全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（10）：2043–2054 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–06–30；修回日期：2014–07–18
基金项目：国家自然科学基金项目（31000908）；国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2012CB113900）；重庆市自然科学基金项
目（2011BA1002）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2012B020）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：swausongm@163.com，swutql@163.com）
芥菜开花相关基因 AGL24 的表达及与 SOC1、
SVP 和 FLC 蛋白的互作
江 为，杨修勤*，谷慧英，鲜登宇，赵夏云，王志敏，宋 明**，汤青林**
（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）
摘 要：为阐明芥菜（Brassica juncea Coss.）开花激活因子 AGL24 的表达特性及其在开花途径中与
调节因子 SOC1、SVP 和 FLC 蛋白的互作机制，从‘青叶芥’中克隆了 680 bp 的 AGL24 基因，它编码
221 个氨基酸。序列分析表明：芥菜 AGL24 含有 M、I、K 和 C 域，分别有 59、11、102 和 47 个氨基酸，
与油菜 AGL24 亲缘关系较近。荧光定量 PCR 分析发现：在低温春化途径和长日照光周期途径中，AGL24
在叶片和茎尖中均有表达，营养生长期表达量较低，而生殖生长期表达量迅速增加；AGL24 在光周期途
径中的表达峰值要早于低温春化途径。酵母双杂交试验表明：全长 AGL24 与开花信号整合子 SOC1 蛋白
能够互作，激活酵母报告基因 AUR1-C、HIS3、ADE2 和 MEL1，在 QDO/X-α-Gal/AbA 平板培养基上长出
蓝斑。另外，分别去掉 M 域后的截短体 AGL24★与 SOC1★也能相互作用。β–半乳糖苷酶活性检测发现：
截短体杂交组合 AGL24★ × SOC1★的互作强度显著高于全长杂交组合 AGL24 × SOC1。然而全长 AGL24
或截短体 AGL24★ 均不能与光周期途径核心抑制子 SVP 互作，也不与低温春化途径核心抑制因子 FLC 相
互作用，说明 AGL24 并不是 SVP 或 FLC 的直接靶蛋白。
关键词：芥菜；开花调节；AGL24；酵母双杂交
中图分类号：S 637.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2043-12

Expression Analysis of Flowering Activator AGL24 and Its Protein
Interactions with Regulation Factors SOC1，SVP and FLC in Brassica
juncea
JIANG Wei，YANG Xiu-qin*，GU Hui-ying，XIAN Deng-yu，ZHAO Xia-yun，WANG Zhi-min，SONG
Ming**，and TANG Qing-lin**
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions，Ministry of Education；Key Laboratory of Olericulture，Chongqing 400715，China）
Abstract： AGL24（AGAMOUS-LIKE 24）was a key regulator to activate flowering in Brassica juncea.
In order to clarify the expression characteristics of AGL24 gene and its protein interaction mechanism with
another three regulators（SOC1，SVP and FLC）in flowering pathways，we cloned AGL24 gene of 680 bp
in‘Qingyejie’mustard germplasm of Brassica juncea，which encoded 221 amino acids. Sequence analysis

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showed that AGL24 protein in Brassica juncea has four domains，M，I，K and C，respectively containing
59，11，102 and 47 amino acids. And it has the closest relationship with AGL24 in Brassica napus.
Expression analysis of qRT-PCR revealed that AGL24 gene can express in leaf as well as shoot apex during
the flowering pathways of vernalization and long-day photoperiod. AGL24 has the low level expression at
the vegetative phase but rapidly rising expression at reproductive phase. The peak of AGL24 gene
expression in long-day photoperiod pathway is more sooner than that of vernalization pathway. Moreover，
yeast two-hybrid assays showed that AGL24 can interact with the flowering signal integrator SOC1. And
the fused strains were incubated on QDO/X-α-Gal/AbA plate and blue colonies were found，suggesting that
the yeast fusion reporter genes AUR1-C，HIS3，ADE2，and MEL1 were activated. We also subcloned two
truncated forms AGL24★ and SOC1★ after respectively removing MADS domain of AGL24 and SOC1，and
found that AGL24★ also can interact with SOC1★ in yeast. β-galactosidase activity assays indicated that the
interaction strength of AGL24★ and SOC1★ was much stronger than that of AGL24 and SOC1. However，
neither AGL24 nor AGL24★ can interact with the core repressor SVP in the photoperiod pathway，and it
was the same with the core repressor FLC in the vernalization pathway. The results suggested that AGL24
was not the direct protein target of SVP or FLC.
Key words：Brassica juncea；flowering regulation；AGL24；yeast two-hybrid system

MADS-box 转录因子在植物开花及其基因调控网络中起着关键作用（Simpson & Dean，2002），
例如 AGL24（AGAMOUS-LIKE 24）和 SOC1（SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1）
均为开花促进因子（Liu et al.，2008）；而 SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）和 FLC（FLOWERING
LOCUS C）则为开花抑制因子（Alexandre & Hennig，2008；Li et al.，2008）。序列比对发现：AGL24
与开花负调控因子 SVP 高度相似，两者仅 C 端差异较大，但在调控开花时间上却呈现相反功能
（Hartmann et al.，2000；Yu et al.，2002；Michaels et al.，2003）。在拟南芥中过量表达 SVP 可引起
植株晚花；而 AGL24 过量表达则提早开花，这种特性和开花整合子 SOC1 非常相似（Michaels et al.，
2003）。Ramamoorthy 等（2013）在大花草科（Rafflesiaceae）的霸王花中发现了与 AGL24 高度同源
的基因 RcMADS1，它与 AGL24 的作用非常相似，而与 SVP 相反。最新研究发现，在水稻和拟南芥
中 AGL24 与 SVP 可以调控花序结构，两者可以调控水稻穗的分枝（Liu et al.，2013）。另外，拟南
芥 AGL24 和 SVP 还可以正调控 LMI1 的表达，并负调控 AP1 和 LFY 的表达，进而调控花分生组织
特性（Grandi et al.，2012）。
在拟南芥中 AGL24 是 SOC1 的一个正调控因子，在含有 FRI 株系或者自主途径突变体中 SOC1
的表达量通常很低，这是由于 FLC 蛋白结合到 SOC1 基因启动子上的 CArG-box 并形成多聚体，抑
制了 SOC1 表达；但是 AGL24 表达量的提高会引起这些背景系和早花表型植株中 SOC1 的上调，说
明 AGL24 基因的表达可能并不受 FLC 蛋白调控，而 SOC1 表达量的提高也可以引起 AGL24 的表达
上调，说明拟南芥 AGL24、SOC1 可以彼此正调控（Liu et al.，2008）。AGL24 与 SOC1、SVP、FLC
均编码 MADS-box 的 MIKC 型蛋白，尽管这些基因之间表达水平的促控关系已在拟南芥中有所报道，
但在十字花科蔬菜作物芥菜中仍未见研究，尤其是芥菜 AGL24 蛋白与 SOC1、SVP 及 FLC 蛋白之间
的互作机制更不清楚。既然 SOC1 蛋白能够整合开花信号，那么芥菜 AGL24 蛋白在行使开花激活这
一功能时是否会受到 SOC1 蛋白调控，此外光周期途径和低温春化途径的核心调节蛋白 SVP 和 FLC
又是否会作用于 AGL24 蛋白，均不清楚。
本试验中利用 qRT-PCR 分析了芥菜 AGL24 在低温春化和光周期途径中的表达规律；并构建
AGL24 的酵母诱饵质粒，分别与开花整合子 SOC1 以及开花抑制因子 SVP、FLC 酵母双杂交，分析
10 期 江 为等：芥菜开花相关基因 AGL24 的表达及与 SOC1、SVP 和 FLC 蛋白的互作 2045

这些蛋白之间的作用机制，为进一步揭示 AGL24 在开花途径蛋白网络中的作用关系及其花期分子调
控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2013 年 6 月至 12 月在重庆市蔬菜学重点实验室完成。芥菜纯合种质材料‘青叶芥’为
本实验室提供，并在 RXZ 型智能人工气候箱中播种和种植，光强为 243 μmol · m-2 · s-1。选取 4 片真
叶期幼苗，分别经过低温春化（7 ℃/12 h 光照与 4 ℃/12 h 黑暗交替）和长日照光周期（20 ℃/16 h
光照与 18 ℃/8 h 黑暗交替）处理培养 30 d，然后在回温条件或正常光周期（20 ℃/12 h 光照与 18 ℃/12
h 黑暗交替）生长直至开花。前期研究得知幼苗在上述处理后回温生长 7 ~ 15 d 均可启动开花。故将
低温春化或光周期处理 0 和 30 d 以及回温 5、10 和 15 d 作为取材时期，剪取茎尖和内层幼叶，
冻存于–80 ℃用于 RNA 提取。
1.2 芥菜 AGL24 基因及其截短体克隆
参考拟南芥和油菜 AGL24（NCBI 登录号分别为 AF005158 和 JQ906709）设计芥菜 AGL24 基因
的上、下游引物 AGL-L 和 AGL-R（表 1）。同时以 TaKaRa RNAiso Reagent 试剂盒提取芥菜茎尖总
RNA，反转录成 cDNA 第 1 条链，采用 TransStart FastPfu DNA Polymerase 进行扩增。PCR 扩增程
序为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min。
PCR 产物经 1%琼脂糖电泳后，OMEGA Gel Extraction 试剂盒回收目的条带，与 pEASY-Blunt
Simple Cloning Vector 22 ℃连接 15 min，转化宿主菌 JM109，经菌液 PCR 和酶切鉴定后挑选正确的
克隆测序。
NCBI 在线 Blast 比较芥菜 AGL24 基因同源性，DNAstar 软件分析编码蛋白，Clustal x1 和
MEGA5.0 软件构建分子进化树。在线（http：//pfam. sanger. ac. uk/）分析芥菜 AGL24 蛋白的 MIKC
结构域后，设计只含有 IKC 域截短体（去除 M 域）的上游引物 AGL-L1（表 1），并以 AGL-L1/AGL-R
为引物组合亚克隆截短体 AGL24★。

表 1 扩增 Actin、Tublin、AGL24 及其片段的引物
Table 1 Primers used for amplification of Actin，Tublin，AGL24 and its fragments
引物名称
Primer name
序列
Primer sequence（5′–3′）
引物大小/bp
Primer size
基因
Gene
基因大小/bp
Gene size
AGL-L CGCCATATGATGGCGAGAGAGAAGATAAGGATAA 34
AGL-R CGCGGATCCTCTCTCTCTCAGATTCATTCCCAAG 34
AGL24 680
AGL-L1 CGCCATATGACTGGAAAGCTCTTCGAGTTCTCTA 34
AGL-R CGCGGATCCTCTCTCTCTCAGATTCATTCCCAAG 34
AGL24★ 503
Actin-L GCTGACCGTATGAGCAAAGA 20
Actin-R GTTGGAAAGTGCTGAGGGAT 20
Actin 133
TUB-L TATCAACTACCAGCCACC 18
TUB-R GAACACCTCAGCTACACTC 19
Tublin 102
AGL-L2 TTTGCGATGCTGATGTTG 18 AGL24-q 141
AGL-R2 GTGATACGGAGAAGGTGG 18
注：下划线为 NdeⅠ或 BamHⅠ酶切位点；★表示去掉了 M 域的截短体。
Note：Restriction enzymes of NdeⅠor BamHⅠused for cloning are underlined；★ Stands for the truncated forms without M domain.

2046 园 艺 学 报 41 卷
1.3 荧光定量 PCR 表达分析
RNA 提取方法同上，使用 PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa 公司）合成第一链 cDNA。根
据芥菜 AGL24 基因序列设计荧光引物 AGL-L2 和 AGL-R2（表 1），目的片段（AGL24-q）长度 141 bp，
通过绘制标准曲线和溶解曲线确定引物扩增效率和特异性。以稀释 20 倍的 cDNA（约 50 ng · μL-1）
为模板，Actin 和 Tublin 为内参基因（分别为 133 bp 和 102 bp），采用 Livak Method（2ΔΔCt）在 C1000
Thermal Cycler（Bio-Rad）实时定量 PCR 仪上进行，试验重复 3 次。使用 SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试
剂盒（TaKaRa 公司）配制反应体系，扩增条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，
35 个循环。
1.4 酵母重组表达载体构建
将全长AGL24以及截短体AGL24★的质粒经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切后，分别连接到载体pGADT7，
构建酵母诱饵质粒 pGADT7-AGL24、pGADT7-AGL24★，并以通用引物 T7 和 3′AD 进行 PCR 检测，
NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定，然后送阳性质粒双向测序。芥菜开花整合子 SOC1 基因全长以及截短体
SOC1★（去掉 M 域）猎物质粒（pGBKT7-SOC1 与 pGBKT7-SOC1★），芥菜开花核心抑制因子 SVP、
FLC 全长及其截短体的猎物质粒（pGBKT7-SVP、pGBKT7-FLC、pGBKT7-SVP★和 pGBKT7-FLC★）
均由本实验室保存和提供。
1.5 酵母质粒转化、自激活与毒性检测
参考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手册，从 YPDA 固体培养基上挑选直径
为 2 ~ 3 mm 的酵母单菌落 Y187 和 Y2HGold，分别制备酵母感受态细胞。采用醋酸锂转化法，将重
组质粒 pGADT7-AGL24 和 pGADT7-AGL24★分别转入 Y187 感受态细胞；将 pGBKT7-SOC1、
pGBKT7-SOC1★、pGBKT7-SVP 和 pGBKT7-FLC 分别转入 Y2HGold 感受态细胞。
将转化到酵母 Y187 的含有重组质粒 pGADT7-AGL24、pGADT7-AGL24★的菌液分别涂在
SD/-Leu、SD/-Leu/X-α-Gal、SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Leu/X-α-Gal/AbA 固体平板上；转化到酵母 Y2HGold
的含有重组质粒 pGBKT7-SOC1、pGBKT7SOC1★、pGBKT7-SVP、pGBKT7-FLC、pGBKT7-SVP★
和 pGBKT7-FLC★的菌液分别涂在 SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Trp/X-α-Gal/AbA
固体平板上。同时以空载体转化子 Y187（pGADT7）和 Y2HGold（pGBKT7）为对照，30 ℃培
养 3 ~ 5 d，观察酵母重组质粒在酵母体内有无自激活和毒性现象（汤青林 等，2012）。
1.6 酵母双杂交及其蛋白互作检测
从酵母菌 Y187、Y2HGold 转化子中分别挑取单个阳性克隆于 500 μL 2× YPDA 中混匀，30 ℃
培养 20 ~ 24 h，取适量涂于 SD/-Trp、SD/-Leu 和 DDO（SD/-Leu/-Trp）固体培养基，30 ℃倒置培养
3 ~ 5 d 至阳性克隆出现。再从 DDO 固体培养基上挑取阳性克隆分别涂于 SD/-Leu/-Trp/AbA
（DDO/A）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（QDO）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA（QDO/x/A）培
养基，30 ℃培养 3 ~ 5 d 观察是否有蓝色菌落。同时以 Thermo 公司 Yeast β-Galactosidase Assay Kit
试剂盒测定融合菌 OD660 值和 A420 吸光值，计算酵母 β–半乳糖苷酶活性（汤青林 等，2013）。
2 结果与分析
2.1 AGL24 基因克隆与序列分析
从‘青叶芥’芥菜中克隆的 AGL24 基因为 680 bp，含完整编码区，编码 221 个氨基酸，与油菜、
10 期 江 为等：芥菜开花相关基因 AGL24 的表达及与 SOC1、SVP 和 FLC 蛋白的互作 2047

拟南芥 AGL24（NCBI 登录号分别为 AFM77901 和 NP-194185）相似度高达 99%和 85%。结构域分
析（http：//pfam.sanger.ac.uk/）表明：芥菜 AGL24 为 MIKC 型蛋白，其中 M 域有 59 个氨基酸（第
3 ~ 61 位），I 域（位于 M 域与 K 域之间）有 11 个氨基酸，K 域有 102 个氨基酸（第 73 ~ 174 位），
C 域（位于 K 域之后）则有 47 个氨基酸（图 1）。



图 1 芥菜 AGL24 氨基酸序列分析
Fig. 1 Amino acid analysis of AGL24 in Brassica juncea

信号肽预测（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）表明：AGL24 蛋白的 N 端不含信号肽，
不属于胞外分泌蛋白或膜蛋白，因此可以利用酵母双杂交系统（Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid
System）分析该蛋白与其他蛋白的相互作用。
2.2 AGL24 分子进化分析
利用 Clustal x1.81 和 MEGA 5.0 软件构建的进化树（图 2）表明：芥菜 BjAGL24 与油菜 BnAGL24

图 2 芥菜 AGL24 分子进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic tree of AGL24 of Brassica juncea

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亲缘关系最近，与大王花 RcAGL24 和山核桃 CcAGL24 较近，与拟南芥 AtAGL24、毛白杨 PtAGL24、
小麦 TaAGL24、甜菜 BvAGL24 亲缘关系较远，与梅花 PmAGL24 最远。
2.3 AGL24 基因表达分析
2.3.1 AGL24在春化途径中的表达
根据本实验室前期的研究，低温春化 30 d 之前为营养生长期，之后为生殖生长期。利用荧光定
量 PCR 发现：AGL24 表达量在低温春化 0 和 30 d，以及低温春化结束之后回温 5、10 和 15 d 等不
同时期之间存在明显差异（图 3，A）。
芥菜叶片和茎尖的 AGL24 在营养生长期（低温春化 0 和 30 d）表达量较低，转入生殖生长期明
显增加，其中回温处理 10 d 时达到最高，但回温处理 15 d 时又有所下降。茎尖是感受低温春化的关
键部位，FLC 基因是春化途径的核心负调控因子。前人研究表明，茎尖和叶片的 FLC 表达量均会在
春化进程中逐渐降低（Ding et al.，2013）。而本试验中 AGL24 的表达规律与 FLC 并不一致，推测
AGL24 的表达可能并不受 FLC 直接调控。
此外，低温春化 0 d、低温后回温 5 和 15 d，AGL24 在叶片中的表达量高于茎尖；而低温春化
30 d 和低温后回温 10 d 的处理与此相反，即 AGL24 在茎尖的表达量高于叶片。这说明 AGL24 在叶
片和茎尖的表达调控机制也可能存在差异，尚待进一步研究。
2.3.2 AGL24在光周期途径中的表达
利用荧光定量 PCR 分析发现：16 h 长日照光周期途径中，芥菜叶片和茎尖的 AGL24 表达量在
营养生长期（长日照 0 d）较低，进入生殖生长期迅速增加，其中正常光周期处理 5 d 时达到峰值，
随后在 10 d 和 15 d 时又有所下降（图 3，B）。芥菜感受光周期的部位为叶片，成花部位为茎尖。
Hartmann 等（2000）报道开花负调控因子 SVP 在光周期途径的叶片和茎尖中表达量会逐渐降低，本
试验中 AGL24“先升后降”表达规律与其不完全一致，推测 AGL24 可能并不受 SVP 直接调控。


图 3 芥菜 AGL24 基因在低温春化（A）和光周期途径（B）的表达分析
Fig. 3 AGL24 gene expression in the vernalization pathway（A）and photoperiod pathway（B）of Brassica juncea

此外，长日照处理 30 d、正常光周期 5 d 和 10 d，AGL24 在叶片中的表达量高于茎尖，说明 AGL24
确实可在光周期途径的叶片中诱导表达。然而在正常光周期 15 d，AGL24 在叶片的表达量却低于茎
尖。推测本试验中在正常光周期处理 15 d，开花促进因子 FT 和 SOC1 的累积可能会大大促进 AGL24
10 期 江 为等：芥菜开花相关基因 AGL24 的表达及与 SOC1、SVP 和 FLC 蛋白的互作 2049

图 4 酵母诱饵重组质粒 NdeⅠ/ BamHⅠ双酶切电泳图
M：Trans2K plusⅡDNA marker；1：质粒 pGADT7-AGL24★；
2：质粒 pGADT7-AGL24。
Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of yeast plasmids digested by
restriction enzymes of NdeⅠand BamHⅠ
M：Trans2K plusⅡDNA marker；1：pGADT7-AGL24★；
2：pGADT7-AGL24.
在茎尖中的表达。因为 AGL24 并不是光周期途径中唯一的开花促进因子，成花素 FT 也可在叶片中
表达并能长距离运输到茎尖（刘智宇 等，2012），同时开花促进因子 SOC1 也能在茎尖表达促进开
花（鲜登宇 等，2013）。
2.3.3 两种开花途径中 AGL24的表达差异
在春化途径的 5 个处理（低温春化 0、30 d 以及回温 5、10 和 15 d）中，除低温春化 0 d 和回温
5 d 之外，AGL24 在茎尖中的表达和叶片相比均差异不显著（图 3，A）。然而在光周期途径的 5 个处
理（长日照光周期 0、30 d 以及正常光周期 5、10 和 15 d）中，除了长日照 30 d 和正常光周期 15 d
之外，AGL24 在茎尖和叶片中的表达均差异不显著（图 3，B）。由此可见，开花途径不同则 AGL24
表达规律也不完全相同，AGL24 基因的表达分别会受到春化途径和光周期途径调控。而且叶片和茎
尖不同感应部位的 AGL24 表达调控机制很可能存在差异。
另外，尽管 AGL24 在这两条途径中的表达总体上为“先升后降”，但是光周期途径的叶片和茎
尖中 AGL24 表达出现峰值的时期（回温 5 d）要早于低温春化途径（回温 10 d）（图 3，B）。在实际
种植中，光周期途径处理过的芥菜比春化处理开花更早，这也说明 AGL24 表达峰值的早晚与开花时
间可能是相关联的。也有文献报道 AGL24 在花器官形成时在茎尖表达较高，且调控茎尖发育（Yu et
al.，2004；Liu et al.，2007），说明 AGL24 的功能具有复杂性和多样化，很可能 AGL24 不仅调节开
花时间的早晚，而且还能调节花器官的形态建成。
2.4 AGL24 酵母诱饵质粒构建与鉴定
低温春化途径（FLC 为核心抑制因子）与光周期途径（SVP 为核心抑制因子）能殊途同归，均
汇集到开花整合途径（SOC1 为开花信号整合子）（Jung & Muller，2009）。AGL24 在以上这些开花
途径中也均有表达，是一个开花激活因子，但是其编码蛋白能否与 FLC、SVP、SOC1 相互作用，目
前并不清楚。
为了检测这些蛋白的互作关系，将芥菜
AGL24 编码区全长构建到诱饵质粒 pGADT7，
形成酵母重组质粒 pGADT7-AGL24，同时将去
掉 M 域的截短体 AGL24★也融合到酵母质粒
pGADT7，获得诱饵质粒 pGADT7-AGL24★。
经过 PCR 检测、NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴
定（图 4）以及测序，表明目的基因的核苷酸序
列、插入载体位置与方向均完全正确。
将以上重组质粒分别转入对应的酵母菌
Y187 后，均无自身转录激活活性，且对酵母菌
无毒性。本实验室保存的 pGBKT7-SOC1、
pGBKT7-SOC1★、pGBKT7-SVP、pGBKT7-FLC、
pGBKT7-SVP★和 pGBKT7-FLC★转入酵母菌
Y2HGold 后也无自激活和毒性，均可用于蛋白
相互作用等后续研究。
2.5 AGL24 蛋白与开花促进因子 SOC1 相互作用
2.5.1 全长蛋白互作
SOC1 能整合低温春化和光周期途径，促进开花。本试验利用酵母双杂交系统研究了开花整合子
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SOC1 与开花激活因子 AGL24 之间的蛋白作用关系。酵母双杂系统中的阳性对照 Y187（pGADT-T）×
Y2HGold（pGBKT7-53）和阴性对照 Y187（pGADT-T）× Y2HGold（pGBKT7-Lam）分别记作 H1
和 H2。同时额外自设阴性对照 X1 和 X2，即酵母重组载体 pGADT7-AGL24、pGBKT7-SOC1 分别
与对应空载体 pGBKT7、pGADT7 融合（表 2）。在 QDO/X-α-Gal/AbA 酵母营养缺陷型培养基上，
阳性对照（H1）能长出蓝色菌落，而所有阴性对照（H2、X1 和 X2）均不能生长，说明该酵母杂交
系统严谨可靠（表 2；图 5，A）。

表 2 诱饵蛋白 AGL24 与猎物蛋白 SOC1、SVP 或 FLC 相互作用分析
Table 2 Analysis of the interactions of prey AGL24 with bait SOC1，SVP or FLC in yeast
不同选择性培养基上的菌落 Different selective agar plates 编号
No.
类型
Type DDO DDO/AbA QDO QDO/X-α-Gal/AbA
X1 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7） 白色 White 无 No 无 No 无 No
X2 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1） 白色 White 无 No 无 No 无 No
X3 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1） 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue
V1 Y187（pGADT7-AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7） 白色 White 无 No 无 No 无 No
V2 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
V3 Y187（pGADT7-AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1★） 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue
T1 Y187（pGADT7-AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SOC1★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T3-1 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SVP） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T3-2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SVP） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T3-3 Y187（pGADT7-AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7-SVP） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T4-1 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-FLC） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T4-2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-FLC） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T4-3 Y187（pGADT7AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7-FLC） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T5-1 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-SVP★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T5-2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold（pGBKT7-SVP★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T5-3 Y187（pGADT7-AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7-SVP★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T6-1 Y187（pGADT7）× Y2HGold（pGBKT7-FLC★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T6-2 Y187（pGADT7-AGL24）× Y2HGold(pGBKT7-FLC★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
T6-3 Y187（pGADT7AGL24★）× Y2HGold（pGBKT7-FLC★） 白色 White 无 No 无 No 无 No
H1 Y187（pGADT-T）× Y2HGold（pGBKT7-53） 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue
H2 Y187（pGADT-T）× Y2HGold（pGBKT7-Lam） 白色 White 无 No 无 No 无 No

芥菜 AGL24 全长蛋白的诱饵质粒 pGADT7-AGL24，与 SOC1 全长蛋白的猎物 pGBKT7-SOC1
杂交（X3）后，在 DDO、DDO/AbA、QDO 培养基上均能长出白色菌落，说明该杂交组合（表 2）
激活了酵母报告基因 HIS3、ADE2、MEL1；同时还能在 QDO/X-α-Gal/AbA 培养基上长出蓝色菌落
（图 5，A，X3），进一步证明 AUR1-C 报告基因也被激活。由此表明 AGL24 全长蛋白与 SOC1 全
长蛋白能够相互作用。
2.5.2 截短体互作
将删掉 M 域后的截短体 AGL24★和 SOC1★分别融入到 pGADT7 和 pGBKT7，构建成截短体质粒
pGADT7-AGL24★和 pGBKT7-SOC1★。将 pGADT7-AGL24★、pGBKT7-SOC1★与对应空载体分别融
合作为自设阴性对照 V1、V2（表 2），它们均不能在 DDO/AbA、QDO、QDO/X-α-Gal/AbA 培养基
上生长。pGADT7-AGL24★ × pGBKT7-SOC1★杂交组合（表 2；图 5，A，V3）能在 QDO/X-α-Gal/AbA
上长出蓝色菌落，激活了酵母报告基因 HIS3、ADE2、MEL1、AUR1-C，说明同时去掉 M 域后的截
短体 AGL24★和 SOC1★也能相互作用。可见 AGL24 与 SOC1 蛋白互作的决定位点并不在它们的 M
10 期 江 为等：芥菜开花相关基因 AGL24 的表达及与 SOC1、SVP 和 FLC 蛋白的互作 2051

域。
然而，多次重复试验发现 pGADT7-AGL24★ × pGBKT7-SOC1 或者 pGADT7-AGL24 × pGBKT7-
SOC1★杂交组合（图 5，A，T1、T2）均不能在 QDO/X-α-Gal/AbA 上生长。表明截短体 AGL24★不
能与全长 SOC1 互作、全长 AGL24 也不能与截短体 SOC1★互作。推测 M 域的空间结构或者亲疏水
性可能会调节或干扰该作用。



图 5 AGL24 诱饵与 SOC1（A）、SVP（B）、FLC（C）及其截短体（D）酵母双杂交
酵母双杂交组合编号参见表 2。
Fig. 5 Protein interactions of prey AGL24 with bait SOC1（A），SVP（B），FLC（C）and its truncated forms（D）
in yeast on QDO/X-α-Gal/AbA plate
Hybrid combinations in yeast refer to Table 2.

2.5.3 作用强度分析
利用 Thermo 公司 Yeast β-Galactosidase Assay Kit 试剂盒测定杂交组合 pGADT7-AGL24 ×
pGBKT7-SOC1 和 pGADT7-AGL24★ × pGBKT7-SOC1★的 β–半乳糖苷酶活性，分析蛋白作用强度。
发现全长蛋白 AGL24 与 SOC1 互作的平均酶活性（5.05 Miller Units）显著低于截短体 AGL24★与
SOC1★之间的活性（8.24 Miller Units），进一步说明芥菜 AGL24 和 SOC1 蛋白的 M 域对蛋白互作
具有一定抑制作用。
2.6 AGL24 蛋白与开花抑制子 SVP、FLC 互作检测
芥菜 SVP 与 FLC 分别为光周期途径和低温春化途径的核心调控因子，能抑制开花。本试验也利
用酵母双杂交系统检测了 SVP、FLC 与开花激活子 AGL24 之间的蛋白互作关系。
阳性对照（H1）能在 QDO/X-α-Gal/AbA 平板长出蓝色菌落，而所有阴性对照（H2、V1、X1、T3-1、
T4-1、T5-1 和 T6-1）均不能在 QDO/X-α-Gal/AbA 上生长（图 5，B、C）。杂交组合 pGADT7-AGL24 ×
2052 园 艺 学 报 41 卷
pGBKT7-SVP（图 5，B，T3-2）或者 pGADT7-AGL24 × pGBKT7-FLC（图 5，C，T4-2）皆不能在
QDO/X-α-Gal/AbA 平板生长，不能同时激活酵母报告基因 HIS3、ADE2、MEL1 和 AUR1-C。说明
AGL24 全长蛋白与 SVP 或 FLC 蛋白均无相互作用。
将 AGL24 蛋白去掉 M 域后，重构酵母诱饵质粒 pGADT7-AGL24★，再次与 SVP 或 FLC 酵母双
杂交（图 5，B，T3-3；图 5，C，T4-3），仍不能在 QDO/X-α-Gal/AbA 培养基上生长，说明截短体
AGL24★也不与 SVP 或 FLC 互作。
将本实验室已有去掉 M 域的酵母质粒 pGBKT7-SVP★、pGBKT7-FLC★分别与 pGADT7-AGL24、
pGADT7-AGL24★两两融合，也不能在 QDO/X-α-Gal/AbA 培养基上生长（图 5，D，T5-2、T5-3、T6-2、
T6-3）。说明删掉 M 域的 SVP★或 FLC★均不能与 AGL24 全长及其截短体互作。
上述研究表明：AGL24 不是 SVP 或 FLC 的直接靶蛋白。
3 讨论
3.1 AGL24 基因是一个剂量依赖型的开花激活因子
本试验中所克隆的芥菜 AGL24 基因编码 221 个氨基酸残基，与油菜 AGL24（NCBI 登录号
AFM77901）相似度高达 99%，仅有 1 个氨基酸差别（在第 201 位上芥菜为丙氨酸，油菜则为甘氨
酸）。虽然芥菜 AGL24 与拟南芥 AGL24 相似度仅为 85%，但两者的 AGL24 表达特性却非常相似，
均可在营养生长期和生殖生长期表达，然而营养生长期的表达量远远低于生殖生长期（Yu et al.，
2002），而且无论在低温春化途径还是光周期途径中均为类似规律（图 3）。本实验室前期研究也表
明芥菜 AGL24 的确是一个开花激活因子，能够促进开花，但是并不是 AGL24 表达后就一定能够开
花。因为本研究中发现芥菜在营养生长期（低温春化或者长日照光周期处理之前）也有较低的表达
量，但进入生殖生长期（从低温春化或者长日照光周期处理结束后 15 d 之内）表达量才迅速升高，
可见芥菜 AGL24 很可能是一个剂量依赖型的开花激活因子，这与拟南芥 AGL24 具有类似功能（Yu et
al.，2002）。当拟南芥 AGL24 采用 RNAi 突变后会导致晚花，而 AGL24 转基因超量表达后会提早开
花。在拟南芥 AGL24 的多个突变体中，发现开花时间的早晚与 AGL24 mRNA 表达剂量高度相关
（Hartmann et al.，2000；Yu et al.，2002；Liu et al.，2007），拟南芥 AGL24 也是剂量依赖型的开花
激活因子。但是，芥菜开花发育事件的激发是否存在 AGL24 mRNA 表达的临界剂量（或临界阈值），
或者在基因表达量上 AGL24 与其他开花相关基因是否存在一个临界比值，这些并不清楚，待深入研
究。
3.2 AGL24 与 SOC1 的蛋白互作会受到 M 域的干扰
本试验中芥菜AGL24和 SOC1蛋白全长能够发生相互作用，但是删除M结构域后，发现AGL24★
截短体与 SOC1★截短体之间互作强度会显著增强，表明 M 域能抑制该蛋白相互作用。Leseberg 等
（2008）在研究番茄 MADS-box 家族蛋白之间的相互作用时，也发现了类似现象，说明 M 域确实会
干扰蛋白互作。但是令人感兴趣的是，本试验中截短体 AGL24★不能与全长 SOC1 互作、全长 AGL24
也不能与截短体 SOC1★互作，截短体与全长的互作强度并不是介于全长与全长以及截短体与截短体
之间，尽管试验重复多次其结果依然如此。
由于 AGL24 和 SOC1 蛋白的 M 域均由 α 螺旋和 β 转角构成，它们的 M 域很可能对蛋白互作存
在空间上的位阻（Kaufmann et al.，2005）。由此推测：（1）当 AGL24 和 SOC1 两者同时删掉 M
域后则可能会消除 M 域的空间位阻，能够顺利发生蛋白相互作用。（2）当两者均保留 M 域则存在
10 期 江 为等：芥菜开花相关基因 AGL24 的表达及与 SOC1、SVP 和 FLC 蛋白的互作 2053

空间位阻，但是蛋白彼此靠近发生互作的潜在力量可能会使 AGL24 的 M 域与 SOC1 的 M 域彼此相
互挤压或牵引拉伸，导致两者的 M 域在空间上均舒展开来，最终使 AGL24 与 SOC1 能结合在一起。
（3）当 AGL24 与 SOC1 任何一方保留 M 域而另一方删掉 M 域，则保留 M 域的一方形成空间上的
“盾牌”阻挡另一方的靠近，而另一方由于缺失 M 域不能提供挤压或牵引拉伸的支撑结构，无法消
除该空间“盾牌”，导致蛋白不能彼此靠近也无法结合在一起。
3.3 AGL24 与 SOC1 在功能上相互依赖却又相对独立
本研究中利用酵母双杂交发现芥菜 AGL24 蛋白能与开花整合子 SOC1 相互作用，说明芥菜
AGL24 可能被 SOC1 调控。删除 M 域后的截短体 AGL24★与 SOC1★也能相互作用，但是截短体
AGL24★不能与 SOC1 全长互作，AGL24 全长也不能与截短体 SOC1★互作。说明 M 域对该蛋白互作
有影响，这可能是由于 M 域对蛋白折叠等空间构象的调节所致。在拟南芥中，AGL24 作为开花激活
基因与 SOC1 功能相似。AGL24 在植株上的主要表达空间与 SOC1 相同（Yu et al.，2002；Michaels et
al.，2003；Liu et al.，2008）。微阵列（Mircoarray）分析表明：AGL24 和 SOC1 能够相互提高彼此的
表达水平，同时也发现 AGL24 与 SOC1 能够蛋白互作（Michaels et al.，2003；Liu et al.，2008），表
明 AGL24 和 SOC1 之间能形成正反馈回路。
尽管芥菜 FLC 为多成员的蛋白家族，但是 FLC2才是抑制开花的关键成员，本试验的芥菜 FLC
正是 FLC2。本试验中芥菜 AGL24 不能与春化途径抑制因子 FLC 互作，也不能与光周期途径抑制因
子 SVP 互作，可见 AGL24 很可能不受开花抑制子 FLC 或 SVP 蛋白调控，然而在拟南芥中 SOC1 却
受 FLC 或 SVP 调控。说明 AGL24 与 SOC1 两者虽然功能相似，但它们之间的作用机制并不相同。
首先，虽然 AGL24 的表达被春化所调控，但是它不受开花抑制因子 FLC 的影响。相反，FLC 在分
生组织中抑制 SOC1 的表达并且通过抑制 FT 来延迟 SOC1 的表达（Hepworth et al.，2002）。其次，
在光周期途径中，AGL24 被 CONSTANS（CO）影响却不受 SVP 和 FT 调控（Yu et al.，2002）。然
而 SOC1 主要受到 FT 直接调控。同时，CO 通过一个目前未知的 DNA 结合因子间接的调控 SOC1
表达（Samach et al.，2000；Hepworth et al.，2002）。说明 AGL24 与 SOC1 也可以在相对独立的途径
中促进开花。

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