全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（3）：581–587 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–10–25；修回日期：2011–12–26
基金项目：国家大学生创新性试验项目（081062613）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：htang@sicau.edu.cn）
观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析
林 玲，汤浩茹*，陈 清，鲁 敏，贾慧峰，李英改，张晓楠
（四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014）
摘 要：以观赏桃品种‘红雨垂枝’为试材，采用 SON-PCR 方法从叶片中快速获得了查尔酮合成酶
基因全长序列，命名为 PphCHS，GenBank 登录号为 JN391444，其长度为 2 353 bp，具有一个 1 140 bp 的
完整开放阅读框（ORF），编码 379 个氨基酸。氨基酸同源性分析表明，PphCHS 与已报道的其他植物的
CHS 推导的氨基酸序列具有高达 90%以上的相似性；氨基酸聚类分析表明：观赏桃首先与樱桃李聚类，
其次与草莓。生物信息学分析表明：PphCHS 蛋白含有查尔酮合酶家族的特征多肽序列 RLMMYQQG
CFAGGTVLR，不含信号肽序列。
关键词：观赏桃；查尔酮合成酶基因；SON-PCR；克隆
中图分类号：S 686；S662.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）03-0581-07

Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Synthase Gene in Ornamental
Peach
LIN Ling，TANG Hao-ru*，CHEN Qing，LU Min，JIA Hui-feng，LI Ying-gai，and ZHANG Xiao-nan
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China）
Abstract：The Chalcone Synthase（CHS）coding sequence（CDS）was cloned from the ornamental
peach‘Hongyu Chuizhi’by using SON-PCR techiniques. It was designated as PphCHS，and the GenBank
accession number was JN391444. The full CDS was 2 353 bp in length with an open reading frame（ORF）
of 1 140 bp，encoding a protein of 379 amino acids. Homology analysis of the deduced amino acids
indicated that the sequences had more than 90% similarity with those of other reported plants. Amino acids
cluster analysis showed that CHS from Prunus cerasifera was clustered together with PphCHS firstly，
followed by that from strawberry. Bioinformatic analysis results indicated that the PphCHS amino acids
had no signal peptide sequences，but possessed the CHS family’s characteristic sequences，RLMMYQQG
CFAGGTVLR.
Key words：ornamental peach；chalcone synthase gene；SON-PCR；clone

培育具有新奇花色的花卉新品种一直是观赏植物育种者研究的热门和重点（Mol et al.，1999）。
查尔酮合成酶（Chalcone Synthase，CHS）可以在花中特异性表达，其表达量的改变可能导致植物
花色的变异（Elomma et al.，1993；韩颖颖 等，2004；宋婷婷 等，2010）。
观赏桃在长期的栽培选育中已经形成了红、粉、白、紫和复色等几大色系，而在叶色方面也有

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表 1 观赏桃 PphCHS 侧翼序列克隆所用引物
Table 1 The PphCHS cloning primers in this test
引物名称
Primer names
编号
Code
序列（5′–3′）
Sequences（5′–3′）
F1 TCA AGG TGG GTG TCA CTG GGC
F2 ATA GTC AGC CCC AGG CAT GTC
F3 GGA ATT TCA ACA ACC ACC ACG
F4 TCA CAC ATA GTT GGC GGG AGA
5′嵌套引物
5′ Nested
primers
F5 GGA CAC TCA GAT GGA CAA CCT
3′嵌套引物 T1 AAC CAT CCT TCC CGA CAG CGA
3′ Nested
primers
T2 CAC AAG ACA CAT ACT ATC GGA

常绿，紫红和嫩叶红等之分（王燕 等，2008；王力荣 等，2011a，2011b；朱更瑞 等，2011）。桃
花作为古老而又普遍的观赏花卉，实际生产生活中其花色品种仍然比较单一，作者期望利用转基因
共抑制的特点，将查耳酮合成酶反义转到花卉中，提高花卉的观赏价值和经济价值。
本研究中采用一种新兴的、简便易行的 SON-PCR 方法（Antal et al.，2004），克隆并分析观赏
桃查尔酮合成酶基因（CHS），为进一步研究 CHS 的功能及其调控奠定分子基础，为丰富观赏桃花
色、叶色种质资源和培育具有高观赏价值的新品种提供可能，同时也进一步证明 SON-PCR 方法的
实用性和简便性。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为观赏桃（Prunus persica）品种‘红雨垂枝’，2008 年从中国农业科学院郑州果树研究所
引进，保存于四川农业大学教学科研园区。于 2010 年 3 月初晴天上午采集幼嫩的叶片，清洁处理后
置–20 ℃保存备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）JM109 由本实验室保存。pMD19-T vector 和 T4 DNA 连接酶购自宝
生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 PphCHS 片段的获得
观赏桃基因组 DNA 的提取采用 CTAB 法（李玲，2007）。
根据已报道的 CHS 基因保守核苷酸序列设计合成一对简并引物 CHSF 和 CHSR。CHSF：5′-CCK
TCH YTG GAY GCN MGR CAR GAC-3′；CHSR：5′-GGB CCR AAN CCR AAN ARM ACA CC-3′。
其中 R = A/G，N = A/C/G/T/U，M = A/C，Y = C/T，K = G/T，H = A/C/T。
PCR 扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，35 个
循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
1.3 SON-PCR 法扩增 PphCHS 侧翼序列
根据扩增得到的基因片段设计并合成了 5
条 5′嵌套引物和两条 3′嵌套引物（表 1）。
PCR 扩增条件：50 µL 反应体系。第 1 轮
PCR 中以观赏桃基因组 DNA 50 ng 作为模板，
第 2 轮 PCR 模板为 1/50 第 1 轮 PCR 产物，第
3 轮 PCR 模板为 1/10 第 2 轮 PCR 产物。第 1
轮 PCR 扩增条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃
变性 30 s，57 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2.5 min，
5 个循环；然后进入 1 个错配产生双链扩增阶
段：94 ℃变性 30 s，29 ℃ 3 min，以 0.3 ℃ · s-1
升至 72 ℃，72 ℃ 1 min，经过 1 个循环后进
入下一个新的循环：94 ℃变性 10 s，57 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2.5 min，60 个循环；最后 72 ℃延
伸 7 min。第 2、3 轮 PCR 扩增反应：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃
延伸 2.5 min，30 个循环；最后 72 ℃延伸 7 min。
3 期 林 玲等：观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析 583

图 1 观赏桃 CHS 的 PCR 扩增
M：分子量标准；1：PCR 产物。
Fig. 1 PCR product of CHS in ornamental peach
M：The molecular weight standard；
1：PCR product.
1.4 目的片段的克隆
PCR 扩增的目的产物经 DNA 胶回收试剂盒进行回收，并将回收产物连接到载体 pMD19-T，再
将连接产物转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞，后涂布于含 IPTG、X-gal、Amp 的 LB 固体培养基上
培养过夜后进行蓝白斑筛选。随机挑选 10 个白色的单菌落接种到含 Amp 的 LB 液体培养基里震荡
培养。然后用碱裂解法提取质粒鉴定，将筛选的阳性克隆送上海生物技术有限公司测序。测序结果
在 GenBank 中进行 BLAST 搜索，确定为同源序列后，应用 DNAMAN、DNAstar、Mega5.0、Contig1
和 Signal P3.0 等软件进行拼接，分析和预测。得到全长后，从起始密码子设计一对包含 ATG 的上
游引物和包含有 TGA 的下游引物，用 1.2 节的方法进行 PCR，回收特异条带，测序分析，确保克隆
出的是正确的基因序列。
2 结果与分析
2.1 PphCHS 片段的 PCR 扩增
以‘红雨垂枝’基因组 DNA 为模板，用
简并引物CHSF和CHSR进行 PCR扩增得到一
条约为 800 bp 的条带（图 1），测序结果与预期
目标片段相符，选择 NCBI nr 数据库进行
BLASTp 比对，确定其是 CHS 同源序列。
2.2 PphCHS 5′端的扩增
根据扩增片段设计引物 F1、F2、F4 进行 5′
端的扩增，经过 3 轮巢式 PCR 扩增得到 1 条约
为 300 bp 的 DNA 片段（图 2，A），测序结果
得到片段长度为 264 bp，经 BLASTn 比对后确
定其是 CHS 基因的 5′端序列的一部分。

图 2 CHS 5′端的 SON-PCR 产物
A：第 1 次 SON-PCR[1：第 1 轮 PCR（引物 F1）；2：第 2 轮 PCR（引物 F2）；3：第 3 轮 PCR（引物 F4）]。
B：第 2 次 SON-PCR[1：第 1 轮 PCR（引物 F3）；2：第 2 轮 PCR（引物 F5）]。M：分子量标准。
Fig. 2 SON-PCR product of 5′ end of CHS
A：The first SON-PCR [1：Primary PCR（Primer F1）；2：Secondary PCR（Primer F2）；3：Tertiary PCR（Primer F4）].
B：The second SON-PCR [1：Primary PCR（Primer F3）；2：Secondary PCR（Primer F5）].
M：The molecular weight standard.

584 园 艺 学 报 39 卷
图 3 CHS 3′端的 SON-PCR 产物
M：分子量标准；1：第 1 轮产物（引物 T1）；
2：第 2 轮产物（引物 T2）。
Fig. 3 SON-PCR product of 3′ end of CHS
M：The molecular weight standard；1：Primary PCR（Primer T1）；
2：Secondary PCR（Primer T2）.
图 4 观赏桃 CHS 的 RT-PCR 扩增
M：分子量标准；1：PCR 产物。
Fig. 4 RT-PCR product of CHS in ornamental peach
M：The molecular weight standard；
1：PCR product.
在此基础上序列拼接，设计引物 F3 和 F5，再进行一轮 SON-PCR 扩增。结果表明第 1 轮的 PCR
结果不特异，条带较多，而第 2 轮主带特异而明亮，片段大小约为 5 00 bp（图 2，B），将所有条
带回收测序，结果显示最长正确延伸长度为 1 032 bp（图 2，B 泳道 1 箭头位置），另一条（图 2，
B 泳道 2）片段长度为 571 bp，在 NCBI 上进行比对证实为 CHS 的 5′端序列。
2.3 PphCHS 基因 3′端的扩增
根据扩增片段设计引物 T1 和 T2 进行 3′端的扩增，经两轮扩增同样得到 1 条约 600 bp 的片段（图
3）。测序结果显示片段长 666 bp，在 NCBI 上进行比对证实为 CHS 的 3′端序列。
为了保证得到的是正确的序列，用一对包含 ATG 的上游引物和包含有 TGA 的下游引物 CHSF
（5′-CGA TAT CAT GGT GAC CGT GGA GGA AGT-3′）和 CHSR（5′-CAT GTC GAC TCA ACA GTG
AGC CCA TGG TC-3′）。其中上游引物含有酶切位点 EcoRⅤ，下游引物含酶切位点 SalⅠ，以 cDNA
为模板进行 PCR，回收特异条带验证确认，正是所克隆的 CHS 基因（图 4）。电泳图如下图所示。

2.4 观赏桃 PphCHS 基因 DNA 全序列分析
将测序得到的所有片段拼接后，结果如图 5 显示。观赏桃 CHS DNA 序列全长 2 353 bp，5′端有
105 bp 的非翻译区，3′端含有 488 bp 的非翻译区。BLAST 比对发现，该 DNA 序列与 CHS 基因同源，
命名为 PphCHS，GenBank 登录号为 JN391444。
利用 DNAMAN6.0 软件分析 PphCHS 开放阅读框，长度为 1 140 bp，编码 379 个氨基酸。将从
PphCHS 推导的氨基酸序列与 GenBank 中已登录的氨基酸序列进行同源性比对，发现它和樱桃李
（ABH11545.1）、砂梨（ADP09376.1）、苹果（AAX16492.1）、草莓（BAE17124.1）等的相似性
高达 97%以上，与杜鹃（BAF96941.1）的相似性相对较低，为 94%。
用 Signal P3.0 Server 检测，结果显示 PphCHS 蛋白不含信号肽序列，属于非分泌蛋白。PphCHS
具有查尔酮合成酶所特有的高度保守的催化活性中心（Cys、His、Asn 和 Phe）。另外，PphCHS 还
具有查尔酮合酶家族的特征多肽序列：RLMMYQQGCFAGGTVLR（Ferrer et al.，1999）。
用 Clustal X 和 Mega5.0（Tamura et al.，2011）软件将获得的 PphCHS 推导的氨基酸序列与其他
几种植物 CHS 基因家族的氨基酸序列进行多重比对，并选用最大似然法（Saitou & Nei，1987）构
建进化树（图 6）。
3 期 林 玲等：观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析 585

从图 6 可以看出，观赏桃与樱桃李的氨基酸序列处于同一进化枝上，亲缘关系最近，与蔷薇科
的苹果、草莓、砂梨、蔷薇等的亲缘关系也较近，而与其他植物的亲缘关系较远。
图 5 PphCHS DNA 序列及其推导的氨基酸序列
ATG 为起始密码子；TGA 为终止密码子；单下划线为内含子；双下划线为特征序列：RLMMYQQGCFAGGTVLR。
Fig. 5 DNA sequence of PphCHS and its deduced amino acid sequence
ATG stands for the start codon；TGA stands for the stop codon；Single underline indicates the intron；Double underline indicates the characteristic
sequence RLMMYQQGCFAGGTVLR.

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图 6 9 种植物的 CHS 推导的氨基酸序列进化分析
Fig. 6 Phylogenetic analysis of CHS amino acid sequence of nine plants
3 讨论
SON-PCR 方法出现较晚，目前尚未得到广泛应用。目前，此方法仅在 Botryris cinerea 羟甲基
戊二酰 CoA 还原酶（邓洪渊 等，2006）、长鞭红景天 CHS（肖燕 等，2008）、抗禾谷孢囊线虫
基因 LRR 区（刘毅 等，2006）和枣（谢南南 等，2011）等的侧翼序列扩增方面有少量报道，在其
他物种中均未有报道。
本试验中证明 SON-PCR 技术只需要 2 ~ 3 条嵌套引物，经过 2 ~ 3 轮 PCR 即可快速成功地获得
已知片段的旁侧序列，整个过程步骤简单，所需时间短，成本也比 RACE 等技术低廉，只需设计合
适的嵌套引物即可。针对 SON-PCR 方法假阳性较高的问题，作者从 3 个方面进行了技术保证：一
是设计合适的引物，并提高退火温度，比对测序结果；二是应用邓洪渊等（2006）提出的可以使特
异性和效率大大提高的改进的 SON-PCR 方法进行了验证；三是用 RT-PCR 进行了验证，确认所克
隆的正是查尔酮合成酶基因。
本研究中通过 SON-PCR 技术成功获得了观赏桃 PphCHS 基因全长，该 DNA 序列全长 2 353 bp，
具有完整的开放阅读框，共 1 140 个碱基，编码 379 个氨基酸。证明 SON-PCR 技术是快速可行的，
为广泛应用 SON-PCR 技术快速分离克隆基因提供依据。另一方面，本研究可为进一步开展观赏桃
花色叶色的分子生物学研究和在分子水平上进行观赏桃品质改良和育种奠定了理论基础。

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