全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（4）：675–684 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–12–01；修回日期：2013–03–11
基金项目：重庆市自然科学基金项目（2011BA1002）；国家自然科学基金项目（31000908）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2012B020）；
国家重点基础研究发展计划（973 计划）项目（2012CB113900）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：swausongm@yahoo.com.cn；swutql@163.com）
芥菜开花负调因子 SVP及FLC同源互作域筛选
和作用强度分析
汤青林，丁 宁*，李念祖，王志敏，宋 明**
（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）
摘 要：为探明芥菜开花负调因子 SVP、FLC 自身聚合的分子机制及其蛋白作用模式，利用酵母双
杂交体系，分别对 SVP、FLC 蛋白自身聚合及其作用强度进行研究。结果表明：酵母菌 Y187 转化子
Y187-pGADT7SVP 和Y187-pGADT7SVP2 ~ 5 均能与酵母菌 Y2HGold 转化子 Y2HGold-pGBKT7SVP 融合，
并可在选择性固体培养基 QDO/X/A 上长出蓝色菌落，而 Y187-pGADT7SVP1 × Y2HGold-pGBKT7SVP 不
能在 QDO/X/A 生长。说明 SVP 蛋白能自身聚合，且与截短体 SVP2 ~ 5 同源结合，SVP 蛋白自身聚合需
要核心作用域 K 域参与。尽管 MI 域不能单独介导 SVP 自身聚合，但它的存在却能使 SVP 自身聚合作用
增强，C 域有可能会削弱该作用。同时，Y2HGold-pGBKT7FLC 和 Y2HGold-pGBKT7FLC2 ~ 5 也能与
Y187-pGADT7FLC 融合，同时激活报告基因 AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1，FLC 能与截短体 FLC2 ~ 5
同源互作。K 域是 FLC 蛋白自身聚合必须的，I 域会增强这一作用。SVP 和 FLC 的核心作用域 K 域均由
K1、K2 和 K3 亚域组成，形成 3 个经典的 α 螺旋，K 域有 9 个高度保守的氨基酸位点及蛋白互作的结构
模体（亮氨酸拉链）。
关键词：芥菜；截短体；SVP；FLC；酵母双杂交
中图分类号：S 637.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）04-0675-10

Evaluation of Acting Domain and Strength Mediating the Protein
Self-interactions of SVP and FLC in Brassica juncea
TANG Qing-lin，DING Ning*，LI Nian-zu，WANG Zhi-min，and SONG Ming**
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions，Ministry of Education；Key Laboratory of Olericulture，Chongqing 400715，China）
Abstract：For further study on the molecular mechanism and interaction model of SVP and FLC
protein homologous dimerization in flowering control in Brassica juncea Coss.（mustard），the self-
interactions of SVP and FLC were detected by the yeast two-hybrid system. The yeast stains of
pGADT7SVP or pGADT7SVP2–5 could mate with pGBKT7SVP，which grew on selective agar plates
QDO/X/A（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA）with blue stains. However，Y187-pGADT7SVP1 and
Y2HGold-pGBKT7SVP could not mate into zygote diploids to grow on selective plates DO/X/A. The

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results showed that SVP or SVP2–5 truncated forms could act with SVP itself to combine and form
homodimers. K domain of SVP was the key amino acid region to independently mediate and determine the
homologous dimerization. MI-domain of SVP alone could not induce the self-interactions of SVP，but
enhance the strength of homologous interactions. However，C-domain of SVP could weaken the protein
self-interaction strength. The yeast stains of pGBKT7FLC2–5 and pGADT7FLC could mate into zygotes
and grew on selective agar plates QDO/X/A with blue stains. The DNA-BD and AD were brought into
proximity to activate transcription of four independent reporter genes（AUR1-C，HIS3，ADE2，MEL1）.
FLC2–5 truncated forms and FLC protein could act with each other to form homodimers. It also indicated
that K domain of FLC may play an important role in mediating the FLC homodimers. However，I-domain
of FLC could strengthen the protein self-interactions. Alignment analysis of K domain sequence showed
that K domain was consist of three subdomains（K1，K2 and K3）and formed three  helixes. Nine high
conservative amino acids existed in K domain. Leucine zippers，protein interaction motifs，lied in K
domain.
Key words：Brassica juncea；truncated forms；SVP；FLC；yeast two-hybrid system

开花负调因子 SVP 属 MADS 盒蛋白，是一个重要的开花抑制子（Hartmann et al.，2000），在开
花网络中具有核心调节作用。SVP 蛋白能在茎尖分生组织和叶片中直接抑制 SOC1 基因的转录，从
而抑制开花（Li et al.，2008）。此外，表达于叶片并长距离运输到茎顶端分生组织的成花信号 FT，
也会受到 SVP 的调节（Lee et al.，2007）。SVP 蛋白能结合到 SOC1 和 FT 基因的启动子上，抑制其
转录表达，该结合区域同时也是另一个开花路径核心调节子 FLC 蛋白的绑定位点（Abe et al.，2005；
Wigge et al.，2005；Searle et al.，2006；Corbesier et al.，2007），SVP 能与 FLC 相互作用，延缓开
花（Li et al.，2008；Sumire et al.，2008；Jung & Müller，2009）。目前利用 pET 原核表达系统和酵
母双杂交系统已分别证实了芥菜 SVP 与 FLC 能够相互作用，形成稳定的异源蛋白复合物（汤青林
等，2011，2012a）。
但是，两个 MADS 盒蛋白之间的相互作用，往往并非只形成单纯的异源二聚体。酵母双杂表明，
拟南芥中许多 MADS 盒蛋白除了能形成异源二聚体外，还能够形成同源二聚体，最终为同源异源四
聚体（de Folter et al.，2005）。很可能这些同源异源四聚体才是真正行使功能的蛋白复合体（Immink
et al.，2002；Yang & Jack，2004；Nougalli et al.，2006）。
有关 FLC 蛋白同源二聚体的研究已有报道。例如，Chris 等（2006）构建了 FLC-FLAG 标签蛋
白载体（gFLC-FLAG），并转到 FLC 内源表达量高的植物中。利用 anti-FLAG M2 对 FLC-FLAG 蛋
白免疫沉淀，发现 FLC-FLAG 和内源 FLC 共存于蛋白复合物中，由此表明 FLC 能够形成同源二聚
体。但是，有关 FLC 自身聚合的研究均集中于模式植物拟南芥，FLC 是否也能在芥菜中发生自身聚
合，目前还未见报道。此外，SVP 蛋白是否也能够自身聚合，形成同源二聚体，目前还缺乏直接的
分子证据。为了检测 SVP、FLC 蛋白的自身聚合及其作用域，作者构建了 SVP、FLC 的多个截短体，
并进行了酵母双杂交试验，对揭示 SVP 与 FLC 互作模型及其开花调控的分子机理具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
酵母双杂交系统（Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System）、Aureobasidin A（以下简称 AbA）、
4 期 汤青林等：芥菜开花负调因子 SVP 及 FLC 同源互作域筛选和作用强度分析 677

X--Gal、YPD、YPDA 及各种酵母缺陷型培养基均购自 Clontech 公司。β–半乳糖苷酶活性测定试
剂盒（Yeast β-Galactosidase Assay Kit）购自 Thermo 公司。芥菜 SVP、FLC 及相应截短体 SVP1 ~ 5、
FLC1 ~ 5 均由本实验室提供（汤青林 等，2012b），编码氨基酸以及结构域见表 1 和图 1。

表 1 SVP、FLC 及其截短体
Table 1 SVP，FLC and its truncated forms
截短体名称
Truncated name
编码氨基酸数
Number of amino acids
编码蛋白的结构域
Protein domain
SVP 241 MIKC
SVP1 95 MI
SVP2 173 MIK
SVP3 78 K
SVP4 179 IKC
SVP5 146 KC
FLC 197 MIKC
FLC1 110 MI
FLC2 168 MIK
FLC3 54 K
FLC4 148 IKC
FLC5 92 KC
注：SVP、FLC 表示蛋白全长；SVP1 ~ 5、FLC1 ~ 5 表示相应的蛋白截短体；MIKC、MI、MIK、K、IKC 和 KC 分别由蛋白质 M、I、
K、C 结构域中的若干个结构域组合而成（例如，MIKC 由 M、I、K 和 C 域构成；MI 由 M 和 I 域构成）。
Note：SVP and FLC represented full length proteins. And SVP1–5，FLC1–5 represented truncated forms of corresponding proteins. MIKC，
MI，MIK，K，IKC and KC respectively represented corresponding combination proteins of M，I，K or C domains.


图 1 芥菜 SVP（A）、FLC（B）蛋白结构域
MADS、I、K 和 C 表示 MIKC 型蛋白的结构域。
Fig. 1 Domain structure of SVP（A）and FLC（B）in Brassica juncea Coss.
MADS，I，K and C represented structure domains of proteins.

1.2 酵母表达载体构建及其毒性、自激活检测
SVP、FLC 质粒经 EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后分别连接到酵母质粒 pGBKT7、pGADT7，构建诱饵
质粒 pGBKT7SVP、pGBKT7FLC 和猎物质粒 pGADT7SVP、pGADT7FLC，并分别转化酵母菌 Y2HGold
和 Y187。截短体 SVP1 ~ 5、FLC1 ~ 5 质粒分别酶切后连接到酵母质粒 pGBKT7、pGADT7，构建酵
母质粒 pGBKT7FLC1 ~ 5、pGADT7SVP1 ~ 5，并分别转化酵母菌 Y2HGold 和 Y187。
酵母转化子 Y2HGold-pGBKT7SVP、Y187-pGADT7SVP、Y187-pGADT7SVP1 ~ 5、Y2HGold-
pGBKT7FLC、Y2HGold-pGBKT7FLC1 ~ 5 、Y187-pGADT7FLC 自身均不能激活报告基因，且对酵
母无毒性，可用于后续的酵母双杂交研究（汤青林 等，2012b）。
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1.3 酵母双杂交及其作用域筛选
分别挑取 SD/-Trp、SD/-Leu 平板上的菌落，将 SVP 全长转化子 Y187-pGADT7SVP1 及 SVP1 ~
5 片段转化子 Y187-pGADT7SVP1 ~ 5 分别与 Y2HGold-pGBKT7SVP 转化菌落两两组合，同时接种
于 500 μL 的 2× YPDA 液体培养基中，30 ℃振荡培养 20 ~ 24 h，在 40 倍显微镜下检测 Y2HGold 与
Y187 交配形成二倍体接合型的情况。然后将融合菌液涂布到 SD/-Trp/-Leu（DDO）、SD/-Trp/-Leu/AbA
（DDO/AbA）平板上，30 ℃培养 3 ~ 5 d；最后将 DDO/AbA 平板上的克隆菌株划线至 SD/-Trp/-Leu/-
Ade/-His（QDO）和 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/x-α-Gal/AbA（QDO/X-α-Gal/AbA）平板，同时设阳性和
阴性对照，观察菌落生长情况。
同样将含有FLC全长的Y187-pGADT7FLC转化子与含有不同结构域的Y2HGold-pGBKT7FLC、
Y2HGold-pGBKT7FLC1 ~ 5 两两融合后，分别先后涂布于 DDO、DDO/AbA、QDO 和 QDO/X-α-Gal/
AbA 平板上，检测 FLC 蛋白自身聚合情况，并筛选相应的结构域。
1.4 β–半乳糖苷酶活性测定
采用 Thermo 公司 Yeast β-Galactosidase Assay Kit 试剂盒。
（1）挑取融合菌的单克隆菌落，置于 5 mL YPDA 液体培养基中，30 ℃、200 r · min-1 培养 10 ~
14 h，至指数生长中期（OD660 = 0.5 ~ 1.0），准确记录 OD660 值。
（2）将 2× β–半乳糖苷酶含量测定液置于冰上。
（3）移取 1.0 mL 培养物到 1.5 mL EP 管中，13 000 × g 离心 1 min 移去上清液。同法离心，用
无菌水清洗沉淀两次。依次加入 250 μL 酵母蛋白提取试剂（Y-PER）、250 μL 的 2× β–半乳糖苷酶
含量测定液，放入 37 ℃培养箱，立即计时。
（4）待出现黄色后，加入 200 μL 的 β–半乳糖苷酶反应终止液涡旋 15 s，并停止计时。
（5） 13 000 × g离心30 s去除沉淀，转移上清液，420 nm处测定吸光值。对照采用250 μL Y-PER、
250 μL 的 2× β–半乳糖苷酶含量测定液和 200 μL 的 β–半乳糖苷酶反应终止液。
每样品重复测 3 次，取平均值。β–半乳糖苷酶活性 =（1 000 × A420）／（t × V × OD660）。t 为
反应时间（min），V 为用作检测活性的菌悬液体积（mL），活性单位表示为‘Miller Units’（郜尽 等，
2009）。
2 结果与分析
2.1 SVP 及 FLC 全长自身聚合鉴定
2.1.1 SVP全长自身聚合鉴定
将芥菜 SVP 全长（含有 MIKC 结构域）构建到诱饵质粒 pGBKT7 和猎物质粒 pGADT7，并分
别转化酵母 Y2HGold 和 Y187。酵母转化子 Y2HGold-pGBKT7SVP 与 Y187-pGADT7SVP 融合后的
二倍体酵母记为 H0，Y2HGold-pGBKT7SVP 与空载 Y187-pGADT7 融合、空载 Y2HGold-pGBKT7
与 Y187-pGADT7SVP 融合分别记为 M、C0，酵母试剂盒中自带的阳性和阴性对照分别记为 P、N
（表 2）。
H0 在 DDO 培养基上生长，说明 SVP 与 SVP 自身融合，形成了二倍体酵母；H0 也能在 DDO/AbA
上生长，说明激活了酵母报告基因 AUR1-C；H0 在 QDO 固体培养基上可正常生长，说明激活了酵
母报告基因 HIS3 和 ADE2（表 2）。另外，H0 还能够在 QDO/X-α-Gal/ AbA（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/
X-α-Gal/AbA）固体培养基上长出蓝色菌落，激活酵母报告基因 MEL1，而阴性对照（M、C0）却不
4 期 汤青林等：芥菜开花负调因子 SVP 及 FLC 同源互作域筛选和作用强度分析 679

能在 QDO/X-α-Gal/AbA 固体培养基上生长（表 2）。由此表明：SVP 全长蛋白（含 MIKC 域）确实
能够发生自身聚合，形成同源蛋白复合物，启动酵母的 4 个报告基因 HIS3、AUR1-C、ADE2、MEL1
全部表达。
表 2 SVP 及 FLC 全长自身聚合分析
Table 2 Analysis of the self-interactions of SVP and FLC in yeast
选择性培养基 Selective agar plates 编号
No.
类型 Type
DDO DDO/AbA QDO QDO/X-α-Gal/AbA
H0 Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP + + + ++
M Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7 + – – –
C0 Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP + – – –
F0 Y2HGold-pGBKT7FLC × Y187-pGADT7FLC + + + ++
L Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7FLC + – – –
K0 Y2HGold-pGBKT7FLC × Y187-pGADT7 + – – –
P Y2HGold-pGBKT7-53 × Y187-pGADT-T + + + ++
N Y2HGold-pGBKT7-Lam × Y187-pGADT-T + – – –
注：++、+ 和–分别表示蓝色菌落、白色菌落和无菌落。
Note：++，+ and–respectively represented blue yeast stains，white yeast stains and no stains on the plates.

2.1.2 FLC全长自身聚合鉴定
酵母转化子 Y2HGold-pGBKT7FLC 与 Y187-pGADT7FLC 融合的二倍体酵母 Y2HGold- pGBKT
7FLC × Y187-pGADT7FLC 记为 F0，Y2HGold-pGBKT7FLC 与空载 Y187-pGADT7FLC 融合、空载
Y2HGold-pGBKT7 与 Y187-pGADT7FLC 融合分别记为 L、K0（表 2）。
二倍体酵母 F0在DDO、DDO/AbA和QDO固体培养基上均可正常生长，还能够在QDO/X-α-Gal/
AbA（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA）固体培养基上长出蓝色菌落，启动 HIS3、AUR1-C、ADE2、
MEL1 这 4 个报告基因的表达；而阴性对照（N、L、K0）却不能在 QDO/X/A 固体培养基上生长（表
2）。由此表明：芥菜 FLC 也能自身聚合形成同源蛋白复合体。
2.2 SVP 及 FLC 同源互作结构域筛选
2.2.1 SVP全长与截短体互作及结构域筛选
为了进一步筛选 SVP 蛋白自身聚合的结构域，设置 6 个处理 H0、H1、H2、H3、H4、H5 和 9
个对照组 C0、C1、C2、C3、C4、C5、M、P、N（图 2，A）。在 9 个对照中，酵母双杂系统试剂盒
中的阳性对照 Y2HGold-pGBKT7-53 × Y187-pGADT-T（图 2，A 中 P）在 DDO/AbA、QDO 中均能
生长，在 QDO/X-α-Gal/AbA 缺陷型培养基中也能生长，呈蓝色菌落（图 2，A）。其余 8 个对照在这
3 种培养基中都不生长。可见本酵母双杂交系统稳定严谨，可以用于 SVP 蛋白同源互作域的筛选。
在 6 个处理组中，只有 Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP、Y2HGold-pGBKT7SVP ×
Y187-pGADT7SVP2、Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP3、Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-
pGADT7SVP4、Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP5 这 5 个（图 2，A 中 H0、H2 ~ 5）能
够在缺陷型培养基 DDO/AbA、QDO 上长出白色菌落，且在 QDO/X-α-Gal/AbA 培养基中呈现蓝色
菌落（图 2，A），能够激活酵母双杂系统的 ADE2、AUR1-C、HIS3 和 MEL1 报告基因，发生蛋白相
互作用。Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP1 处理不能在 DDO/AbA、QDO 和 QDO/X-α-Gal/
AbA 培养基上生长，不能发生蛋白互作（图 2，A 中 H1）。
截短体蛋白 SVP2（含 MIK 域）、SVP3（含 K 域）、SVP4（含 IKC 域）、SVP5（含 KC 域）均
含有 K 域，且分别能够与 SVP 全长结合，但 SVP1（只有 MI 域，不含 K 域）不能与 SVP 全长结合。
说明 K 域可以介导 SVP 蛋白的自身二聚化，是 SVP 蛋白同源互作的关键结构域。
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图 2 酵母中 SVP（A）、FLC（B）自身聚合分析
Fig. 2 Analysis of the self-interactions of SVP and FLC in yeast on the plate QDO/X-α-Gal/AbA
H0：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP；H1：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP1；
H2：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP2；H3：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP3；
H4：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP4；H5：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7SVP5；
P：Y2HGold-pGBKT7-53 × Y187-pGADT-T；N：Y2HGold-pGBKT7-Lam × Y187-pGADT-T；
M：Y2HGold-pGBKT7SVP × Y187-pGADT7；C0：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP；
C1：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP1；C2：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP2；
C3：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP3；C4：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP4；
C5：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7SVP5.
F0：Y2HGold-pGBKT7FLC × Y187-pGADT7FLC；F1：Y2HGold-pGBKT7FLC1 × Y187-pGADT7FLC；
F2：Y2HGold-pGBKT7FLC2 × Y187-pGADT7FLC；F3：Y2HGold-pGBKT7FLC3 × Y187-pGADT7FLC；
F4：Y2HGold-pGBKT7FLC4 × Y187-pGADT7FLC；F5：Y2HGold-pGBKT7FLC5 × Y187-pGADT7FLC；
P：Y2HGold-pGBKT7-53 × Y187-pGADT-T；N：Y2HGold-pGBKT7-Lam × Y187-pGADT-T；
L：Y2HGold-pGBKT7 × Y187-pGADT7FLC；K0：Y2HGold-pGBKT7FLC × Y187-pGADT7；
K1：Y2HGold-pGBKT7FLC1 × Y187-pGADT7；K2：Y2HGold-pGBKT7FLC2 × Y187-pGADT7；
K3：Y2HGold-pGBKT7FLC3 × Y187-pGADT7；K4：Y2HGold-pGBKT7FLC4 × Y187-pGADT7；
K5：Y2HGold-pGBKT7FLC5 × Y187-pGADT7.

2.2.2 FLC全长与截短体互作及结构域筛选
由酵母双杂交结果可知（图 2，B），截短体蛋白 FLC2（缺少 C 域）、FLC3（只含有 K 域）、FLC4
（缺少 M 域）、FLC5（缺少 M 域和 I 域）分别能够与 FLC 全长蛋白融合，并均能在 QDO/X-α-Gal/
AbA 固体培养基上生长，菌落呈现不同程度的蓝色（图 2，B 中编号 F2、F3、F4、F5），证明激活
了酵母的 4 个报告基因 AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。但是 FLC1（只含有 M 域和 I 域）不能与
FLC 全长发生蛋白互作（图 2，B 中编号 F1）。
由此表明：FLC 蛋白自身聚合作用既不由 C 域决定，也不由 M 域和 I 域决定，而是由核心结构
域 K 域所决定。
2.3 SVP 及 FLC 自身聚合的作用强度分析
2.3.1 SVP自身聚合强度分析
为了进一步检测 SVP 蛋白自身聚合的作用强度，采用 Thermo 公司 Yeast β-Galactosidase Assay
Kit 试剂盒测定了 β–半乳糖苷酶活性。由于酵母 Y187 含有 LacZ 启动子，酵母 Y187 单转化子不能
在 QDO/X-α-Gal/AbA 培养基上生长（LacZ 启动子不能激活），但是 Y187 转化子与 Y2HGold 转化子
融合并产生相互作用后则可在 QDO/X-α-Gal/AbA 培养基上生长，激活 LacZ 启动子。因此可用 β–
半乳糖苷酶活性检测 LacZ 启动子，从而推测蛋白相互作用强度。
4 期 汤青林等：芥菜开花负调因子 SVP 及 FLC 同源互作域筛选和作用强度分析 681

方差分析表明，SVP 全长与 SVP 截短体的互作强度差异达到极显著水平（表 3），其中 SVP2（含
K 域，也含 MI 域）与 SVP 作用的酶活性 16.65 极显著高于 SVP3（只含 K 域）与 SVP 杂交组合（酶
活性为 10.34），也极显著高于其余杂交组合。由此可见 K 域是引发 SVP 自身聚合的核心结构域。
尽管 MI 域单独不会引发 SVP 自身聚合，但 MI 域的存在会使 SVP 自身聚合强度显著增加。不含 C
域的蛋白截短体组合（SVP2 × SVP、SVP3 × SVP）的作用强度均极显著高于含 C 域的截短体组合
（SVP × SVP、SVP4 × SVP、SVP5 × SVP），由此推测，C 域可能会干扰（削弱）SVP 自身聚合。

表 3 酵母中SVP自身聚合强度分析
Table 3 Analysis of the self-interaction strength of SVP in yeast
选择性培养基 Selective agar plates SVP杂交组合
Hybrid
combinations
BD AD
截短体结构域
Protein domain
of truncated
forms
DDO DDO/AbA QDO
QDO/X-α-Gal/
AbA
相互作用
Interactio
ns
酶活性/Miller
Units
β-galactosidase
activity
SVP SVP2 MIK 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 16.65 A
SVP SVP3 K 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 10.34 B
SVP SVP4 IKC 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 2.49 C
SVP SVP MIKC 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 2.19 C
SVP SVP5 KC 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 1.58 C
SVP SVP1 MI 白色 White 无 No 无 No 无 No 无 No 0.03 D

2.3.2 FLC自身聚合强度分析
FLC 蛋白自身聚合的酶活性分析也表明，不同结构域与 FLC 全长的作用强度不同（表 4）。FLC4
（含有 K 域，也含 I 和 C 域）与 FLC 作用强度（18.49）极显著高于 FLC3（只含 K 域）与 FLC 杂
交组合（9.08），也极显著高于 FLC5（含 K 域，也含 C 域）与 FLC 杂交组合。由此可见，K 域是
FLC 蛋白自身聚合必须的，C 域不会增强这一作用，但 I 域会增强 FLC 自身聚合。FLC 分别与 FLC
（含 IKC 域，也含 M 域）、FLC2（含 IK 域，也含 M 域）杂交，其作用强度均极显著低于杂交组合
（SVP × SVP4、SVP × SVP3），可见 M 域的存在会干扰（削弱）FLC 自身聚合。
以上分析表明，SVP 以及 FLC 蛋白自身聚合均需要核心结构域 K 域参与，I 域的存在会增加它
们的作用强度。
表 4 酵母中 FLC 自身聚合强度分析
Table 4 Analysis of the self-interaction strength of FLC in yeast
选择性培养基 Selective agar plates FLC杂交组合
Hybrid
combinations
BD AD
截短体结构域
Protein domain
of truncated
forms
DDO DDO/AbA QDO
QDO/X-α-Gal/
AbA
相互作用
Interactions
酶活性/Miller
Units
β-galactosidase
activity
FLC4 FLC IKC 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 18.49 A
FLC3 FLC K 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 9.08 B
FLC FLC MIKC 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 2.05 C
FLC2 FLC MIK 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 1.76 C
FLC5 FLC KC 白色 White 白色 White 白色 White 蓝色 Blue 有 Yes 0.94 D
FLC1 FLC MI 白色 White 无 No 无 No 无 No 无 No 0.05 E
2.4 核心作用域 K 域氨基酸序列分析
K 域氨基酸序列分析表明：与其他作物（白菜、甘蓝、拟南芥、大豆、葡萄和猕猴桃）开花调
控因子 SVP、FLC、AP1、CAL 蛋白 K 域一样，芥菜 SVP（BjSVP）和 FLC（BjFLC）的 K 域也由
682 园 艺 学 报 40 卷
K1、K2 和 K3 亚域组成，每个亚域均有七价（abcdefg）n 重复区（图 3），其中，a 和 d 位置几乎全
为疏水氨基酸，使得 K 域形成了 3 个经典的 α 螺旋，这与在线 α螺旋分析（http：//www.ch.embnet.org/
software/COILS_form.html）的结果一致。
芥菜 SVP 蛋白 K 域的第 1 个 α 螺旋（K1 亚域）在第 1 到 19 位氨基酸内（图 3，Ⅰ）；第 2 个
α螺旋（K2 亚域）在 K 域第 32 到 46 位氨基酸内（图 3，Ⅱ）；第 3 个 α 螺旋（K3 亚域）在 K 域第
54 到 75 位氨基酸内（图 3，Ⅲ）。而 FLC 蛋白 K 域的第 1 个 α 螺旋（K1 亚域）在第 4 到 18 位氨
基酸内（图 3，Ⅱ），第 2 个 α螺旋（K2 亚域）在 K 域第 26 到 47 位氨基酸内（图 3，Ⅲ）；第 3 个
α螺旋（K3 亚域）则从 K 域第 51 位氨基酸一直延伸到 C 域（图 3，Ⅳ，FLC 蛋白的 C 域未列出）。
SVP 蛋白的 K1 与 K2 亚域之间（或者 FLC 蛋白 I 域与 K1 亚域之间），有两个保守性较强的疏
水氨基酸位点（图 3 中用 h 标注），它们并不影响这两个结构域的 α 螺旋。SVP 蛋白的 K2 与 K3 亚
域之间（或者 FLC 蛋白的 K1 亚域与 K2 亚域之间）有一个高度保守的碱性氨基酸 Lys，它位于 SVP
蛋白 K 域第 50 位（或 FLC 蛋白 K 域第 22 位），也不会影响 α螺旋。
SVP 蛋白 K2 亚域内（或 FLC 蛋白 K1 亚域）有 5 个高度保守的氨基酸位点（图 3 双下划线所
示），除了 1 个位点为酸性氨基酸 Glu，其它 4 个均为疏水氨基酸 Leu。SVP 蛋白 K3 亚域（或 FLC
蛋白 K2 亚域）有 3 个高度保守的氨基酸位点，分别为 Leu、Lys 和 Asn（图 3）。此外，在 SVP 蛋
白 K2 和 K3 亚域（或者 FLC 蛋白 K1 亚域和 K2 亚域）均存在蛋白互作的结构模体（motif），即亮
氨酸拉链（leucine zipper）。
上述保守的氨基酸位点以及亮氨酸拉链，有可能对 SVP 或 FLC 蛋白自身聚合起着重要作用。

1 10 20 30 40 50 60 70 80
| | | | | | | | |
BjSVP DHALLSKEIAEKSHRLRQMRGEELQGLNIEELQQLEKALESGLTRVIETKSEKIMNEISYLQRKGMQLMDEN----KRLRQQ
BrSVP DHALLSKEIAEKSHRLRQMRGEELQGLNIEELQQLEKALESGLTRVIETKSEKIMNEISYLQRKGMQLMDEN----KRLRQQ
BoSVP DHALLSKEIAGKSHRLRQMRGEELQGLNIEELQQLEKALESGLTRVIETKSEKIMNEISYLQRKGMQLMDVN----KRLRQQ
AtSVP DHARMSKEIADKSHRLRQMRGEELQGLDIEELQQLEKALETGLTRVIETKSDKIMSEISELQKKGMQLMDEN----KRLRQQ
GmSVP NCSRLSKEVAEKSHQLRQLRGEDLQGLNIEELQQLERSLETGLGRVIEKKGEKIMSEITDLQRKGMLLMEEN----ERLKRH
VvSVP NHSRLSKEVADKSHKLRQMRGEELQGLNIEDLQQLEKSLEAGLSRVIQKKGERIMKEITDLQSKGVQLMEEN----ERLRQQ
AdSVP NLVKLGKDVSEKTTQLRQMRGEDLQGLNINELQHLEKMLEAGLSRVLETKGERIMNEIATLQRKGAELVEEN----QRLKQK
AtFLC SHYELLELVDSK------LVGSNVKNVSIDALVQLEEHLETALSVTRAKKTELMLKLVENLKEKEKMLKEEN----QVLASQ
BjFLC SHDELLELVESK------LVESNLD-VSVESLVQLEDHLETSLSVTRARKTELMLKLVDSLKEKEKLLKEEN----QGLTSQME
AtAP1 EYNRLKAKIELLERNQRHYLGEDLQAMSPKELQNLEQQLDTALKHIRTRKNQLMYESINELQKKEKAIQEQNSMLSKQIKER
BoAP1 EYNRLKAKIELLERNQRHYLGEDLQAMSPKELQNLEQQLDTALKHIRSRKNQLMYDSVNELQRKEKAIQEQNSMLSKQIKER
BrCAL EYSRLKAKIELLERNQRHYLGEDLESISIKELQNLEQQLDTSLKHIRSRKNQLMHESLNHLQRKEKEILEENSMLTKQIKER
AtCAL EYSRLKAKIELLERNQRHYLGEELEPMSLKDLQNLEQQLETALKHIRSRKNQLMNESLNHLQRKEKEIQEENSMLTKQIKER
gabcdefgabcdefgabcd h h abcdefgabcdefga defgabcdefgabcdefgabcdefga bcde
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ

图 3 K 域序列同源性比对
Br：白菜；Bo：甘蓝；At：拟南芥；Ad：猕猴桃；Gm：大豆；Vv：葡萄；Bj：芥菜。
单下划线表示 K 域，双下划线表示保守氨基酸位点。
Fig. 3 K domain sequence alignment
Br：Brassica campestris；Bo：Brassica oleracea；At：Arabidopsis thaliana；Ad：Actinidia deliciosa；Gm：Glycine max；Vv：Vitis vinifera；
Bj：Brassica juncea. The GenBank numbers of BrSVP，BoSVP，AtSVP，GmSVP，VvSVP，AdSVP，AtFLC，AtAP1，BoAP1，
BrCAL and AtCAL are ABI96182，CAD48304，NP_179840，NP_001240951，XP_002269295，AFA37965，
NP_196576，Z16424，U67451，AY514048 and G26310，respectively.
K domains were single underlined. The conserved amino
acids were double underlined.
4 期 汤青林等：芥菜开花负调因子 SVP 及 FLC 同源互作域筛选和作用强度分析 683

3 讨论
本研究中利用酵母双杂交发现 pGBKT7SVP 与 pGADT7SVP、pGBKT7FLC 与 pGADT7FLC 能
够聚合，从而证明芥菜开花负调因子 SVP 及 FLC 全长蛋白均能够自身聚合，形成同源二聚体（表 2）。
同时通过构建的截短体 SVP1 ~ 5、FLC1 ~ 5 筛选 SVP、FLC 同源互作域。截短体 SVP2 ~ 5 与 SVP、
FLC2 ~ 5 与 FLC 能融合，均能在 QDO/X-α-Gal/ AbA（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA）固体
培养基上生长，且为蓝色，激活了酵母的 4 个报告基因 AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1（图 2）。SVP2
或 FLC2（缺少 C 域）能与 SVP（或 FLC）相互作用暗示这一同源二聚化并不由 C 域决定；SVP4
或 FLC4（缺少 M 域）能与 SVP 蛋白（或 FLC）互作暗示这一同源二聚化也不由 M 域决定；SVP5
或 FLC5（缺少 M 域和 I 域）能与 SVP（或 FLC）互作暗示 I 域同样不会决定这一相互作用，SVP1
或 FLC1（只含有 M 域和 I 域）不能与 SVP（或 FLC）互作也证实 M 域和 I 域确实不能决定这一同
源二聚化。因此，无论 M 域、I 域还是 C 域，都不能介导 SVP（或 FLC）自身聚合，很可能是 K
域介导了 SVP 同源二聚化。而 SVP3 或 FLC3（只含有 K 域）与 SVP（或 FLC）相互作用证实了这
一结论，即 K 域可决定并能独立介导了 SVP 或 FLC 自身聚合。
本研究中通过测定 β–半乳糖苷酶活性分析了 SVP 蛋白自身聚合强度，从而发现：尽管 M 域、
I 域或 C 域单独均不能引发 SVP 自身聚合，但却能对这一蛋白互作起到调节作用。推测 MI 域可以
增强这一作用，而 C 域有可能会削弱该作用（表 3）。同时，FLC 自身聚合强度分析发现：K 域是
FLC 蛋白自身聚合必须的，C 域不会增强这一作用，但 I 域会增强 FLC 自身聚合（表 4）。已有研究
发现芥菜 SVP 能与 FLC 相互作用形成异源二聚体 FLC · SVP（汤青林 等，2011，2012a），而本试
验证实了 SVP 能够自身聚合形成同源二聚体（SVP）2，FLC 也可形成蛋白同源二聚体（FLC）2。
由此推测：芥菜开花负调因子 SVP 与 FLC 分子作用模型为同源异源四聚体（FLC）2（SVP）2，但
仍需进行芥菜植株体内蛋白相互作用验证。
本试验得到 K 域是 SVP 或 FLC 同源二聚化的关键结构域。它包含具有两亲媒性的 α 螺旋，具
有 3 个七价重复原子（abcdefg）n，疏水氨基酸主要位于 a 和 d 的位置。含有七价重复区域的子域分
别为 K1、K2 和 K3（Fan et al.，1997；Yang et al.，2003）。但在 K 域的亚域（K1、K2、K3）上有
较小的不同，同源比对发现 K1、K2 和 K3 亚域的保守性存在差异，而且有亮氨酸拉链存在。这可
能暗示，K1、K2 和 K3 亚域对 SVP、FLC 蛋白自身聚合的贡献并非相等。在模式植物拟南芥中，
通过凝胶阻滞和酵母双杂实验也证实了 MIKC 型蛋白 K 域的亚域对蛋白互作的贡献存在差异（Yang
et al.，2003）。此外，既然亮氨酸拉链能使具有 α 螺旋的蛋白相互靠近，促使蛋白相互作用，那么在
SVP 及 FLC 蛋白同源二聚化中，K 域中的这些亮氨酸拉链是否也行使了这样的功能，有待进一步研
究。另外，在 SVP 及 FLC 蛋白 K 域的 K1 与 K2 之间，以及 K2、K3 内部，存在高度保守的多个疏
水氨基酸位点（图 3）。在小麦和拟南芥中利用反向酵母双杂交已表明，K 域调节 MIKC 型蛋白的异
源互作主要通过疏水残基和控制残基起作用（Moon et al.，1999；Yang et al.，2003）。那么介导 SVP
及 FLC 蛋白同源二聚化是否会依靠 K 域这些保守的疏水氨基酸位点以及其他控制性氨基酸残基，
还有待进一步研究。

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