全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（10）：2001–2011 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–06–16；修回日期：2014–08–18
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203047）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qscnj@njau.edu.cn）
‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因 DkADH1 的克
隆及表达分析
陈小云，张仕杰，屠煦童，李宁宁，章 镇，渠慎春*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：以‘南通小方柿’果实为材料，采用同源克隆的方法，获得了柿乙醇脱氢酶基因 DkADH1，
其全长为 1 377 bp，开放阅读框为 1 137 个核苷酸，编码 379 个氨基酸，具有 ADH 基因典型的结构域和
功能域，与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性较近。以‘南通小方柿’不同组织为材料，采用 qRT-PCR 方
法对 DkADH1 及单宁生物合成途径中的相关基因的表达进行分析，同时测定了不同时期果实的单宁含量，
结果表明在果实发育过程中，可溶性单宁含量逐渐降低，而不溶性单宁含量不断升高；DkADH1 基因在
茎、叶、花、果实等器官中均有表达，在果皮中表达量最高。随着果实的成熟，DkADH1 表达量总体呈
上升趋势。柿果实中单宁合成途径中的相关基因 DkF3′5′H 和 DkMYB4 随着乙醇处理果实时间的延长表达
量呈下降趋势，推测‘南通小方柿’DkADH1 能够抑制单宁合成相关基因的表达，从而降低果实可溶性
单宁含量。
关键词：柿；DkADH1；克隆；基因表达
中图分类号：S 665.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2001-11

Isolation and Expression Analysis of DkADH1 Gene from‘Nantong
Xiaofangshi’Persimmon
CHEN Xiao-yun，ZHANG Shi-jie，TU Xu-tong，LI Ning-ning，ZHANG Zhen，and QU Shen-chun*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：An alcohol dehydrogenase 1（ADH1）gene named DkADH1 was cloned from‘Nantong
Xiaofangshi’persimmon fruit using homology gene clone method. The results showed that the full-length
of DkADH1 gene was 1 377 bp and the open reading frame（ORF）of DkADH1 was 1 137 nucleotides
which encoded 379 amino acids. It has structure domain and function domain of the typical ADH gene.
The phylogenetic tree analysis of the evolutionary relationship of ADH between different species indicated
that DkADH1 was gathered dicotyledonous plants，which closed to Solanum lycopersicum and Malus ×
domestica. qRT-PCR was used to analyze the expression patterns of DkADH1 gene and tannin biosynthesis
related genes in fruits and various tissues at different developmental stages. The tannin content at different
period was also measured which suggested that soluble tannin was gradually decline，but insoluble tannin
was gradually rising in the fruit development. DkADH1 expressed in different tissue including stem，

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leaf，fruit and other organs. It had the highest expression level in peel. The expression was upregulated
during the ripening stage of the fruit. Tannin biosynthesis pathway related genes DkF3′5′H and DkMYB4
expression were downregulated in fruits during the ethanol treated，we speculated that DkADH1 could
inhibit the expression of tannin biosynthesis pathway genes to reduce the fruit soluble tannin content.
Key words：persimmon；DkADH1；clone；gene expression

柿（Diospyros kaki）原产于中国，但传统产区大多数为涩柿，甜柿分布较少。根据果实能否自
然脱涩与种子有无及其数量、褐斑形成的关系，柿品种被分为完全甜柿（PCNA）、不完全甜柿
（PVNA）、不完全涩柿（PVA）和完全涩柿（PCA）等 4 类（Kajiura，1964）。涩柿具有丰产、抗
性强、品质优、耐贮运、果实个大等特点，是世界栽培面积最大的柿类型。‘南通小方柿’（当地俗
称小方柿）为江苏省南通市的地方品种，具有树体矮小、早果性好、丰产稳产、无核、质优等特点，
是宝贵的矮生型、易脱涩的种质资源，部分果实在树上即可以自然脱涩，一般成熟果实采后自然放
置 7 d 左右就可以脱涩（蒋德新 等，1992）。
可溶性单宁是柿果实呈现涩感的主要原因，涩柿果实中可溶性单宁含量高，必须通过脱涩处理
后才可以食用，目前采用较多的是二氧化碳和乙醇脱涩方法（Yonemori，1997）。Matsuo 和 Itoo（1982）
的研究表明，乙醛可直接与涩柿中的可溶性单宁发生缩合反应，使柿果脱涩（Taira et al.，1992），
脱涩的难易程度与乙醛形成的能力直接相关。乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenas，ADH）是催化乙
醇形成乙醛的关键酶之一（Yamada et al.，2002），可以催化可溶性单宁与乙醛聚合，进而达到柿果
脱涩的效果（Pesis & Ben-Aire，1984；Matsuo et al.，1991；Taira et al.，1997）。据报道，ADH 在植
物中存在两个同工酶，即 ADH1 和 ADH2。在玉米、马铃薯、水稻和葡萄等植物中都已经成功地克
隆出了编码 ADH 两个同工酶的基因，但是在百脉根和拟南芥中只克隆出 ADH1 基因。ADH 是无氧
条件下乙醇代谢的关键酶之一，目前研究较多集中在有关 ADH1 在厌氧条件下的调控机理，对 ADH1
启动子序列及有关转录调控因子与厌氧响应元件（ARE）结合的机制也有较详细的阐明。ARE 含有
低氧诱导序列，如果将其连接到另一基因上，该基因同样会受低氧胁迫的诱导（Dennis et a1，2000）。
Dolferus 等（1994）研究证明，拟南芥 ADH1 启动子序列上的 GT 和 GC 结构是其厌氧诱导表达的
关键。一些其它厌氧应答基因也存在相似的结构。从拟南芥中得到的启动子片段，可以在干旱、冷
害和低氧胁迫下调节 ADH1 基因的表达。
单宁生物合成是由 4 个代谢途径构成的一个复合途径，分别为公共苯丙烷途径、核心类黄酮—
花青素途径、PA 特异途径、莽草酸途径（Dixon，2005；Lepiniec et al.，2006；Akagi et al.，2009）。
单宁生物合成由结构基因和调节基因共同作用，PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、F3′H、
F3′5′H、LAR 和 ANR 在不完全甜柿整个果实发育时期都能检测到表达活性，表达水平随果实发育逐
渐降低（Ikegami et al.，2005）。Akagi 等（2009）对柿单宁合成途径的类黄酮途径和莽草酸途径的
研究获得了较大进展，通过对 F35H 相对表达水平分析确定 F35H 在单宁合成上起着重要的作用。
Akagi 等（2009）分离到柿 MYB 转录因子基因家族 5 个成员，并发现日本甜柿中 DkMyb4 的下调表
达与类黄酮代谢途径结构基因 DkF35H 和 DkANR 的表达一致，在猕猴桃和柿愈伤组织中异位表达
DkMyb4 引起单宁累积。
本研究中以‘南通小方柿’果实为材料，克隆了果实脱涩相关基因 ADH1，通过生物信息学、
组织表达分析和乙醇诱导脱涩研究，初步分析了该基因的表达特性和功能，旨在探索‘南通小方柿’
容易自然脱涩的分子机理，为进一步研究柿脱涩机理提供参考依据，同时也为该基因的应用提供理
论基础。
10 期 陈小云等：‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因 DkADH1 的克隆及表达分析 2003

1 材料与方法
1.1 材料
‘南通小方柿’采自江苏省南通市海安县。
果实分别于 2013 年 6 月 12 日、7 月 12 日、8 月 12 日、9 月 12 日、10 月 12 日采收，去皮并将
果肉切碎，立即放入液氮后速冻并于–70 ℃保存备用。
分别采集不同发育时期的茎、叶片、花、叶柄、枝皮、果皮、果肉等组织材料，采后立即放入
液氮速冻并于–70 ℃保存备用。
9 月 12 日采收的果实用 30%乙醇分别处理 1、2、3 和 4 d，处理后立即用液氮速冻并于–70 ℃
保存备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5和 pYH4215 载体均由南京农业大学果树生物技术实验
室保存。反转录酶购自 ToYoBo 公司，rTaq 酶、pMD19-T 载体、dNTP 和 DNA marker 购自 TaKaRa
公司，凝胶回收试剂盒购于 Genscript 公司。
1.2 DkADH1的克隆
果实的 RNA 提取采用 CTAB 法（蔡斌华 等，2008），并按照 ToYoBo 公司反转录酶使用方法
合成 cDNA。
根据 GenBank 中柿 ADH1（登录号 JF357957）基因序列设计上游引物 DkADH1 F：ACCCCACGC
AAACCAACTGCG；下游引物 DkADH1 R：CAGTTTGCAGACGATGCAACTCCA。以 cDNA 为模
板，进行 PCR 扩增，其反应体系为 25 µL：模板 cDNA 1 µL、上下游引物各 1 µL、10× PCR buffer 2.5
µL、dNTP 2.0 µL、MgCl2 1.5 µL、Taq 酶 0.15 µL、ddH2O 为 15.85 µL。扩增程序为：94 ℃预变性 4
min；94 30 s℃ 、61 30 s℃ 、72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。
回收目的片段后与 pMD19-T 载体连接，将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，经蓝白斑筛选，菌液
PCR 鉴定阳性克隆后进行测序。以 R11466 为接头引物反转录得到 cDNA，根据所测定的基因片段，
分别设计两条基因特异性引物，3-RW：5-ATGCACCGGAAACGTCGAT-3和 3-RN：5-GGCCGTTTT
CAAGACACACC-3，分别与 3端接头引物通过 RACE 方法扩增目的基因的未知 3端序列，将第 2
轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将得到的片段回收、连接、转化，进行测序。
1.3 ADH1生物信息学分析
将测序得到的核苷酸和推导的氨基酸序列分别在 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast）
上进行同源性分析。
用 http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/orfig.cgi 查找开放阅读框。
采用软件 ClustalX 1.83 对基因序列进行多重比对后，使用 MEGA5.05 对分子系统进化树进行构
建，完成进化树绘制。
蛋白质的结构域分析利用 SMART 在线工具完成。
1.4 柿单宁含量测定
根据 Oshida 等（1996）报道的方法测定柿果实可溶性单宁和不溶性单宁的含量。
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1.5 荧光定量 PCR表达分析
采用荧光定量 PCR 对‘南通小方柿’DkADH1 基因和单宁合成相关基因进行表达模式的分析，
每个基因每个处理重复 3 次。反应体系为 20 µL，扩增程序为 95 180 s℃ ；然后 95 20 s℃ ，60 15 ℃
s，72 43 s℃ ，40 个循环。
数据分析采用 7300 system 软件和 2-∆∆Ct 法。
2 结果与分析
2.1 DkADH1的克隆及序列分析
以‘南通小方柿’果肉 cDNA 为材料，克隆出了一条长为 1 275 bp 的目的片段序列（图 1），经
过 3RACE 两轮扩增，得到 163 bp 片段，利用 DNAMAN 6.0 软件将测序结果与已知序列进行拼接，
获得了全长序列（1 377 bp），经序列分析，其编码区长度为 1 137 bp，编码 379 个氨基酸，具有完
整的 ORF 阅读框，将其命名为 DkADH1。

图 1 ‘南通小方柿’DkADH1的 PCR扩增
M：DL2000 marker；A：DkADH1 cDNA 保守片段的扩增；B：DkADH1 cDNA 的 3端第 1 轮扩增；
C：DkADH1 cDNA 的 3端第 2 轮扩增。
Fig. 1 Amplified of DkADH1 by PCR from‘Nantong Xiaofangshi’persimmon
M：DL2000 marker；A：The conserved sequenses of DkADH1 amplified by PCR；
B：3RACE primary amplification of DkADH1；C：3RACE secondary
amplification of DkADH1.

2.2 DkADH1编码氨基酸的同源性比对分析
利用 ClustalX 1.83 对获得的‘南通小方柿’DkADH1 与其它物种上克隆的 ADH 基因编码的氨
基酸序列进行比对，DkADH1 与番茄（Solanum lycopersicum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、新
疆梨（Pyrus sinkiangensis）、葡萄（Vitis vinifera）和玉米（Zea mays）等的同源性分别达到 88%、
87%、86%、86%和 84%（图 2），这表明所克隆的 DkADH1 与其他物种中的 ADH 基因有很高的同
源性。
从 MEGA5.05 构建的系统进化树（图 3）可以看到：南通小方柿、苹果、新疆梨、番茄等双
子叶植物聚为一类，而水稻和玉米等单子叶植物的 ADH 聚为一类，从进化的角度上讲，单、双子
叶植物各分成一支，这也表明在 ADH 基因的亲缘关系上，可以按照单子叶植物和双子叶植物的进
化关系进行划分。

10 期 陈小云等：‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因 DkADH1 的克隆及表达分析 2005

图 2 ‘南通小方柿’DkADH1编码区氨基酸序列与其他植物 ADH编码氨基酸序列的比对
Sl：番茄；St：马铃薯；Sm：丹参；Ps：新疆梨；Dl：龙眼；
Vv：葡萄；Zm：玉米；Os：水稻。
Fig. 2 Alignment of the amino acid sequence of DkADH1 and ADH amino acid sequences of other plants
Sl：Solanum lycopersicum；St：Solanum tuberosum；Sm：Salvia miltiorrhiza；
Ps：Pyrus sinkiangensis；Dl：Dimocarpus longan；Vv：Vitis vinifera；
Zm：Zea mays；Os：Oryza sativa Indica Group.


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图 3 DkADH1编码氨基酸序列与其它植物 ADH编码氨基酸序列进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of DkADH1 and ADH from other plants

2.3 DkADH1二级结构的预测与分析
蛋白质二级结构预测不仅是联系其一级结构和三级空间的桥梁和纽带，而且也是从一级结构预
测其三级空间结构的关键步骤（王志新，1988）。利用 SMART 软件分析 DkADH1 蛋白的结构域，
结果显示 DkADH1 的一个结构域为 ADH_N，序列从位于 35 位氨基酸残基开始，到 164 位氨基酸
残基为止，含有 GroES 结构域，它是酶促反应的结合位点；另一个结构域为 ADH_zinc_N，从 206
位氨基酸残基开始到 341 位氨基酸残基为止，含有 Rossmann 折叠 NAD（P）（+）结合蛋白，它是
与 Zn 结合的脱氢酶位点，这些结构域具有乙醇脱氢酶结构域的特征。
2.4 DkADH1在不同组织中的表达
为了解 DkADH1 在‘南通小方柿’不同组织器官中的时空表达特性，本研究中以不同组织在不
同发育阶段的 cDNA 为模板，利用荧光定量 qRT-PCR 技术对基因的表达情况进行分析研究，其中内
参基因为柿 Actin（GenBank 登录号 AB219402），上游引物为：5-GCCATCATTAATTGGAA
TGGAAGC-3；下游引物为：5-GTGCCACAACCTTGATCTTCA-3。从（图 4 可以看出，‘南通小
方柿’DkADH1 在植株茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，在叶片、果皮、果肉中的表达较多，尤
其在果皮中的表达量最高。


图 4 DkADH1在不同组织中的表达
Fig. 4 DkADH1 gene expression in different tissues
10 期 陈小云等：‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因 DkADH1 的克隆及表达分析 2007

2.5 不同发育时期果实单宁含量和 DkADH1表达量的变化
从图 5 可以看出，在不同时期，在果实发育初期（7 月 12 日）可溶性单宁含量最高，而后随着
果实的发育成熟开始下降，到 10 月 12 日果实成熟时减少到最低值，只有 2.294 mg · g-1。在果实生
长发育初期果实中不溶性单宁含量较低，为 0.535 mg · g-1，到果实成熟时达到最高，为 1.826 mg · g-1。
总体上，在‘南通小方柿’果实发育过程中可溶性单宁向不溶性单宁转化。

图 5 ‘南通小方柿’不同发育时期单宁含量的变化
Fig. 5 Changes of tannin content of different developmental stages in‘Nantong Xiaofangshi’persimmon

DkADH1 在不同生长发育时期果实的表达量也有所差异（图 6），随着果实的生长发育，其表达
量呈逐渐增加的趋势。6 月 12 日后该基因的表达量开始逐渐增加，到 8 月表达量略有下降，但是很
快又急剧上升，在果实发育后期其表达成直线上升，在果实成熟期（10 月 12 日）表达量最高，推
测 DkADH1 在果实成熟脱涩阶段具有重要作用，该基因在果实中的表达一方面促进可溶性单宁转化
成不溶性单宁，另一方面可能也在一定程度上抑制了单宁的合成。

图 6 果实发育不同时期 DkADH1的表达分析
Fig. 6 Expression analysis of DkADH1 gene in different periods of fruit development

2.6 乙醇处理的果实中单宁含量和相关基因的表达
如图 7 所示，与对照相比，乙醇处理果实可溶性单宁含量下降较快，不溶性单宁含量上升较快，
处理 3 d 时可溶性单宁含量为 0.369 mg · g-1，下降到涩味阈值（低于 1.0 mg · g-1）。在整个处理中，
可溶性单宁含量降低与不溶性单宁含量增加变化趋势刚好相反，说明‘南通小方柿’果实在乙醇处
理条件下可溶性单宁向不溶性单宁转化。
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图 7 乙醇处理后果实单宁含量的变化
Fig. 7 Changes in tannin content after treatment with alcohol in fruits of‘Nantong Xiaofangshi’persimmon

如图 8 所示，相对于对照，乙醇处理后的 DkADH1 表达均有明显的增加，随着处理时间的增加
其表达量也相应升高，虽然对照中的 DkADH1 表达量也升高了，但是乙醇处理升高的速度较对照速
度快，乙醇处理 3 d 后其表达量迅速升高。

图 8 乙醇处理对 DkADH1表达的影响
Fig. 8 Effect of DkADH1 gene expression with alcohol treatment


为进一步研究乙醇处理影响单宁合成的分子机理，分析了参与单宁合成途径相关基因 DkF35
和 HDkMYB4 的表达情况。与对照相比，乙醇处理的果实中 DkF35H 和 DkMYB4 的表达量降低较快，
表达趋势大致相同（图 9），推测乙醇处理是通过抑制单宁合成途径相关基因的表达，从而抑制单宁
合成的。
10 期 陈小云等：‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因 DkADH1 的克隆及表达分析 2009

图 9 乙醇处理对柿 DkF35H和 DkMYB4表达的影响
Fig. 9 Effects of DkF35H and DkMYB4 expression with alcohol treatment
3 讨论
ADH 广泛分布于各种植物器官组织中，并起着重要作用。它不仅与果实风味和芳香物质的合成
以及种子的发育等相关（Bellincontro et al.，2005），而且在果实采后成熟过程中也有着重要作用。
Shiesh 和 Lin（2000）研究发现柿果在脱涩之后 ADH 的活性有所增加，有研究认为在果实发育过程
中 ADH 基因的转录主要在成熟的果实中进行（Sarni-Manchado et al.，1997）。Torregrosa 等（2008）
报道 DkADH1 在转基因葡萄中超表达，能够降低果肉中多酚的含量和多酚聚合度，推测可能是受
ADH 活性增加的影响。
本研究中从‘南通小方柿’果实中克隆了 DkADH1 基因全长序列，并进行了生物信息学分析。
在分析保守结构和二级结构方面发现‘南通小方柿’DkADH1 与其他物种的 ADH 结构域是相当保
守的。但是在 ADH 典型的结构中，DkADH1 的 ADH_N 结构域位于第 35 ~ 164 位氨基酸的位置上，
在第 206 ~ 341 位有一个 Zn 结合的脱氢酶位点；而拟南芥 ADH1（登录号 NP_177837.1）ADH_N 结
构域则在第 35 ~ 163 位的位置，ADH_zinc_N 结构域在第 215 ~ 336 位氨基酸的位置上。因此，‘南
通小方柿’DkADH1 与其它物种在 ADH 结构域的氨基酸残基位置方面来说是具有一定的差异性。
由此推测柿在漫长进化过程中演化出了一段不同于其他物种 ADH 的特异序列。
ADH 在柿果脱涩过程中具有重要作用。有研究认为不完全甜柿、不完全涩柿和完全涩柿类型果
实脱涩与乙醛或乙醇有关，且不完全涩柿和完全涩柿果实产生极少量乙醇脱氢酶，因此需要采后人
工处理来诱导其产生（Sugiura，1983）。植物细胞中均存在两套 ADH 基因，一套为组成型 ADH2，
另一套为厌氧诱导表达型 ADH1（Xie & Wu，1989）。王燕（2010）报道柿 ADH1 基因为厌氧诱导型
表达。从本试验中‘南通小方柿’DkADH1 在不同组织和不同发育时期果实中表达差异分析来看，
2010 园 艺 学 报 41 卷
它能在茎、叶、花和果中均有表达，但表达量不同，这与 ADH 基因具有组织和发育特异性表达的
报道（Ingersoll et al.，1994；Tadege & Kuhlemeier，1997）相一致。
在果实发育时期，‘南通小方柿’DkADH1 的表达模式不同于完全甜柿‘罗田甜柿’（宿福园，
2012），完全甜柿在 8 月 DkADH1 表达量最高，随后表达量下降，即使到果实发育后期，即脱涩主
要时期仍然下降。‘南通小方柿’的 DkADH1 表达量到 9 月后期呈直线上升趋势，其可溶性单宁含
量逐渐下降，推测‘南通小方柿’易脱涩的特性也许与其果实发育后期 DkADH1 表达量升高有关。
用 CO2 或乙醇对不同柿品种果实进行脱涩处理，脱涩效率与脱涩前果实可溶性单宁含量无关，
而与 ADH 活性相关（Yamada et al.，2002）。用乙醇处理‘南通小方柿’果实，发现可以促进可溶
性单宁向不溶性单宁转化，并且在此过程中，DkADH1 表达量也随着处理时间的延长有所增加。乙
醇处理‘罗田甜柿’和‘小果甜柿’，ADH1 在种子部位能够高效表达（王燕，2010）。本研究中‘南
通小方柿’经过乙醇处理 DkADH1 基因表达量也能升高，虽然‘南通小方柿’果实内没有种子，但
是用乙醇处理也能使其脱涩，其脱涩的原理与‘罗田甜柿’和‘小果甜柿’是否相同，需要进一步
研究。用乙醇处理‘南通小方柿’果实，发现单宁合成途径相关基因 DkMYB4 和 DkF35H 的表达
量均有所下降，推测由于 DkADH1 表达量的增加，抑制了单宁合成相关基因的表达，从而减少了单
宁的合成。

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