已完成测序,进一步将该序列在苹果基因组中进行查找并发
现 1 条匹配的未锚定序列,从该匹配序列中得到 AFS 起始密码子上游约 2 027 bp 的启动子序列信息。
设计特异引物进行扩增(图 1,B),经测序验证该序列即为‘富士’AFS 启动子,通过 Banklt 工具
在线提交到 GenBank 中(登录号:KM676083)。






图 1 ‘富士’苹果 AFS 基因启动子 PCR 扩增电泳图
A:TAIL-PCR 扩增启动子的电泳图;B:启动子区全长序列的扩增结果。
M:DNA marker;1、3、5、7、9、11:TAIL-PCR 第 2 轮扩增条带;2、4、6、8、10、12:TAIL-PCR 第 3 轮扩增条带。
Fig. 1 Agrose gel analysis of PCR products for‘Fuji’apple AFS gene promoter
A:Agrose gel analysis of TAIL-PCR products;B:Agrose gel analysis of the full length promoter sequence.
M:DNA marker;1,3,5,7,9,11:The second round TAIL-PCR products;
2,4,6,8,10,12:The third round TAIL-PCR products.

采用同样的方法对‘丰产’梨 AFS 上游序列进行扩增(图 2,A),以 AD2、AD4 和 AD5 为简
并引物时,第 3 轮扩增中均得到了明亮的单一条带,其中以 AD2 的扩增条带(图 2,A,泳道 4)
最为理想,因此选择该条带进行测序。发现测序所得 1 254 bp 序列的 3端与已知序列高度匹配,证
明该序列为 AFS 基因的启动子。为获得更长的启动子区长度,在已获得的 1 254 bp 区间内再设计 3
个特异引物 SPB1 ~ SPB3 进一步 TAIL-PCR 扩增上游未知区域(图 2,B),当以 AD1、AD2 和 AD3
为简并引物时均扩增出符合要求条带,其中以 AD3 最为理想。选择其第 3 轮扩增所得序列(图 2,
B,泳道 6)测序,又得到 800 bp 左右序列,且与前述 1 254 bp 启动子区上游序列存在重叠区,将
两段序列去除重叠区后进行组合,得到总长 2 007 bp 的启动子序列,并将其序列信息提交 GenBank
(登录号:KM676082)。






图 2 ‘丰产’梨 AFS 基因启动子的 TAIL-PCR 扩增电泳图
A:首段启动子的扩增结果;B:上游第 2 段启动子的扩增结果。
M:DNA marker;1、3、5、7、9、11:TAIL-PCR 第 2 轮条带;2、4、6、8、10、12:TAIL-PCR 第 3 轮条带。
Fig. 2 Agrose gel analysis of the‘Fertility’pear promoters using TAIL-PCR technology
A:Cloning results of the downstream-part promoter;B:Cloning results of the upstream-part promoter. M:DNA marker;
1,3,5,7,9,11:Productst of the second round TAIL-PCR;
2,4,6,8,10,12:Products of the third round TAIL-PCR.
2.2 ‘富士’苹果和‘丰产’梨启动子的比对和顺式作用元件分析
进一步对‘富士’苹果和‘丰产’梨的 AFS 启动子进行比对时发现两者仅在起始密码子上游

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350 bp 左右的区域内高度同源,而同源区上游序列差异则较为显著(图 3),二者的总体相似度仅为
48.31%,远低于其下游编码区 97%的相似度。值得注意的是在转录起始位点上游 70 bp 内未出现碱
基差异,这可能与该区域对转录起始的核心作用有关。对各启动子的作用元件进行预测和比对分析
后发现,两者除了都含有典型的启动子序列 TATA-box 和 CAAT-box 外,还同时含有乙烯、脱落酸、
茉莉酸和水杨酸等激素响应元件和低温、厌氧、病原菌等胁迫响应元件以及 3 个节律性表达元件和
两个诱导子响应元件,但其分布位置在二者间并不完全相同,图 4 列出了这些元件在‘丰产’梨中
的分布情况。
















图 3 ‘富士’苹果和‘丰产’梨 AFS 基因部分启动子序列比对图
Fig. 3 Sequence alignment between‘Fuji’apple and‘Fertility’pear AFS gene promoters











图 4 ‘丰产’梨 AFS 基因启动子与‘富士’启动子中共有的作用元件
Fig. 4 The shared cis-acting elements between‘Fuji’apple and‘Fertility’pear AFS gene promoters

对‘丰产’梨叶片 AFS 基因诱导表达模式分析发现:其受乙烯、脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸
等激素的强烈诱导,这种诱导效应在水杨酸处理 24 h 时尤为明显,相反低温处理在一定程度上抑制
了该基因在叶片中的表达(图 5,A ~ E)。此外,定量结果还发现该基因表达日变化呈现出一定的
节律性(图 5,F),其在中午时表达量最高,到傍晚时表达量明显下降。上述因素的调控作用表明
启动子中确实存在对其发生响应的顺式作用元件。
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图 5 西洋梨叶片 AFS 基因的诱导表达模式
Fig. 5 Gene expression analysis of PcAFS leaves of pear
2.3 5端系列删除表达载体的构建、烟草转化及GUS染色分析
通过构建‘丰产’梨 AFS 基因 5端系列删除表达载体进一步研究该启动子中各作用元件的分布
与功能。根据启动子序列顺式作用元件在线分析结果,结合顺式作用元件所在位置,分别设计 5 条
正向引物 pAFSF1 至 pAFSF5 结合下游引物 pAFSR 用于扩增 5端系列删除的 5 条启动子片段(表 2)。
将上述启动子片段分别与植物表达载体 pCAMBIA1391 进行连接获得重组质粒,并分别命名为 D1 ~
D5,同时以不含启动子但含有 GUS 报告基因的空 pCAMBIA1391 作为阴性对照,以含有 35S 启动
子驱动 GUS 基因的 pCAMBIA1301 载体作阳性对照。将上述表达载体利用农杆菌介导法分别转化烟
草,获得由不同长度‘丰产’梨 AFS 基因启动子片段驱动 GUS 表达的转基因烟草植株。
将经 PCR 鉴定为阳性的 T0 代转基因植株叶片进行 GUS 组织化学染色,选择染色效果好的植株
进行移栽并收获种子。播种后对 T1 代幼苗进行 GUS 染色分析。如图 6 所示,转入不同长度启动子
片段的 T1 代幼苗均可被染色,说明所有启动子片段都具备转录活性,尤其在 D3 和 D4 中其染色区
域几乎遍及整株幼苗。从图 6 中可看出启动子的表达主要集中在子叶和根尖生长活跃区,即使转化
了最短启动子片段的烟草(图 6,D5)依旧具有 GUS 表达活性。有意思的是,在多次 GUS 染色中
均发现染色最深的并非是转化最长启动子片段的烟草(图 6,D1、D2),删除一定长度的启动子片
段后的转基因烟草(图 6,D3、D4)反而染色更深,表明其驱动转录的活性更强,由此推断离转录
起始位点上游 573 ~ 830 bp 之间序列的存在可能并不利于其转录活性的增强。

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图 6 转化系列删除启动子载体 D1 ~ D5 的转基因烟草幼苗 GUS 染色结果
Fig. 6 The GUS staining of the tobacco seedlings transformed with D1–D5 promoter constructs
3 讨论
真核启动子不像原核启动子那样有明显共同一致的序列,不同真核启动子之间大小、序列往往
不同。本试验对苹果和梨的 α–法尼烯合酶基因启动子序列进行克隆和序列比对分析,发现其同源
序列仅存在于起始密码子上游 350 bp 左右,该同源区包含有转录必需的 TATA box 等核心作用元件,
故该基因的核心启动子部分也位于该区域内。
梨和苹果同属蔷薇科,在低温贮藏中均易发生虎皮病,其 AFS 基因序列同源性高达 97%以上,
理论上其启动子也应该在较长的范围内具有较高的相似度,然而种间比对发现其启动子同源性远远
低于下游基因编码区,说明二者的启动子序列在进化中的保守性远低于其下游基因。对种间启动子
顺式作用元件进行比对后发现不少元件在二者间都存在,包括一些激素响应元件、胁迫响应元件、
节律性表达元件和诱导子响应元件等,依据预测的结果对‘丰产’梨进行的诱导表达模式分析也证
明了相应元件的存在。结合 α–法尼烯在自然界中的作用,推测这些元件在进化过程中可能是高度
保守的,且其功能可能涉及到果树的信号交流、胁迫抗性和虎皮病的发生(Scutareanu et al.,1996;
Yan et al.,2003;Vicker et al.,2009)。此外,对该基因表达量日变化的检测中还发现其呈现周期性
的规律,与已报道的萜类物质表达的规律类似(Aharoni et al.,2003),这种节律性可能受到上述节
律性表达元件的调控。内源乙烯对果皮中 AFS 基因的转录起到决定性的作用,且当前国际上对虎皮
病的防治主要是通过抑制内源乙烯的合成,因此进一步明确 AFS 启动子中的乙烯响应元件及其调控
AFS 转录的具体机制对从分子水平认识虎皮病的发生具有重要意义(Rupasinghe et al.,2000;Lurie
& Watkin,2012)。对 α–法尼烯合酶基因启动子进行深入研究的重要性不只局限在虎皮病的防治方
面,对新型生物燃料的开发利用也具有重大价值。近年来,α–法尼烯作为一种极具潜力的生物燃
料已经在酵母平台上进行了商业化生产(Peralta-Yahya & Keasling,2010),但在植物平台上却至今
尚未得到利用。本试验中发现 AFS 基因受水杨酸的强烈诱导(约为处理前的 1 000 倍),因此找到并
开发利用其水杨酸响应元件对高效精密调控代谢途径中各关键基因的表达和利用植物平台生产 α–
法尼烯等次生代谢物也具有一定的借鉴意义。
本研究中对‘丰产’梨启动子进行 5端系列缺失试验,发现转录起始位点上游 153 bp 的启动子
片段依然具有较强的转录活性,进一步将其核心启动子区缩小至该区域内。且据染色深浅推断起始
位点上游 573 ~ 830 bp 的序列中可能存在负调控元件。待获得纯合体植株后对上述启动子系列删除
邓 帅,成妮妮,丁瑞瑞,刘 宇,张元湖.
苹果和梨 AFS 基因启动子的克隆、序列比对及功能分析.
园艺学报,2015,42 (12):2353–2361. 2361

烟草分别进行各种激素处理和酶活性的测定可进一步明确各作用元件在启动子上的定位。从而为后
续研究 AFS 对各作用元件响应机制,尤其是对乙烯的响应机理及其与虎皮病的关系奠定基础。
References
Aharoni A,Giri A P,Deuerlein S,Griepink F,de Kogel W J,Verstappen F W,Bouwmeester H J. 2003. Terpenoid metabolism in wild-type and
transgenic Arabidopsis plants. The Plant Cell,15 (12):2866–2884.
Beuning L,Green S,Yauk Y K. 2010. The genomic sequence of afs-1-an alpha-farnesene synthase from the apple cultivar‘Royal Gala’. Frontiers
of Agriculture in China,4 (1):74–78.
Huelin F E,Coggiola I M. 1970. Superficial scald,a functional disorder of stored apples. Ⅵ. Evaporation of α-farnesene from the fruit. J Sci Food
Agric,21 (2):82–86.
Jefferson R A,Kavanagh T A,Bevan M W. 1987. GUS fusions:Beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.
EMBO J,6 (13):3901–3907.
Ju Z G,Curry E A. 2000. Lovastatin inhibits α-farnesene biosynthesis and scald development in‘Delicious’and‘Granny Smith’apples and‘d’Anjou’
pears. J Am Soc Hortic Sci,125 (5):626–629.
Liu Y G,Whittier R F. 1995. Thermal asymmetric interlaced PCR:Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and
YAC clones for chromosome walking. Genomics,25 (3):674–681.
Lurie S,Watkins C B. 2012. Superficial scald,its etiology and control. Postharvest Biology and Technology,65 (3):44–60.
Pechous S W,Whitaker B D. 2004. Cloning and functional expression of an(E,E)-α-farnesene synthase cDNA from peel tissue of apple fruit. Planta,
219 (1):84–94.
Pechous S W,Watkins C B,Whitaker B D. 2005. Expression of α-farnesene synthase gene AFS1 in relation to levels α-farnesene and conjugated
trienols inpeel tissue of scald-susceptible‘Law Rome’and scald-resistant‘Idared’apple fruit. Postharvest Biol Techno,35 (2):125–132.
Peralta-Yahya P P,Keasling J D. 2010. Advanced biofuel production in microbes. Biotechnology Journal,5 (2):147–162.
Rowan D D,Allen J M,Fielder S,Spicer J A,Brimble M A. 1995. Identification of conjugated triene oxidation products of α-farnesene in apple skin.
J Agric Food Chem,43 (8):2040–2045.
Rupasinghe H P V,Almquist K C,Paliyath G,Murr D P. 2001. Cloning of hmg1 and hmg2 cDNAs encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme
A reductase and their expression and activity in relation to α-farnesene synthesis in apple. Plant Physiol Biochem,39 (11):933–947.
Rupasinghe H P V,Murr D P,Paliyath G,Skog L. 2000. Inhibitory effect of 1-MCP on ripening and superficial scald development in‘Mcintosh’
and‘Delicious’apples. Journal of Horticultural Science & Biotechnology,75 (3):271–276.
Scutareanu P,Drukker B,Bruin J,Posthumus M A,Sabelis M W. 1996. Leaf volatiles and polyphenols in pear trees infested by Psylla pyricola.
Evidence of simultaneously induced responses. Chemoecology,7 (1):34–38.
Šobotník J,Hanus R,Kalinová B,Piskorski R,Cvačka J,Bourguignon T,Roisin Y. 2008.(E,E)-α-farnesene,an alarm pheromone of the termite
prorhinotermes canalifrons. Journal of Chemical Ecology,34 (4):478–486.
Vickers C E,Gershenzon J,Lerdau M T,Loreto F. 2009. A unified mechanism of action for volatile isoprenoids in plant abiotic stress. Nature
Chemical Biology,5 (5):283–291.
Yan F,Bengtsson M,Makranczy G,Lofqvist J. 2003. Roles of alpha-farnesene in the behaviors of codling moth females. Zeitschrift fur
Naturforschung C,58 (1/2):113–118.
Yuan Ke-jun,Liu Qing-zhong,Li Bo,Zhang Li-si. 2007. Genomic organization and sequence polymorphism of E,E-alpha farnesene synthase gene
in apples(Malus domestica Borkh). Acta Horticulturae Sinica,34 (4):1003–1006. (in Chinese)
苑克俊,刘庆忠,李 勃,张力思. 2007. 苹果 α–法尼烯合酶基因组结构和序列的多态性分析. 园艺学报,34 (4):1003–1006.
Yuan Ke-jun,Liu Qing-zhong,Zhang Li-si,Ai Cheng-xiang,Wei Hai-rong,Yi Kai. 2010. Promoter sequence of alpha-farnesene synthase gene in
apples and its homolog gene. Genomics and Applied Biology,29 (5):904–910. (in Chinese)
苑克俊,刘庆忠,张力思,艾呈祥,魏海蓉,伊 凯. 2010. 苹果 α–法尼烯合酶基因的启动子序列及同源基因. 基因组学与应用生物
学,29 (5):904–910.
Zhao Chang-ling,Guo Wei-ming,Yang Qing,Chen Jun-yu. 2005. Cloning of full-length F3H of Nanjinghongxu(Prunus mume)by gDNA-based
TAIL-PCR. Acta Bot Boreal-Occident Sin,25 (12):2378–2385. (in Chinese)
赵昶灵,郭维明,杨 清,陈俊愉. 2005. 梅花南京红须 F3H 全长基于 gDNA 的 TAIL-PCR 法克隆. 西北植物学报,25 (12):2378–2385.