全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（1）：95–100 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–06–03；修回日期：2010–08–11
基金项目：农业部‘948’项目（2008-Z42）；国家自然科学基金项目（30871707）；‘十一五’国家科技支撑计划项目（2009BADB8B02）
* 共同第一作者； ** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：huangsanwen@caas.net.cn）
南瓜矮生基因 Bu 的比较定位
王深浩 1,*，李海真 2,*，张忠华 1，贺 俊 1，贾长才 2，张 帆 2，黄三文 1,**
（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物遗传改良重点实验室，中荷联合园艺作物基因组技术实验室，
北京 100081；2 北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097）
摘 要：以中国南瓜矮生突变体为供体亲本，以印度蔓生南瓜为轮回亲本，构建了 BC6F2分离群体。
利用黄瓜基因组序列，将南瓜矮生基因 Bu 比较定位至黄瓜 5 号染色体，并开发了一个新的 PCR 标记
IF3629，该标记与矮生基因 Bu 连锁遗传距离为 1.0 cM。该标记不仅可以用于分子标记辅助选择育种，而
且为 Bu 基因的克隆奠定了基础。
关键词：南瓜；矮生基因；比较基因组学；分子标记
中图分类号：S 642.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）01-0095-06

Comparative Mapping of the Dwarf Gene Bu from Tropical Pumpkin
（Cucurbita moschata Duchesne）
WANG Shen-hao1,*，LI Hai-zhen2,*，ZHANG Zhong-hua1，HE Jun1，JIA Chang-cai2，ZHANG Fan2，
and HUANG San-wen1,**
（1Key Laboratory of Horticultural Crops Genetic Improvement of Ministry of Agriculture，Sino-Dutch Joint Lab of
Horticultural Genomics Technology，Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing
100081，China；2Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，
China）
Abstract：A segregating BC6F2 population was developed using a dwarf mutant of Cucurbita
moschata Duch. as donor and the vine C. maxima Duch.‘Mengri’as recurrent parent. Using the
segregating population，the gene Bu was comparatively mapped on chromosome 5 of cucumber. An
intron-flanking marker IF3629 was found to be tightly linked to the Bu gene，with a genetic distance of 1.0
cM. The marker IF3629 will not only be useful in markers-assisted selection for dwarf plant，but also
provide a starting point toward positional isolation of the dwarf Bu gene in squash.
Key words：squash；dwarf gene；comparative genomics；molecular marker

矮化株型是重要的农艺性状（Dyson，1996；Conway，1997）。近年来各国学者在多种作物矮
生资源中发现并鉴定了大量的矮生基因，成功地克隆了诸如小麦矮秆基因 Rht、水稻半矮秆基因 sd-1
等（Peng et a1.，1999；Sasaki et a1.，2002）。目前南瓜属植物矮生突变体的研究主要集中于西葫芦
和笋瓜，对中国南瓜矮生突变体的研究报道较少。1982 年在山西省境内首次发现了中国南瓜矮生突
变体，经研究证明其矮生与蔓生是一对相对性状，矮生性状由单显性基因 Bu 控制（周祥麟和李海

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真，1991）。李云龙等（2007）获得与该矮生基因 Bu 连锁的 SCAR 标记，其遗传距离为 2.29 cM。
Cao 等（2005）和 Wu 等（2008）认为中国南瓜矮生突变体 cga 是与赤霉素相关的矮化突变体，通
过细胞学观察结果表明 cga 的产生可能是由于细胞伸长受阻所致。Wu 和 Cao（2009）利用
cDNA-AFLP 结合 RACE 技术，克隆得到了一个与南瓜蔓伸长相关的基因 CmV1。中国南瓜矮生基
因 Bu 的图位克隆对其后续的矮化机理和功能等方面的研究具有重要的意义。
黄瓜基因组框架图（Huang et al.，2009）为葫芦科作物某些重要基因的克隆和功能研究提供了
有利的资源平台。本研究中利用比较基因组学，将与南瓜矮生基因 Bu 连锁的 SCAR3-398 标记比较
定位至黄瓜染色体，并利用黄瓜基因组序列开发了与矮生基因 Bu 连锁遗传距离为 1.0 cM 的分子标
记 IF3629，为矮生基因 Bu 的图位克隆奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
南瓜群体材料由北京市农林科学院蔬菜研究中心南瓜育种课题组提供，于2007年10—11月种植
在北京市农林科学院蔬菜研究中心日光温室。群体材料为近等基因系，即以中国南瓜（Cucurbita
moschata Duch.）矮生突变体‘矮10’为供体亲本，以印度蔓生南瓜（C. maxima Duch.）‘蒙日’为
轮回亲本，经6代回交和2代自交选育出的矮生南瓜近等基因纯合株系S2，印度蔓生南瓜‘蒙日’与
该近等基因纯合株系S2杂交获得的BC6F2分离群体共99个单株。
1.2 方法
1.2.1 总DNA提取 取南瓜各单株嫩叶，用CTAB（Murry & Thompson，1980）法，结合高通量的
Retsch细胞破碎仪（Retsch Inc.，Haan，Germany）和96孔COSTAR深孔板（Corning Inc.，New York）
进行DNA快速提取。提取的DNA加水溶解，于–20 ℃保存。
1.2.2 SCAR3-398标记的 PCR反应条件 SCAR3-398 标记（李云龙 等，2007）的 20 µL PCR 反应
体系为：10 × buffer 2.0 µL，dNTP（10 mmol · L-1）0.4 µL，每条引物（10 pmol · µL-1）0.5 µL，Taq DNA
聚合酶（2.5 U · µL-1）0.3 µL，DNA（10 ng · µL-1）2 µL，双蒸 H2O 14.3 µL。扩增程序（李云龙 等，
2007）为 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，70 ℃延伸 2 min，循环 35 次，最
后 72 ℃延伸 10 min，扩增反应在 9700 PCR 仪（Applied Biosystem 公司）上进行。扩增反应在 1%
的琼脂糖凝胶中检测。
跨内含子标记（intron-flanking marker）20 µL PCR 反应体系同 SCAR3-398 标记的 PCR 反应。
扩增程序为 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 20 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，共循环 35 次，最
后 72 ℃延伸 5 min，扩增反应在 9700 PCR 仪（Applied Biosystem 公司）上进行。跨内含子标记的
群体扩增反应在 1%的琼脂糖凝胶中检测。
1.2.3 SCAR3-398 标记特异片段的序列获得及分析 用 SCAR3-398 标记扩增矮生南瓜近等基因纯
合株系 S2，用凝胶回收试剂盒（Takara）回收 SCAR3-398 标记的目的片段，经过与 T 载体的连接、
转化及质粒的 PCR 鉴定后,送金唯智生物科技有限公司进行测序。将获得的 SCAR3-398 标记的特异
片段序列，在黄瓜基因组中进行比对，以确定该标记在黄瓜基因组中的位置。
1.2.4 跨内含子 （intron-flanking）PCR 引物的设计与筛选 在黄瓜基因组中定位的 SCAR3-398
标记附近 1 Mbp 范围内，设计 4 对跨内含子（intron-flanking）PCR 引物，即在两个相邻的外显子上
设计引物，扩增这两个外显子所包含的内含子，PCR 扩增片段大小约在 150 ~ 350 bp 范围内。跨内
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含子引物应用 primer 5.0 软件根据黄瓜基因组序列信息设计，并由上海生工合成。
设计的 4 对跨内含子 PCR 引物扩增矮生南瓜近等基因纯合株系 S2 与印度蔓生南瓜‘蒙日’，
以筛选有多态性的引物。引物筛选时的 PCR 产物在垂直电泳槽（北京市六一仪器厂）上用 8%聚丙
烯酰胺凝胶进行检测，160 V 恒电压下电泳 2 ~ 2.5 h，电泳后参照乐晓萍等（2001）的方法银染。
1.2.5 数据统计与连锁分析 根据BC6F2分离群体单株的蔓生、矮生田间调查记录，并按JoinMap 3.0
软件的规定进行命名：BC6F2矮生单株记作a，蔓生单株记作b，所得标记在BC6F2各单株电泳谱带上
的有、无分别记作a和b。最终计算出所得跨内含子标记与矮生基因Bu之间的遗传距离。
2 结果与分析
2.1 矮生性状的遗传分析
在苗期后期对矮生南瓜及其野生型植株的表型进行鉴定，野生型植株性状如普通南瓜植株，幼
苗后期可以明显观察到其节间（图1，A）；而矮生南瓜植株的节间极短，叶柄簇生于茎基部，从而
全株呈丛生状（图1，B）。本试验中所用BC6F2分离群体共99株，田间调查统计结果显示，矮生植株
76株，蔓生植株23株，经χ2验证（χ2 = 0.16，P > 0.5），符合3︰1的分离比例，说明该矮生性状由显
性单基因控制，与以往报道一致（李云龙 等，2007；Wu et al.，2007），可利用该BC6F2分离群体
对控制目标性状的Bu基因进行遗传定位。
图 1 苗期中的印度蔓生南瓜（A）与印度矮生南瓜（B）
Fig. 1 Vine plants（A）and bush plants（B）in C. maxima Duch. during the seedling period
2.2 SCAR3-398 标记序列的比较定位
经回收、纯化、测序，获得SCAR3-398标记的特异片段序列，长度为370 bp。将该标记序列在
黄瓜基因组中进行比对，大约有100 bp的片段与黄瓜基因组中相应序列具有同源性，相似性约为83%
（图2），且位于黄瓜5号染色体的端粒区域。南瓜与黄瓜虽同为葫芦科，但经过分析，SCAR3-398
标记的特异片段序列含有一段内含子，而内含子保守性低，外显子保守性较高，所以SCAR3-398标
记的特异片段序列中只有100 bp的外显子部分在黄瓜基因组中有相应的同源序列。
SCAR3-398标记与基因Bu的连锁遗传距离为2.29 cM，标记与目标基因连锁较为紧密。考虑到南
瓜与黄瓜同属葫芦科，具有同源性，SCAR3-398标记与矮生基因Bu之间的序列在南瓜基因组与黄瓜
基因组上很可能具有共线性。因而在黄瓜基因组中定位的SCAR3-398标记附近设计引物，采用近等
基因系分析法，有可能寻找到与南瓜矮生基因Bu更为紧密连锁的标记。
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图 2 SCAR3-398 标记的南瓜特异片段序列在黄瓜基因组中的比对
Fig. 2 The sequence of SCAR3-398 specific fragment of squash was blasted in the genome of cucumber
2.3 亲本间多态性标记的筛选
近等基因系是由亲本材料间经多次回交或自交而建立的，其基因组背景近乎相同。因此，能在
近等基因系间揭示多态性的分子标记，就极有可能与控制该性状的目标基因相连锁。
在黄瓜基因组中定位的SCAR3-398标记区域附近1 Mbp范围内，共设计了4对跨内含子PCR引
物，即在2个相邻的外显子上设计引物，扩增这两个外显子所包含的内含子（以引物IF3629设计为例，
见图3）。引物在矮生南瓜近等基因纯合株系S2与印度蔓生南瓜‘蒙日’扩增后，筛选到1对有多态
性的PCR引物（IF3629），即引物IF3629在矮生南瓜近等基因纯合株系S2可扩增出稳定可重复的特异
性片段（约300 bp），而在印度蔓生南瓜‘蒙日’中未出现该条带。将此引物在BC6F2群体的99个单
株中进行扩增，同样具有多态性。经重复验证发现，引物IF3629扩增出的特异条带在75个矮生单株
中出现，1个矮生单株中未出现，而在所有的蔓生单株中均未出现（图4、表1）。
图 3 IF3629引物设计所依据的黄瓜基因组序列
划线箭头部分为引物所在的位置，虚线部分为内含子序列，虚线部分两端为外显子序列。
Fig. 3 The sequence of cucumber genome which the primers of IF3629 are designed on
The arrowlines show the sequence of the primers of IF3629，the broken lines show the sequence of intron，
and the sequence of both sides of the broken lines is exon.

表 1 IF3629 在 BC6F2 群体带型统计表
Table 1 The electrophoresis cingulum of BC6F2 population with IF3629
IF3629 扩增片段 The segment of IF3629 株型
Phenotype
株数
Number of plants 存在 Presence 不存在 Absence
矮生 Bush
蔓生 Vine
76
23
75
0
1
23

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图 4 亲本和 BC6F2 单株的 IF3629 分析
1 ~ 10：矮生单株；3：重组单株；11 ~ 13：蔓生单株；14：父本，即纯合株系 S2；15：母本，即印度蔓生南瓜‘蒙日’。
Fig. 4 IF3629 analysis of the parents and BC6F2 individuals
1–10：The bush；3：The recombinant，S2 and Mengri are parental lines；11–13：The vine；14：Bush pure line S2；15：The vine C. maxima Duch.
2.4 所得 IF3629 标记与矮生基因 Bu 的连锁关系
根据IF3629在BC6F2群体各单株的表现，以及BC6F2代单株的矮生、蔓生性状田间的调查，采用
Joinmap 3.0软件对所得IF3629标记和中国南瓜矮生基因Bu进行连锁分析，其连锁遗传距离为1.0 cM。
3 讨论
相对于模式植物拟南芥和水稻的研究（Hedden，2003），目前葫芦科作物的遗传改良工作大多
还停留在常规育种水平。葫芦科作物矮生基因的研究尚处在起步阶段，仅对部分矮生性状进行了表
型鉴定和遗传分析，而对矮生基因的分子标记、定位以及矮化机理分子水平的研究还较少。黄瓜基
因组测序实施的完成，在很大程度上可以促进葫芦科作物矮生基因等重要农艺性状基因的研究。
3.1 通过比较基因组学快速开发与南瓜矮生基因 Bu 连锁的分子标记
本研究依托黄瓜基因组序列信息，利用比较基因组学，在较短时间内获得与南瓜矮生基因Bu紧
密连锁（相距1.0 cM）的标记IF3629，归结原因：第一，黄瓜与南瓜同属葫芦科作物，两者具有同
源性，SCAR3-398标记与矮生基因Bu之间的序列在南瓜基因组与黄瓜基因组上很可能具有共线性，
利用黄瓜基因组信息有助于进行南瓜的矮生基因Bu定位、克隆等研究。第二，设计的跨内含子PCR
引物，能结合到保守的外显子区域，扩增包含多态性较高的内含子区域，设计的4对跨内含子引物中，
获得了一个与南瓜矮生基因Bu紧密连锁（相距1.0 cM）的标记IF3629。第三，本试验中所使用的群
体材料为近等基因系，其差异仅局限于目标基因及邻近极小区域，而其基因组背景近乎完全相同。
凡是在矮生南瓜纯合株系S2与印度蔓生南瓜‘蒙日’这对近等基因系间有多态性的引物，就极有可
能与矮生基因Bu紧密连锁。通过亲本间的引物筛选，消除假阳性，大大地提高了工作效率。南瓜矮
生基因Bu紧密连锁标记IF3629的开发，为矮生基因Bu的定位克隆奠定了基础，同时也在一定程度上
说明了利用黄瓜基因组信息来比较研究南瓜等其他葫芦科作物重要农艺性状基因的可行性。
虽然在幼苗后期可以对南瓜的蔓性进行鉴定，但从播种到南瓜蔓性可明显鉴定也需要约30 d，
且南瓜的蔓性鉴定多受外界环境因素的影响而不准确；IF3629标记与南瓜矮生性状的田间鉴定吻合
度较高，利用该标记进行南瓜的蔓性鉴定，在子叶期即可进行（播种后约3 ~ 5 d），大大缩短了鉴
定周期，并提高了准确率，在南瓜矮生基因分子标记辅助育种中具有重要的应用价值。
3.2 连锁标记 IF3629 和南瓜矮生基因 Bu 间的物理距离可能较大
本试验中获得的与矮生基因Bu连锁的标记IF3629，在BC6F2分离群体中连锁遗传距离虽表现为
1.0 cM，但物理距离可能较大，其原因是本试验所用的近等基因系的供体为中国矮生南瓜，受体为
印度蔓生南瓜，多次回交选育出的矮生南瓜近等基因纯合株系S2中的插入片段（矮生基因及矮生基
因两侧的较小区域片段）来源于中国南瓜，印度蔓生南瓜‘蒙日’中与株系S2中的插入片段相对应
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的同源片段来源于印度南瓜，中国南瓜与印度南瓜虽属南瓜属，但分别属于不同的南瓜种，纯合株
系S2与印度蔓生南瓜‘蒙日’杂交产生F2代时插入片段区域发生重组的概率较小，因而标记IF3629
在该BC6F2分离群体表现出的重组率较小，计算出来的连锁遗传距离较小。
各种模式生物的基因组测序的完成，加速了与模式生物相关物种的基因组结构和功能的研究。
通过比较基因组学，利用同科异种间染色体的共线性，可加快同科异种间基因的克隆，如以拟南芥、
番茄和水稻为种间图位克隆中介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物基因（Devos & Gale，1997；
Bennetzen et al.，1998）。随着黄瓜等园艺作物的基因组测序的完成，比较基因组学应用于葫芦科等
园艺作物重要农艺性状基因的定位克隆、功能等方面的研究也必将陆续展开，本研究就是应用黄瓜
基因组序列研究其它瓜类重要农艺性状的一个范例。

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